多核糖核苷酸及其美容用途的制作方法

多核糖核苷酸及其美容用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年3月1日提交的美国临时申请号62/812,772的优先权和权益，该临时申请的全部内容通过援引并入本文。背景
2.多核糖核苷酸是用于生物活性诸如基因表达、基因调控和细胞信号转导的关键生物分子。概述
3.本文所述的发明包括用于递送多核糖核苷酸(例如，美容多核糖核苷酸)的组合物、美容组合物和方法。在一些实施例中，这些组合物和美容组合物包含乙醇和多核糖核苷酸。在其他实施例中，这些组合物和美容组合物包含醇和多核糖核苷酸。在其他实施例中，这些组合物和美容组合物包含细胞渗透剂和多核糖核苷酸。这些方法包括将这些组合物和美容组合物施加至受试者的表面区域(例如，外皮成员)。
4.本文所述的发明包括包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物。可以将这些美容组合物施加至上皮细胞以递送美容多核糖核苷酸。这些美容组合物可以在将消毒剂施加至表面区域(例如，外皮成员)之后施加至该区域。
5.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和乙醇的混合物，其中乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。
6.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和醇的混合物，其中醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂
醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。
7.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物，其中细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，细胞渗透剂是醇。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，多核糖核苷酸编码蛋白。在一些实施例中，蛋白是美容蛋白。在一些实施例中，蛋白是毛发或睫毛(例如角蛋白纤维)、指甲或皮肤蛋白。在一些实施例中，蛋白是胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、肉毒杆菌毒素或其片段。在一些实施例中，美容组合物是液体、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫、精华液、软膏或棒。在一些实施例中，多核糖核苷酸是美容多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是mrna。在一些实施例中，多核糖核苷酸缺少帽或聚a尾。在一些实施例中，多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含经修饰的核糖核苷酸。在一些实施例中，美容组合物具有约7的ph。在一些实施例中，美容组合物具有与水大致相同的粘度。在一些实施例中，美容组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。在一些实施例中，美容组合物基本上不含烃。在一些实施例中，美容组合物基本上不含阳离子脂质体。在一些实施例中，美容组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。在一些实施例中，美容组合物是基本上游离形式的甘油、丙烯乙二醇或其组合。在一些实施例中，美容组合物是抗皱组合物。在一些实施例中，细胞渗透剂可溶于极性溶剂。在一些实施例中，细胞渗透剂不溶于极性溶剂。
8.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中醇被配置用于局部施用。在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中细胞渗透剂被配置用于局部施用。
9.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中有效负载对细胞或组织具有美容效果。在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中有效负载对细胞或组织具有美容效果。在一些方面，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。
10.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中多核糖核苷酸的量有效产生对细胞或组织的美容效果，并且其中醇的量有效产生对细胞或组织的美容效果。在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中多核糖核苷酸的量有效产生对细胞或组织的美容效果，并且其中细胞渗透剂的量有效产生对细胞或组织的美容效果。
11.在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸、醇和局部递送赋形剂，其中局部递送赋形剂包含稳定剂。在一些方面，美容组合物包含多核糖核苷酸、细胞渗透剂和局部递送赋形剂，其中局部递送赋形剂包含稳定剂。在一些实施例中，稳定剂包含葡萄糖(4.5g/l)。
12.在一些方面，美容组合物包含负载有多核糖核苷酸和醇的生物可降解支架。在一些方面，美容组合物包含负载有多核糖核苷酸和细胞渗透剂的生物可降解支架。在一些实施例中，细胞渗透剂包含醇。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，醇是乙醇。
13.在一些方面，将美容多核糖核苷酸递送至受试者的方法包括：a)将消毒剂施加至受试者的外皮成员；b)将包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物施加至该外皮成员。在一些实施例中，消毒剂是醇、紫外光、激光或热。
14.在一些方面，将美容多核糖核苷酸递送至受试者的方法包括：a)将醇施加至受试者的外皮成员；b)将包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物施加至该外皮成员。
15.在一些方面，将多核糖核苷酸递送至上皮细胞的方法包括将包含稀释剂和未修饰的美容多核糖核苷酸而不含任何载体的美容组合物施加至该上皮细胞。
16.在一些方面，将多核糖核苷酸递送至受试者的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和乙醇的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在多个方面，将多核糖核苷酸递送至受试者的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些方面，将多核糖核苷酸递送至受试者的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，美容组合物将美容多核糖核苷酸递送至受试者的真皮或表皮组织。在一些实施例中，美容组合物在不使用离子导入法的情况下将美容多核糖核苷酸递送至受试者的真皮或表皮组织。
17.在一些方面，将美容多核糖核苷酸递送至细胞或组织的方法包括使细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物接触，其中醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些方面，将美容多核糖核苷酸递送至细胞或组织的方法包括使细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物接触，其中细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。
