RSVF/G嵌合疫苗的制作方法

rsv f/g嵌合疫苗
1.本发明涉及呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)的疫苗。更具体地讲，本发明涉及通过使用rsv f蛋白作为基本结构，并用rsv g蛋白的保守中央结构域序列(conserved central domain sequence)的全部或一部分取代基本结构的一部分，或将保守中央结构域序列的全部或一部分添加至基本结构中而获得的重组f/g嵌合蛋白。


背景技术：

2.流行病学：rsv的感染途径为飞沫感染或接触感染，并且几乎100%的人类在两岁前感染。通常会出现类似感冒的症状，比如流鼻涕、发热38
‑
39℃和咳嗽。另一方面，原发性感染往往会发展为细支气管炎和肺炎，并且特别是6个月以下的婴儿和老年人可能会很严重。根据2015年的全球估计，有3310万5岁以下的人患有rsv感染(rsv急性下呼吸道感染)，其中320万人需要住院治疗和11.82万人死亡(非专利文献1)。治疗方法主要为支持治疗，并且吸入抗病毒剂利巴韦林(virazole (注册商标))仅在美国被批准作为治疗剂。与rsv包膜蛋白结合的抗体药物帕利珠单抗(synagis (注册商标))仅被批准作为预防剂，但给予对象仅限于高危人群(早产儿、慢性疾病、先天性心脏病等) (非专利文献7)。据说婴儿期患有rs病毒感染，特别是细支气管炎的儿童，可能在以后的生活中会患上支气管哮喘。然而，由于无法预防感染，多年来一直期待有效的疫苗开发，但世界范围内还没有批准的rsv疫苗。
3.rsv f蛋白：rsv f蛋白定位于rsv包膜表面，并且对于病毒进入宿主细胞具有重要功能。具体地讲，感染通过经rsv f蛋白融合宿主细胞膜和病毒包膜来建立。由于病毒株之间几乎没有突变，因此使用rsv f蛋白作为疫苗抗原的研究和开发已经取得进展。迄今为止，已经报道rsv f蛋白采取3种形式(促融前(prefusogenic) f /融合前f/融合后) (专利文献1、4和5)。因此，已经进行了使用每种形式的rsv f蛋白作为疫苗抗原的研究和开发，并且已经进行多个临床试验(非专利文献2)。rsv f蛋白为约60 kda，并且具有通常由从n
‑
末端依次的称为信号肽(sp)结构域、片段2 (f2)结构域、p27结构域、融合肽(fp)结构域、片段1 ( f1)结构域、跨膜(tm)结构域和胞质尾区(ct)结构域的位点组成的基本结构。
4.rsv g蛋白：rsv g蛋白定位于rsv包膜表面，并且对于病毒粘附于宿主细胞具有重要功能。具体地讲，病毒经病毒表面的rsv g蛋白粘附于宿主细胞的受体。rsv g蛋白的序列在病毒株之间变化很大，并且根据序列的差异大致分为亚组a和b。rsv a2毒株的g蛋白为约30 kda，并且由从n
‑
末端依次的称为病毒粒子内(intravirion)、跨膜区(tm)、粘蛋白样区域i、保守中央结构域(ccd)和粘蛋白样区域ii的位点组成。称为ccd的区域序列(氨基酸残基158
‑
199)在病毒株之间变化较小且高度保守，并且包含趋化因子cx3c基序。cx3c基序作为配体与细胞表面的cx3c受体1 (cx3cr1)结合，并且病毒与细胞彼此粘附，从而促进感染(非专利文献3)。然后，rsv f蛋白促进病毒包膜与细胞膜的融合以建立感染。由于rsv g蛋白与rsv f蛋白一起对于感染也很重要，因此已经进行使用rsv g蛋白作为疫苗抗原的研究和开发，
并且已经进行临床试验(专利文献3)。
5.rsv f/g嵌合蛋白：作为rsv f/g嵌合蛋白，公开了一种以n
‑
末端到c
‑
末端方向包含以下的嵌合呼吸道合胞病毒(rsv)多肽的信息：(i) 第一f蛋白多肽结构域，(ii) g蛋白的多肽结构域，和(iii) 第二f蛋白多肽(专利文献6)。嵌合抗原中所含的g蛋白为氨基酸残基183
‑
203、152
‑
229、149
‑
229、128
‑
229中的任何一者(专利文献6)。还有关于以n
‑
末端到c
‑
末端方向包含以下的嵌合rsv多肽的公开信息：(i) 其中第一f蛋白和第二f蛋白连接成不在弗林蛋白酶切割位点处切割的氨基酸序列，和(ii) g蛋白多肽的一部分(专利文献7)。嵌合抗原中所含的g蛋白为氨基酸残基183
‑
203、152
‑
229和149
‑
229中的任何一者(专利文献7)。尽管其均为rsv f/g嵌合蛋白，但利用rsv野生型f (rsv wt f)蛋白、rsv融合后f (rsv post f)蛋白和rsv pre f (rsv融合前f)蛋白进行的感染保护能力的优势和等效性的评价以及低剂量给予引起的感染增强尚未得到验证。本发明的不同之处在于嵌合抗原中所含的g蛋白仅限于ccd区。也就是说，本发明限于对功效和安全性重要的区域：氨基酸残基158
‑
199。
6.作为rsv f/g嵌合蛋白，有报道其中rsv f蛋白的氨基酸残基1
‑
526和rsv g蛋白的氨基酸残基69
‑
298以n
‑
末端到c
‑
末端方向连接的蛋白(非专利文献5)。与福尔马林灭活的rsv相比较，rsv f/g嵌合蛋白在感染保护能力评价和副作用评价方面具有优势。然而，与rsv wt f蛋白、rsv post f蛋白和rsv pre f蛋白相比较，感染保护能力的优势和等效性的评价以及低剂量给予引起的感染增强尚未得到验证(非专利文献5)。尽管已经对rsv f/g嵌合蛋白进行了基础研究，但尚未进行临床研究。本发明的不同之处在于嵌合抗原中所含的g蛋白仅限于ccd区域。也就是说，本发明限于对功效和安全性重要的区域：氨基酸残基158
‑
199。
7.抗rsv f抗体：已知rsv f蛋白特异性抗体具有中和功能。单克隆抗体各自存在于rsv f蛋白的多个表位中(非专利文献6)。对称为rsv f蛋白的位点ii的位点具有特异性的抗体之一被批准为抗体药物帕利珠单抗(synagis (注册商标))。该药物也被批准为预防剂，但给予对象仅限于高危人群(早产儿、慢性疾病、先天性心脏病等) (非专利文献7)。
8.抗rsv g抗体：rsv g蛋白特异性抗体具有与抗rsv f抗体相似的中和功能。特别是，已知多种针对rsv g蛋白的ccd的抗体(非专利文献4)。其中，已报道与帕利珠单抗不同，称为3d3的抗体在balb/c小鼠模型中具有不引起因感染引起的症状比如气道炎症的恶化的效果(专利文献2、非专利文献8、9)。另外，有报道称在balb/c小鼠的rsv感染中，称为131
‑
2g的抗体具有诱导t辅助细胞(th)2向th1转变的作用(非专利文献10)。
9.在病毒株间高度保守的rsv g蛋白的ccd序列中，存在一个特别高度保守的序列区域，即中央保守区(ccr)，其位于rsv g蛋白的氨基酸残基164
‑
176 (非专利文献11和19)。据报道作为识别ccr的单克隆抗体的3d3、131
‑
2g和2b11在balb/c小鼠模型中具有抑制肺部炎症的作用(非专利文献11)。
10.rsv感染恶化机制：福尔马林灭活的rsv疫苗试验为在1960年代进行的，但rsv原发性感染的住院率在未接种组中为2%和在接种组中为80%，并且接种组中有2名儿童死亡(非专利文献12)。作为
疫苗接种之后rsv感染引起的症状恶化的原因，已提及rsv g蛋白对th2的免疫诱导、福尔马林处理产生的羰基化蛋白对th2的免疫诱导、疫苗诱导的抗体亲合力低等(非专利文献13
‑
15)。
11.rsv g蛋白与恶化机制之间的关系：已知婴儿变得特别对于rsv感染很严重。作为原因之一，已经提及婴儿的免疫转变为其中存在许多炎性细胞的th2。另外，有报道称在患有rsv感染的人类中，当rsv 经cx3cr1 (其为rsv g蛋白的cx3c基序的受体)感染新生儿调节性b淋巴细胞(nbreg)时，产生il
‑
10并抑制th1反应(非专利文献16)。
12.低剂量给予引起的症状恶化有报道称当低剂量给予大鼠现有开发产品，即包含rsv post f蛋白的疫苗(包含th1诱导的吡喃葡萄糖基脂质佐剂稳定的乳液作为佐剂)和rsv pre f蛋白(包含th2诱导的氢氧化铝水合凝胶作为佐剂)作为抗原，并然后感染rsv时，在棉鼠模型中发生了疫苗增强的疾病比如肺泡炎(非专利文献17)。
13.[现有技术][专利文献]专利文献1：日本专利6162751专利文献2：日本专利5808536专利文献3：日本专利4310184专利文献4：wo2016144675a1专利文献5：jp 2016
‑
519658专利文献6：jp 2010
‑
522540专利文献7：jp2011
‑
528222专利文献8：日本专利4150814[非专利文献]非专利文献1：shi t等人. lancet. 2017年9月2日;390(10098):946
‑
958.非专利文献2：mazur ni等人. lancet infect dis. 2018年10月;18(10):e295
‑
e311.非专利文献3：johnson sm等人. plos pathog. 2015年12月11日;11(12):e1005318.非专利文献4：fedechkin so等人. sci immunol. 2018年3月9日;3(21). pii: eaar3534.非专利文献5：prince ga等人. j virol. 2000年11月;74(22):10287
‑
92.非专利文献6：mclellan js等人. science. 2013年5月31日;340(6136):1113
‑
7.非专利文献7：anti
‑
rs virus humanized monoclonal antibody preparation: synagis
r solution for intramuscular administration; 所附文献.非专利文献8：han j等人. am j respir cell mol biol. 2014年7月;51(1):143
‑
54.非专利文献9：http://www.trellisbio.com/pipeline/viruses.html非专利文献10：boyoglu
‑
barnum s等人. j virol. 2014年9月;88(18):10569
‑
f抗体具有感染保护能力。然而，据推测，当抗rsv f抗体的血液浓度降低时，中和能力降低，并且同时发生其中经捕获抗rsv f抗体的细胞促进感染的所谓的抗体依赖性感染增强，从而导致引起ved。
[0017]
另一方面，可预期通过给予rsv f/g嵌合蛋白抗原，除抗rsv f抗体之外还诱导抗rsv g抗体。本发明与以往报道的rsv f/g嵌合蛋白不同的特征在于嵌合抗原中所含的g蛋白限于对功效和安全性重要的ccd区域(氨基酸残基158
‑
199)。因此，通过免疫rsv f/g嵌合蛋白而诱导的抗rsv g抗体具有与抗rsv f抗体相似的感染保护能力。另外，由于rsv f/g嵌合蛋白掺入了源自g蛋白的cx3c基序附近的序列，因此免疫诱导的抗rsv g抗体与定位于病毒表面的g蛋白的 cx3c基序附近结合。结果，病毒表面g蛋白的cx3c基序被抗rsv g抗体掩蔽，并且推测与定位于宿主细胞表面的cx3cr1的结合受到抑制。因此，预期经cx3c
‑
cx3cr1抑制th1反应抑制信号。也就是说，表明通过由免疫rsv f/g嵌合蛋白抗原而诱导的抗rsv g抗体促进正常的th1反应，从而导致抑制感染增强。
[0018]
另外，当用pre f蛋白抗原和rsv f/g嵌合蛋白抗原使小鼠免疫时，对血液中诱导的抗rsv f抗体进行亚类分析。结果，与用pre f蛋白抗原免疫的小鼠相比较，在用rsv f/g嵌合蛋白抗原免疫的小鼠中具有补体结合能力的igg2a的量趋于增加。因此，可以预期与pre f蛋白抗原相比较，rsv f/g嵌合蛋白抗原通过补体系统具有更有效的感染保护作用。
[0019]
如上述机制，通过给予发明人发现的rsv f/g嵌合蛋白抗原，与仅使用rsv f蛋白作为抗原的疫苗给予相比较，可以预期提高感染保护能力的效果和/或防止感染增强的效果。
[0020]
本发明提供以下[1]
‑
[37]。
[0021]
[1] 一种呼吸道合胞病毒(rsv) f蛋白和g蛋白的嵌合蛋白(rsv f/g蛋白)，其中作为基本结构的rsv f蛋白的一部分被rsv g蛋白的ccd序列的全部或一部分替代，或者其中将rsv g的ccd序列的全部或一部分添加至基本结构中。
[0022]
[2] [1]的嵌合蛋白，其中f蛋白的氨基酸序列包含与seq id no:1的氨基酸序列具有90%或更多同源性的序列。
[0023]
[3] [1]的嵌合蛋白，其中f蛋白的氨基酸序列包含seq id no: 1的氨基酸序列。
[0024]
[4] [1]
‑
[3]中任何一项的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代或者ccd序列的全部或一部分的添加发生于f蛋白的fp结构域。
[0025]
[5] [1]
‑
[3]中任何一项的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代发生于f蛋白的fp结构域和p27结构域。
[0026]
[6] [5]的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代发生于f蛋白的137
‑
146位。
[0027]
[7] [1]
‑
[3]中任何一项的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代或者ccd序列的全部或一部分的添加发生于f蛋白的f1结构域。
[0028]
[8] [7]的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代发生于f蛋白的382
‑
393位或425
‑
436位。
[0029]
[9] [2]或[3]的嵌合蛋白，其中ccd序列的全部或一部分的添加发生于f蛋白的c
‑
末端。
[0030]
[10] [1]
‑
[9]中任何一项的嵌合蛋白，其中ccd序列的全部或一部分的氨基酸序
列包含以下的序列，其选自seq id no: 2的158
‑
199、162
‑
197、164
‑
190、164
‑
186、164
‑
176、173
‑
197、187
‑
197、173
‑
186和162
‑
171位的序列，由彼此连接的seq id no: 2的162
‑
172和187
‑
199位的序列组成的序列，由彼此连接的seq id no: 2的164
‑
172和187
‑
197位的序列组成的序列，由彼此连接的seq id no: 2的162
‑
172、187
‑
199和162
‑
172位的序列组成的序列，和由彼此连接的两个或三个seq id no: 2的162
‑
172位的序列组成的序列。
[0031]
[11] [10]的嵌合蛋白，其中氨基序列的连接使用接头进行。
[0032]
[12] [1]
‑
[11]中任何一项的嵌合蛋白，其中用ccd序列的全部或一部分进行的替代或者ccd序列的全部或一部分的添加使用接头进行。
[0033]
[13] [11]或[12]的嵌合蛋白，其中接头的氨基酸序列为ggggs (seq id no: 5)或eaaak (seq id no: 6)。
[0034]
[14] [10]
‑
[13]中任何一项的嵌合蛋白，其中ccd序列的全部或一部分的氨基酸序列与所述氨基酸序列具有75%或更多的同源性。
[0035]
[15] [10]
‑
[13]中任何一项的嵌合蛋白，其中ccd序列的全部或一部分的氨基酸序列与所述氨基酸序列具有90%或更多的同源性。
[0036]
[16] [1]
‑
[15]中任何一项的嵌合蛋白，其中糖基化位点通过氨基酸修饰引入到f蛋白中。
[0037]
[17] [16]的嵌合蛋白，其中糖基化位点引入到f蛋白的位点iv附近，即在seq id no:1的419
‑
468位。
[0038]
[18] [17]的嵌合蛋白，其中位点iv的糖基化位点位于seq id no:1的419
‑
468位中的任何位置。
[0039]
[19] [18]的嵌合蛋白，其中用于引入位点iv的糖基化位点的氨基酸修饰为以下(1)
‑
(7)中的任何一项：(1) g430t/s(2) k419n和k421t/s(3) k427n和r429t/s(4) t434n和s436t/s(5) k419n、k421t/s和g430t/s(6) k419n、k421t/s和k427n和r429t/s(7) k419n、k421t/s和t434n和s436t/s。
[0040]
[20] [16]
‑
[19]中任何一项的嵌合蛋白，其中糖基化发生于糖基化位点。
[0041]
[21] 一种rsv疫苗，其包含[1]
‑
[20]中任何一项的嵌合蛋白作为抗原。
[0042]
[22] [21]的rsv疫苗，其中疫苗具有比rsv f蛋白更低的rsv感染恶化趋势。
[0043]
[23] 一种用于提高rsv f蛋白表达水平的方法，其包括通过f蛋白的氨基酸修饰将糖基化位点引入到f蛋白中并允许发生糖基化。
[0044]
[24] [23]的方法，其中f蛋白的一部分被rsv g蛋白的ccd序列的全部或一部分替代，或者其中将ccd序列的全部或一部分添加至rsv g蛋白的ccd序列中。
[0045]
[25] [23]或[24]的方法，其中用于引入糖基化位点的氨基酸修饰为以下(1)
‑
(7)中的任何一项：(1) g430t/s
(2) k419n和k421t/s(3) k427n和r429t/s(4)t434n和s436t/s(5)k419n、k421t/s和g430t/s(6)k419n、k421t/s和k427n和r429t/s(7)k419n、k421t/s和t434n和s436t/s。
[0046]
发明效果根据本发明，可以提供具有预防rsv感染的效果的疫苗和/或能够避免疫苗接种之后rsv感染的恶化的疫苗，并且进一步提供具有预防rsv感染的效果和能够避免疫苗接种之后rsv感染的恶化的疫苗。
附图说明
[0047]
图1显示rsv f/g嵌合蛋白序列的示意图。
[0048]
图2显示作为rsv f/g嵌合蛋白的一部分的rsv g蛋白序列(编号1
‑
9)的示意图。
[0049]
图3显示作为rsv f/g嵌合蛋白的一部分的rsv g蛋白序列(编号10
‑
14)的示意图。
[0050]
图4显示作为rsv f/g嵌合蛋白的一部分的rsv g蛋白序列(编号15
‑
18)的示意图。
[0051]
图5为rsv f/g嵌合蛋白表达水平的列表。
[0052]
图6为rsv f/g嵌合蛋白表达水平的列表。
[0053]
图7显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0054]
图8显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0055]
图9显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0056]
图10显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0057]
图11显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0058]
图12显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0059]
图13显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0060]
图14显示rsv f/g嵌合蛋白的sds
‑
page的结果。
[0061]
图15显示rsv f/g嵌合蛋白的western印迹的结果。
[0062]
图16显示rsv f/g嵌合蛋白的电子显微镜图像。
[0063]
图17显示rsv f/g嵌合蛋白的elisa试验的结果。
[0064]
图18显示rsv f/g嵌合蛋白的elisa试验的结果。
[0065]
图19显示rsv f/g嵌合蛋白免疫血清的中和试验的结果。
[0066]
图20显示rsv f/g嵌合蛋白免疫血清的补体依赖性中和试验的结果。
[0067]
图21显示rsv f/g嵌合蛋白免疫血清中所含的抗rsv f蛋白抗体的亚类分析的结果。
[0068]
图22显示对通过用rsv f/g嵌合蛋白免疫诱导的抗rsv g蛋白抗体的评价。
[0069]
图23显示rsv f/g嵌合疫苗针对感染的保护试验的结果。
[0070]
图24显示rsv f/g嵌合疫苗针对感染的保护试验的结果。
[0071]
图25显示rsv f/g嵌合疫苗针对感染的保护试验的结果。
[0072]
图26显示评价rsv f/g嵌合疫苗的感染抑制率的结果。
no: 1的191位的n被s取代。此外，名称末尾的“seq11”表示seq id no: 11的g蛋白序列。
[0092]
在下文中，将详细描述本发明的优选实施方案。然而，本发明不限于以下实施方案。
[0093]
(rsv f/g嵌合疫苗)本实施方案的疫苗(rsv f/g嵌合疫苗)为使用通过使用rsv f蛋白作为基本结构，并用rsv g蛋白的ccd序列的全部或一部分取代基本结构的一部分，或者将ccd序列的全部或一部分添加至基本结构中而获得的重组rsv f/g嵌合蛋白作为抗原的制剂。在此，“添加”包括“插入”的含义，和“取代”或“添加”可为经由接头与基本结构进行的。接头的氨基酸序列的实例包括ggggs (seq id no: 5)或eaaak (seq id no: 6)。
[0094]
rsv f蛋白(基本结构)中g蛋白的取代位置或g蛋白的添加位置的实例包括f蛋白的fp结构域、f蛋白的fp结构域和p27结构域(图1中的rsv f/g
‑
a) (具体地讲f蛋白的137
‑
146位)、f蛋白的f1结构域(具体地讲f蛋白的382
‑
393位(图1中的rsv f/g
‑
b)或425
‑
436位(图1中的rsv f/g
‑
c))和f蛋白的c
‑
末端(图1中的rsv f/g
‑
d)。另外，rsv f蛋白(基本结构)中g蛋白的取代位置或g蛋白的添加位置可为在蛋白的三维结构上远离已知表位的位置，并且其实例包括rsv f/g
‑
a、rsv f/g
‑
d等。或者，其可为作为蛋白抗原的显著位置(已知表位等)，例如rsv f/g
‑
b (抗原位点i的位置)、rsv f/g
‑
c (抗原位点iv的位置)等。rsv f/g
‑
b和rsv f/g
‑
c的取代可为图1所示的氨基酸残基382
‑
393和425
‑
436的全部或一部分。
[0095]
rsv f/g嵌合疫苗与使用post f蛋白作为抗原的疫苗相比较具有优异的感染保护能力，并且与使用pre f蛋白作为抗原的疫苗相比较具有同等或更高的感染保护能力。令人惊奇的是，与使用post f蛋白和pre f蛋白作为抗原的疫苗相比较，rsv f/g嵌合蛋白疫苗在疫苗接种之后抑制rsv感染的增强。
[0096]
用作基本结构的rsv f蛋白的序列的实例包括源自已知野生型rsv毒株或临床分离株的序列。例如，序列可为在genbank、欧洲生物信息学研究所(european bioinformatics institute) (ebi)和日本dna数据库(dna data bank of japan) (ddbj)的数据库中注册的序列。rsv f蛋白的代表性序列的实例包括seq id no: 1中列出的序列。rsv f蛋白通常由从n
‑
末端依次的称为sp结构域、f2结构域、p27结构域、fp结构域、f1结构域、tm结构域和ct结构域的位点组成。
[0097]
作为rsv f/g嵌合蛋白的一部分的rsv g蛋白的序列的实例包括源自已知野生型rsv毒株或临床分离株的序列。例如，序列可为在genbank、欧洲生物信息学研究所(ebi)和日本dna数据库(ddbj)的数据库中注册的序列。rsv g蛋白的代表性序列的实例包括seq id no: 2中列出的序列(人类呼吸道合胞病毒a2，uniprotkb/swiss
‑
prot:登录号p03423)。另外，作为rsv b毒株的g蛋白ccd的代表性序列，有seq id no: 11中列出的序列(人类呼吸道合胞病毒b (毒株b1)，uniprotkb/swiss
‑
prot: 登录号o36633)等。
[0098]
本发明的rsv f/g嵌合蛋白通过用rsv g蛋白的ccd序列的全部或一部分取代rsv f蛋白的一部分，或者通过将ccd序列的全部或一部分添加至rsv f蛋白中而制备。在此，取代或添加的rsv g蛋白的ccd序列的全部或一部分可为源自包括作为在rsv毒株间高度保守的rsv g蛋白的ccd序列(rsv g蛋白的氨基酸残基158
‑
199)中特别高度保守的序列区域的中央保守区(ccr) (rsv g蛋白的氨基酸残基164
‑
176)或cx3c基序(rsv g蛋白的氨基酸残基182
‑
186)的区域的序列，例如源自rsv g蛋白的氨基酸残基158
‑
199的序列。更具体地讲，
在本发明中，ccd序列的全部或一部分可包括例如seq id no: 2的158
‑
199位的序列、162
‑
197位的序列、164
‑
190位的序列、164
‑
186位的序列、164
‑
176位的序列、173
‑
197位的序列、187
‑
197位的序列、173
‑
186位的序列、162
‑
171位的序列、其中162
‑
172位的序列与187
‑
199位的序列相连的序列、其中164
‑
172位的序列与187
‑
197位的序列相连的序列或其中2
‑
3个162
‑
172位的序列相连的序列(图2
‑
4)。在本发明中，ccd序列的全部或一部分可与包含各所述序列的序列具有75%或更多，优选地85%或更多，并且更优选地90%或更多的同源性。取决于已知的野生型毒株，f蛋白的序列可能与seq id no: 1的序列相差约90%。另外，尽管g蛋白的ccd序列在病毒株间为保守的，但与seq id no: 2相比较，除ccr序列之外的ccd序列的一部分在已知野生毒株和临床分离株之间可相差约75%。另外，rsv f蛋白通常由从n
‑
末端依次的称为sp结构域、f2结构域、p27结构域、fp结构域、f1结构域、tm结构域和ct结构域的位点组成，但c
‑
末端侧的tm和ct结构域为不离开细胞的区域，并且因此可不包含这些结构域。
[0099]
本发明的rsv f/g嵌合蛋白还可通过修饰rsv f蛋白的糖基化来提高表达水平。糖基化的修饰可为其中将n
‑
型糖链添加至氨基酸残基n (asn)中和将o
‑
型糖链添加至氨基酸残基t (thr)/s (ser)中的修饰。可将修饰(突变)添加至rsv f蛋白中以进行糖基化修饰，并且修饰之后的氨基酸序列可包含n (asn)
‑
α (除pro以外的氨基酸)
‑
t(thr)或n (asn)
‑
α (除pro以外的氨基酸)
‑
s (ser)的氨基酸序列基序。
[0100]
其中将修饰(突变)添加至rsv f蛋白中以进行糖基化修饰的位置优选地为rsv f蛋白的单克隆抗体101f等特异性地结合的称为位点iv跨度的rsv f蛋白的422
‑
468位(非专利文献21、22和24)附近，也就是说，rsv f蛋白的419
‑
468位，和更优选的位置为rsv f蛋白的419
‑
436位中任何位置的氨基酸残基。具体地讲，优选的是对任何以下氨基酸残基(1)
‑
(7)添加修饰(突变)。
[0101]
(1) g430t/s(2) k419n和k421t/s(3) k427n和r429t/s(4) t434n和s436t/s(5) k419n、k421t/s和g430t/s(6) k419n、k421t/s和k427n和r429t/s(7) k419n、k421t/s和t434n和s436t/s特别地，优选的是通过“k419n、k421t、k427n和r429t”、“k419n、k421t和g430t”和“k419n、k421t、t434n和s436t”的诱变添加糖基化修饰。
[0102]
rsv f/g嵌合疫苗包含源自使用大肠杆菌、乳酸菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞作为宿主的表达系统的蛋白。例如，蛋白可为源自使用大肠杆菌(e. coli，escherichia coli)、芽殖酵母(酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))、毕赤酵母(pichia yeast) (巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris))、裂殖酵母(粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe))、sf9细胞、hi
‑
5细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、c127细胞、ns0细胞、sp2细胞、mdck细胞、eb66细胞、vero细胞、gl
‑
37细胞、ht
‑
1080细胞、hek293细胞、人类淋巴母细胞或人类正常二倍体成纤维细胞作为宿主的表达系统的蛋白。
[0103]
rsv f/g嵌合疫苗还可包含佐剂。佐剂可为例如聚(i:c)、mpl、rc529、gla、e6020、鞭毛蛋白、咪喹莫特、r848、cpg odn、qs21、tdb、α
‑
半乳糖神经酰胺、氢氧化铝、磷酸铝、mf59、as03、af03、se、bilosome、as01、as02、as04、as15、gla
‑
se、ic31、caf01、iscom 或其组合。
[0104]
rsv f/g嵌合疫苗还可包含添加剂。添加剂可为例如氨基酸、糖类、表面活性剂或其组合。
[0105]
rsv f/g嵌合疫苗的剂型可为例如液体形式、粉末形式(冻干粉、干粉)、胶囊形式、片剂或冷冻状态，但不限于此。
[0106]
rsv f/g嵌合疫苗还可包含药学上可接受的载体。这种载体可为例如盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、等渗水性缓冲液、乳化剂、ph调节剂或其组合。
[0107]
用于给予rsv f/g嵌合疫苗的方法可为通过注射器、透皮贴剂、微针、植入式缓释装置、带有微针的注射器、无针装置、鼻喷雾剂或者口服或舌下途径给予的方法。
[0108]
要用rsv f/g嵌合疫苗接种的哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴、人类等。本发明的rsv f/g嵌合疫苗最优选地用于人类，并且除不分性别的5
‑
64岁人群之外，也可用于孕妇、婴儿、5岁以下的儿童和65岁以上的成人。
[0109]
本发明rsv f/g嵌合疫苗的给予次数根据给予目的、给予方法和给予目标的情况(性别、年龄、体重、医学状况)以及何时给予人而不同，rsv f/g嵌合疫苗可给予一次、两次或三次。
[0110]
在下文中，本发明将参考实施例进行详细描述，但本发明完全不限于这些实施例。
[0111]
(实施例的材料和方法)1. 质粒和表达载体的克隆、构建通过外包制备编码包含rsv f蛋白的氨基酸残基1
‑
524、flag标签和his标签的序列的dna片段。使用该片段dna作为模板，使用诱变引物或寡聚dna合成产物和编码包含以下每一个的序列的片段dna进行组装pcr：rsv wt f (使用非专利文献18中报道的hrsv f蛋白的氨基酸序列(caa26143)中的rsv f蛋白1
‑
513个氨基酸残基制备；seq id no: 1)、rsv post f蛋白(使用专利文献4中描述的sec id no. 1的氨基酸序列中的rsv f蛋白1
‑
513个氨基酸残基制备；seq id no: 3)和rsv pre f蛋白(使用专利文献4中描述的sec id no. 383的氨基酸序列中的rsv f蛋白1
‑
513个氨基酸残基制备；seq id no: 4)。rsv pre f为包含在同一专利文献中描述的序列中所含的三聚化序列、his标签序列和strep标签序列的序列。注意的是，不含包含flag标签和his标签的序列。并且制备rsv f/g嵌合蛋白(使用seq id no: 1作为结构，rsv f蛋白被取代或添加至rsv g蛋白的seq id no: 2或seq id no: 11的ccd中。并且使用seq id no: 1作为结构，rsv f蛋白被取代或添加至rsv g蛋白的seq id no: 2的ccd的部分变体中)。使用in
‑
fusion
r hd克隆试剂盒(takara bio inc.)将片段dna和由sali切割的pcaggs1.dhfr.neo载体(专利文献8，km biologics co., ltd.)相连接以制备动物细胞表达载体。质粒dna的制备通过使用大肠杆菌jm109感受态细胞(toyobo co., ltd.)进行克隆来进行。
[0112]
[表1
‑
1]
[表1
‑
2]
fisher scientific)通过制造商推荐的方法进行传代，并用于每个试验和抗原制备。
[0116]
5. 小鼠将spf雌性balb/c小鼠(japan slc, inc.)调理约1周，并然后用于免疫原性试验、针对感染的保护试验等。
[0117]
6. 病毒rsv a2 (vr
‑
1540, atcc)通过制造商推荐的方法繁殖。制备的病毒在
‑
80℃下储存一段时间直至使用。
[0118]
7. sds
‑
page和western印迹7
‑
1. sds
‑
page将样本加入至样品缓冲液和dtt的混合液中，并在热处理(96℃，3
‑
5分钟)之后，使用sds
‑
page mini (tefco)或bolt
r
bis
‑
tris凝胶(thermo fisher scientific)进行sds
‑
page。电泳之后，用bullet cbb stain one (nacalai)染色并用去离子水适度脱色。凝胶用las
‑
3000 (fujifilm corporation)或wse
‑
6100 luminograph i (atto)进行拍照。
[0119]7‑
2. western印迹在通过以上方法进行电泳之后，用甲醇处理膜，并使用半干印迹装置进行印迹。提取的膜用5%脱脂牛奶封闭30分钟。用pbst洗涤之后，使稀释的抗rsv f抗体与膜反应1小时。用pbst洗涤之后，使稀释的抗小鼠igg抗体(thermo fisher scientific)与膜反应1小时。用pbst洗涤之后，使western blot ultra sensitive hrp substrate (takara bio inc.)与膜反应。用las
‑
3000 (fujifilm corporation)对经受以上处理的膜进行拍照。
[0120]
8. 凝胶过滤色谱(gfc)使用尺寸排阻色谱测量粒径。使用agilent 1200系列(agilent technologies)系统和superdex
r 200 increase 5/150 gl (ge healthcare)柱测量用d
‑
pbs稀释并然后通过0.22 μm滤器过滤的样本。使用凝胶过滤标准品(bio
‑
rad)作为标准品分析分子量。
[0121]
9. 通过动态光散射(dls)测量粒度使用zetasizer nano (malvern panalytical)测量各种蛋白的粒度。根据制造商的说明进行测量。
[0122]
10. 电子显微镜使用tecnaig2 12 twin (fei company)，通过用饱和醋酸铀和2% pta (磷钨酸)的负染色方法进行观察。
[0123]
11. elisa11
‑
1. 夹心elisa将用d
‑
pbs稀释的抗rsv f抗体施加于96孔maxsorp板(thermo fisher scientific)，并使板在2
‑
8℃下静置过夜或在37℃下静置1小时。从在其上已固定抗rsv f抗体的板上去除抗体稀释液，然后用pbs洗涤板，施加1% bsa，并使板静置1小时。去除封闭液，施加样本并密封，且然后使板在37℃下静置1小时。去除样本之后，用pbst洗涤板，施加用1% bsa稀释的生物素化抗rsv f抗体并密封，并然后使板在37℃下静置1小时。去除生物素化抗rsv f抗体溶液之后，用pbst洗涤板，施加稀释的hrp标记的链霉亲和素(vector laboratories)并密封，且然后使板在37℃下静置1小时。去除hrp标记的链霉亲和素溶液之后，用pbst洗涤板，施加3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺液体底物，超灵敏，用于elisa即用型溶液
(sigma
‑
aldrich)，并使板在室温下静置30分钟。将1 n h2so4施加于板上以停止显色，并然后用spectramax190 (thermo fisher scientific) 进行测量。
[0124]
11
‑
2. 间接elisa将用d
‑
pbs稀释的rsv f蛋白施加于96孔皮尔斯镀镍板(pierce nickel coated plate) (thermo fisher scientific)上，并使板在2
‑
8℃下静置过夜或在37℃下静置1小时。去除rsv f蛋白稀释液之后，用pbs洗涤板，施加1% bsa，并使板静置1小时。去除封闭液，施加样本并密封，且然后使板在37℃下静置1小时。去除样本之后，用pbst洗涤板，并施加用1% bsa稀释的抗小鼠igg hrp标记的抗体或抗人igg hrp标记的抗体且密封，并然后使板在37℃下静置1小时。去除hrp标记的抗体稀释液之后，用pbst洗涤板，施加3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺液体底物，超灵敏，用于elisa即用型溶液(sigma
‑
aldrich)，并使板在室温下静置30分钟。将1 n h2so4施加于板上以停止显色，并然后用spectramax190 (thermo fisher scientific)进行测量。
[0125]
12. 实时pcr12
‑
1. rna提取和cdna合成将感染保护试验中收集的balf (支气管肺泡灌洗液)离心(300 g或1500 rpm)，并然后收集上清液。使用nucleospin
r rna virus (macherey
‑
nagel)从150 μl上清液中分离病毒rna。方案通过制造商推荐的方法进行。从使用高容量cdna逆转录试剂盒(high
‑
capacity cdna reverse transcription kit) (applied biosystems)提取的rna进行cdna合成。方案通过制造商推荐的方法进行。
[0126]
12
‑
2. pcr将正义引物(rsvf
‑
f, seq id no: 7)、反义引物(rsvf
‑
r, seq id no: 8)、mgb探针(rsvfa
‑
taqpf
‑
fam, seq id no: 9，带有[fam]和[mgbeq]修饰)、蒸馏水(nippon gene co., ltd.)和样本混合以制备样本溶液，并使用标准dna (seq id no: 10)以具有102‑
107个拷贝来制备标准溶液。引物、探针和标准dna参考非专利文献20通过外包制备。进行实时pcr：<50℃，2分钟>，然后是 <95℃，10分钟>
ꢀ→ꢀ
<95℃，30秒>
ꢀ→ꢀ
<60℃，1分钟>的循环50次。由标准溶液的扩增曲线制作校准曲线，并计算样本的病毒拷贝数。
[0127]
[表2]
13. 免疫原性试验将制备成5 μg/小鼠的样本以3周的间隔两次肌内给予6
‑
7周龄的雌性balb/c，并在3周之后于异氟烷麻醉下采集全血。分离血清以收集血清，免疫原性通过间接elisa评价，中和能力通过中和试验评价，和补体依赖性中和能力通过补体依赖性中和试验评价。
[0128]
14. 中和试验将hep
‑
2细胞以2
ꢀ×ꢀ
105个细胞/ml接种于96孔板中，并在 37℃、5% co2的条件下培养1天。将用培养基稀释的血清和rsv稀释液等量混合，并使混合物在37℃、5% co2的条件下静置1小时。去除板的培养上清液之后，加入血清
‑
rsv反应液，并在37℃、5% co2的条件下培养3
‑
5天。去除反应液之后，用pbs洗涤板，向其加入甲醇，并使板在室温下静置30分钟。去除甲醇并将板风干之后，用pbs洗涤板，施加抗rsv f抗体稀释液，并然后使板在37℃下静置1小时。去除抗rsv f抗体稀释液之后，施加抗小鼠igg alexa 488标记的抗体(abcam)稀释液，并使板在37℃下静置1小时。去除抗小鼠igg alexa 488标记的抗体(abcam)稀释液之后，用pbs洗涤板，施加稀释的hoechst 33342溶液(dojindo laboratories)，并使板在暗处静置10分钟。去除核染剂并用pbs洗涤之后，将pbs施加于板上并用图像分析仪进行分析。基于血清稀释系列的感染率，根据拟合指南使用graphpad prism 7 (graphpad software)，使用仅施加rsv的孔的感染率作为参考进行曲线拟合，并计算中和抗体效价(ic50)。
[0129]
15. 补体依赖性中和试验如在中和试验中那样制备细胞。使用包含 1/50量的兔血清补体(cedarlane)的培养基进行rsv稀释。将用培养基稀释的血清和rsv稀释液等量混合，并使混合物在37℃、5% co2的条件下静置1小时。加入血清
‑
rsv反应液，并在37℃、5% co2的条件下培养1小时。之后，去除血清
‑
rsv反应液，用pbs洗涤板，加入无补体的培养基，并将混合物在37℃、5% co2的条
件下培养3
‑
5天。其他操作和分析根据中和试验的方法进行。
[0130]
16. 亚类分析除了使用抗小鼠igg1 hrp标记的抗体(abcam)和抗小鼠igg2a hrp 标记的抗体(abcam)作为二抗之外，进行与间接elisa方法相同的程序。
[0131]
17. 针对感染的保护试验将制备成0.005
‑
15 μg/小鼠的样本以3周的间隔两次肌内给予6
‑
7周龄的雌性balb/c，并然后在3周之后，于异氟烷麻醉下鼻内接种1
ꢀ×ꢀ
10
5 pfu/小鼠的rsv。感染之后3
‑
4天，在用氮气安乐死之后收集balf。从balf中提取rna以合成cdna，并通过实时pcr检测病毒拷贝数。
[0132]
18. 感染增强评价参照用生理盐水免疫并用rsv攻击的组的balf中病毒拷贝数的几何平均数来评价感染的增强或感染抑制率。另外，参照其中转移通过用生理盐水免疫获得的血清的组，评价rsv攻击组的肺中病毒拷贝数的几何平均数。血清转移通过使用按10^8稀释的各种血清，以400 ul/小鼠腹膜内给予进行，其中通过预先制备稀释系列确认的恶化成为峰值。血清转移之后一天，在异氟烷麻醉下鼻内接种1
ꢀ×ꢀ
10
5 pfu/小鼠的rsv。感染之后3
‑
4天，用氮气安乐死之后收集肺。从肺中提取rna以合成cdna，并通过实时pcr检测病毒拷贝数。
[0133]
19. 统计分析使用graphpad prism 7 (graphpad software)进行统计分析。
[0134]
[实施例1]rsv f/g嵌合蛋白的制备在expi293细胞中表达如图1
‑
4所示的各种rsv f/g嵌合蛋白，并然后用亲和柱纯化。每种蛋白产量如图5和6所示。与未添加糖链的蛋白相比较，添加突变以将糖链添加至特定位置的蛋白趋于具有高表达水平。具体地讲，通过“k419n、k421t和g430t”、“k419n、k421t、t434n和s436t”以及“k419n、k421t、k427n和r429t”中的诱变添加糖链的f/g嵌合蛋白的表达水平增加。
[0135]
[实施例2]物理特性的评价1. sds
‑
page和western印迹通过sds
‑
page和western印迹分析每种蛋白的结果如图7
‑
15和27
‑
39所示。通过比较sds
‑
page和western印迹的结果，确认主条带为rsv f/g嵌合蛋白。
[0136]
在rsv f/g嵌合蛋白中取代有rsv g蛋白的10
‑
氨基酸序列(162
‑
171；图2中编号9)的rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2的sds
‑
page结果如图7所示，所述10
‑
氨基酸序列包含以下区域(164
‑
171)，其为在病毒株之间具有高度同源性的区域ccd的序列中特别高度保守的区域并且不包含半胱氨酸套索(通过半胱氨酸残基173
‑
186之间和176
‑
182之间的二硫键形成的特征结构)。野生型rsv f蛋白(593 aa)为62 kda，并且确认在高于大致估计分子量的位置观察到为糖蛋白的rsv wt f蛋白(513 aa)和rsv post f蛋白(513 aa)的主条带。此外，rsv f/g嵌合蛋白(513 aa)的主条带位于比wt和 post f蛋白更高的位置这一事实表明是由于通过诱变引起的糖基化作用所致。
[0137]
各种rsv f/g蛋白的sds
‑
page (非还原性)结果如图8
‑
14所示。对于其中由于表达
水平低而施用量小于1 μg/泳道的样品，泳道编号和样品以灰色显示。在未添加将糖链添加至图1所示的位置的突变的rsv f/g嵌合蛋白中，rsv f/ga
‑1‑
0、rsv f/ga
‑2‑
0、rsv f/ga
‑3‑
0、rsv f/ga
‑4‑
0、rsv f/ga
‑8‑
0、rsv f/ga
‑5‑
0、rsv f/ga
‑
10
‑
0、rsv f/ga
‑
11
‑
0和rsv f/g
‑
a
‑
11/11
‑
0导致主条带无法确认、强度低或表达水平低。另外，对于添加了“k419n、 k421t和g430t”的突变以及“k419n、k421t、t434n和s436t”的糖基化突变的rsv f/g
‑
a
‑1‑
1、rsv f/g
‑
a
‑1‑
2、rsv f/g
‑
a
‑2‑
1、rsv f/g
‑
a
‑2‑
2、rsv f/g
‑
a
‑3‑
1、rsv f/g
‑
a
‑3‑
2、rsv f/g
‑
a
‑6‑
1、rsv f/g
‑
a
‑6‑
2、rsv f/g
‑
a
‑7‑
1、rsv f/g
‑
a
‑7‑
2、rsv f/g
‑
a
‑8‑
1、rsv f/g
‑
a
‑8‑
2、rsv f/g
‑
a
‑5‑
1、rsv f/g
‑
a
‑5‑
2、rsv f/g
‑
a
‑9‑
1、rsv f/g
‑
a
‑9‑
2、rsv f/g
‑
a
‑
10
‑
1、rsv f/g
‑
a
‑
10
‑
2、rsv f/g
‑
a
‑
11
‑
1和rsv f/g
‑
a
‑
11
‑
2可确认主条带和高表达水平，而与“k419n、k421t和g430t”的突变和“k419n、k421t、t434n和s436t”的糖基化突变相比较，添加了“k421t和g430t”的糖基化突变的rsv f/g
‑
a
‑1‑
3、rsv f/g
‑
a
‑2‑
3和rsv f/g
‑
a
‑9‑
3具有低主条带强度或低表达水平。
[0138]
2. 凝胶过滤色谱分析(gfc)使用凝胶过滤色谱对每种蛋白进行大小分析。gfc的结果如表3所示。发现rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2具有670 kda或更大大小的蛋白(当大小为670 kda或更大时显示外推值)作为主峰，以及大小约为120 kda的蛋白作为第二峰。已知野生型rsv f蛋白形成三聚体作为天然结构，并且当假设rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2类似地形成三聚体时，表明rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2类似地形成三聚体，因为它们的分子量接近第二峰的分子量。另外，表明主峰显示的大小为670 kda或更多，因为rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2的三聚体形成如在稍后描述的电子显微镜图像中的玫瑰花状结构。
[0139]
[表3
‑
1][表3
‑
2]
3. 通过动态光散射(dls)测量粒度通过动态光散射测量每种蛋白的粒径。每种蛋白的平均粒径如表4所示。
[0140]
[表4]
4. 通过电子显微镜的分析用电子显微镜观察rsv f/g嵌合蛋白的形状。 rsv f/g
‑
a
‑9‑
1、rsv f/g
‑
a
‑9‑
2、rsv post f和rsv pre f的电子显微镜图像如图16所示。表明rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2形成类似于rsv post f的玫瑰花状结构。
[0141]
[实施例3]与抗rsv f抗体的反应性分析通过间接elisa方法分析每种蛋白和抗rsv f抗体之间的反应性(由吸光度表示)。用对位点φ、位点i、位点ii、位点iii和位点iv (非专利文献23)中的每个位点特异性的抗rsv f抗体对rsv f蛋白的分析结果如图17、图18、图40和图41所示。观察到与各种抗体的反应性差异，这取决于取代的rsv g蛋白序列和糖基化突变。在位点iv附近添加糖基化突变的蛋白中，观察到与抗rsv f位点iv抗体的反应性降低。巧合的是，观察到多种取代有rsv g蛋白的rsv f/g嵌合蛋白与rsv wt f相比较，与rsv pre f特异性抗体的反应性增加。
[0142]
[实施例4]中和试验免疫每种蛋白以获得血清，并进行中和试验。中和试验通过设置使用作为磷酸铝佐剂的adju
‑
phos
r (brenntag)的给予组和没有佐剂的组来进行。中和试验的结果如图19所示。与不同之处仅在于不包含rsv g蛋白序列的rsv f/g
‑
a
‑0‑
1和rsv f/g
‑
a
‑0‑
2相比较，包含rsv g蛋白序列的rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2中的中和抗体效价(ic50，几何平均值)趋于较高。另外，中和抗体效价(ic50，几何平均值)在rsv pre f中最高，然后依次是rsv f/g
‑
a
‑9‑
2和wt。rsv f/g
‑
a
‑9‑
1的中和抗体效价与rsv wt f相当，并且rsv f/g
‑
a
‑0‑
1和rsv f/g
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a
‑0‑
2显示中和抗体效价(ic50，几何平均值)低于rsv wt f。
[0143]
[实施例5]补体依赖性中和试验以与实施例4相同的方式获得使用adju
‑
phos
r
的给予组的血清，并进行补体依赖性中和试验。如图19所示，与rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2的中和抗体效价(ic50，几何平均值)相比较，rsv pre f的中和抗体效价(ic50，几何平均值)趋于较高，但图20中所示的
在存在补体的情况下的中和抗体效价(ic50，几何平均值)导致rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2中比rsv pre f中更高(dunn多重比较检验)，*：p < 0.05，n =)。另外，如图42所示，观察到与rsv pre f相比较，大量具有高中和抗体效价的rsv f/g嵌合蛋白。
[0144]
[实施例6]亚类分析以与实施例4和实施例5中相同的方式获得使用adju
‑
phos
r
的给予组的血清，并对存在于rsv pre f、rsv f/g
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a
‑9‑
1、rsv f/g
‑
a
‑9‑
2和盐水免疫血清中的抗rsv f抗体进行亚类分析。亚类分析结果如图21所示。发现rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2对具有高补体结合能力的igg2a具有高诱导性，而rsv pre f对没有补体结合能力的igg1具有高诱导性。
[0145]
[实施例7]抗rsv g抗体的诱导性评价以与实施例4、实施例5和实施例6中相同的方式获得使用adju
‑
phos
r
的给予组的血清，并对存在于rsv pre f、rsv f/g
‑
a
‑9‑
1、rsv f/g
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a
‑9‑
2和盐水免疫血清中的抗rsv g抗体的诱导性进行评价。抗rsv g抗体的诱导性评价结果如图22所示。显示了与rsv pre f免疫血清相比较，rsv f/ga
‑9‑
1和rsv f/ga
‑9‑
2免疫血清中存在与rsv g蛋白具有高反应性的抗体，并且表明抗rsv g抗体被rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2诱导。
[0146]
[实施例8]针对感染的保护试验每种蛋白制备成5 μg/小鼠/次(无佐剂)，并使6周龄雌性balb/c小鼠以3周的间隔免疫两次，并在3周之后感染rsv。rsv接种之后3天，收集balf，进行rna提取和cdna合成，并使用实时pcr量化病毒拷贝数(几何平均数)。rsv pre f、rsv wt f、rsv f/g
‑
a
‑0‑
1和rsv f/g
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a
‑0‑
2及rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2感染保护试验结果如图23所示。由于rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2显示出与rsv pre f相当的病毒拷贝数，因此表明它们具有与rsv pre f相当的感染保护能力。另外，表明与不含rsv g蛋白序列的rsv wt f、rsv f/g
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a
‑0‑
1和rsv f/g
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a
‑0‑
2的拷贝数相比较，rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2的拷贝数较低，和感染保护能力趋于较高(相对于rsv pre f；dunn多重比较检验，***：p < 0.002，*：p < 0.05，n = 14
‑
16)。与rsv post f的比较结果如图24 (左)所示，和与fi
‑
rsv的比较结果如图24 (右)所示。与rsv post f相比较，试验在15 μg/小鼠/次的免疫条件下进行，并且与rsv post f相比较在rsv f/g
‑
a
‑9‑
1和rsv f/ga
‑9‑
2中观察到病毒拷贝数显著减少(dunn多重比较检验，***：p < 0.002，*：p < 0.05，n = 8)。与fi
‑
rsv相比较，试验在5 μg/小鼠/次的免疫条件下进行，并且与fi
‑
rsv相比较在rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
‑
a
‑9‑
2中观察到病毒拷贝数显著减少(dunn多重比较检验，**：p < 0.01，*：p < 0.05，n = 7
‑
8)。
[0147]
[实施例9]为了确认剂量依赖性，通过将rsv post f、rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2的免疫条件设置为15、5、0.5、0.05和0.005 μg/小鼠的5个剂量，其他条件以与实施例8中相同的方式，测量balf中的病毒拷贝数(几何平均数)，并且结果如图25所示。显示了rsv post f的病毒拷贝数在5 μg/小鼠和15 μg/小鼠下没有变化，rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2的病毒拷贝数在高剂量范围内(15 μg/小鼠)低于rsv post f，感染保护能力超过rsv post f，并且rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2的感染保护能力在低剂量范围内(0.05、0.005 μg/小
鼠)也超过rsv post f。因此，表明rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2的最大功效超过rsv post f，并且最小剂量下的功效也超过rsv post f (误差条：95%置信区间，n = 8)。
[0148]
[实施例10]感染抑制率的评价根据针对感染的保护试验的结果，基于盐水组(未用抗原免疫的对照组)的病毒拷贝数(几何平均数)计算rsv f/g
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a
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1、rsv f/g
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a
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2、rsv post f和rsv pre f的感染抑制率(在rsv f/g
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a
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1、rsv f/g
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a
‑9‑
2和rsv post f于15、5、0.5、0.05和0.005 μg/小鼠的5个剂量下的免疫条件下，以及rsv pre f于0.5、0.08和0.008 μg/小鼠的3个剂量下的免疫条件下进行)。感染抑制率的计算结果如图26所示。当设置低剂量免疫组以确认恶化趋势时，与盐水的病毒拷贝数相比较，在rsv pre f中于0.08 μg/小鼠或更低下和在rsv post f中于0.005μg/小鼠下检测到高病毒拷贝数，并且显示出感染增强趋势。另一方面，在rsv f/g
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a
‑9‑
1和rsv f/g
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a
‑9‑
2中没有观察到感染增强趋势(误差条：95%置信区间，n = 4
‑
8)。
[0149]
[实施例11]感染增强评价转移免疫血清以评价被动免疫之后的感染增强。如图43所示，在rsv pref中明显观察到感染增强，但在rsv f/g
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a
‑9‑
2中未观察到感染增强(dunn多重比较检验，*：p < 0.05，误差条：95%置信区间，n = 13)。
[0150]
工业实用性本发明可用于药物领域，特别是疫苗领域。