18.在一些方面，将美容组合物递送至细胞或组织的方法包括使该细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和醇的美容组合物接触，其中醇被配置用于局部施用。在一些方面，将美容组合物递送至细胞或组织的方法包括使细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和细胞渗
透剂的美容组合物接触，其中细胞渗透剂被配置用于局部施用。
19.在一些方面，递送美容多核糖核苷酸的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物施加在受试者的外皮成员上。在一些方面，递送美容多核糖核苷酸的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物施加在受试者的外皮成员上。在一些实施例中，细胞渗透剂包含醇。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，n醇包括乙醇。在一些实施例中，乙醇、醇或细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。在一些实施例中，乙醇、醇或细胞渗透剂占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，该方法进一步包括将美容多核糖核苷酸与醇混合。在一些实施例中，该方法进一步包括将美容多核糖核苷酸与细胞渗透剂混合。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前呈固体形式。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前被冻干。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前呈液体形式。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前溶解在溶剂中。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中有效负载对细胞或组织具有美容效果。在一些方面，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸的量有效产生对细胞的美容效果，并且细胞渗透剂的量有效产生对细胞或组织的美容效果。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸编码蛋白。在一些实施例中，蛋白是美容蛋白。在一些实施例中，蛋白是毛发、皮肤或指甲蛋白。在一些实施例中，蛋白是胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、肉毒杆菌毒素或其片段。在一些实施例中，组合物是液体、精华液、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫或棒。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸是mrna。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸缺少帽或聚a尾。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸是免疫原性的。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸是非免疫原性的。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸包含经修饰的核糖核苷酸。在一些实施例中，美容组合物具有约7的ph。在一些实施例中，美容组合物具有与水大致相同的粘度。在一些实施例中，美容组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。在一些实施例中，美容组合物基本上不含烃。在一些实施例中，美容组合物基本上不含阳离子脂质体。在一些实施例中，美容组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。在一些实施例中，美容组合物不含甘油、丙烯乙二醇或其组合。在一些实施例中，细胞渗透剂可溶于极性溶剂。在一些实施例中，细胞渗透剂不溶于极性溶剂。在一些实施例中，美容组合物进一步包含美容上
可接受的赋形剂。在一些实施例中，递送是局部的。在一些实施例中，外皮成员包括皮肤、毛发或指甲。在一些实施例中，施加包括将混合物液滴直接沉积到外皮成员上。在一些实施例中，施加包括用嵌入有混合物的贴片、凝胶或膜擦拭外皮成员。在一些实施例中，施加包括将混合物喷雾到外皮成员上。在一些实施例中，施加包括经由气雾化将混合物施用给受试者。在一些实施例中，细胞包括上皮细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于线性对应物至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于线性对应物至少5倍。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸具有短期美容效果。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸具有长期美容效果。在一些实施例中，混合物中美容多核糖核苷酸的浓度为至少约50ng/ml、至少约100ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约500μg/ml、至少约1mg/ml、至少约2mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml。
20.在一些方面，试剂盒包括施加工具和如任一前述实施例所述的美容组合物，其中施加工具被配置成将美容组合物施加至受试者的外皮成员。
21.在一些方面，试剂盒包括第一施加工具、第二施加工具、消毒剂以及包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物，其中第一施加工具被配置成将消毒剂施加至受试者的外皮成员，并且第二施加工具被配置成将组合物施加至受试者的外皮成员。在一些实施例中，消毒剂是醇、紫外光、激光或热。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，第一施加工具是擦拭物。在一些实施例中，擦拭物包含消毒剂。在一些实施例中，第一施加工具是施加紫外光或激光的装置。在一些实施例中，第一施加工具是施加热量的装置。
22.在一些方面，试剂盒包括施加工具和包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂或醇的混合物，其中施加工具被配置成将混合物施加至受试者的外皮成员。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具包括移液管。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具包括基材，并且其中基材嵌入有混合物。在一些实施例中，基材由天然或人造纤维制成。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具包括贴片。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具包括喷雾器。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具包括去角质垫(peel pad)。在一些实施例中，施加工具或第二施加工具被配置成以受控方式释放混合物。在一些实施例中，外皮成员包括皮肤、指甲、睫毛或毛发。
23.在另一方面，试剂盒包括本文所述的美容组合物和醇擦拭物。在另一方面，试剂盒包括本文所述的美容组合物和含有用于施加至受试者的表面区域的醇的小瓶。定义
24.本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是
仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其共识来理解。
25.如本文所用的术语“多核苷酸”意指包含一个或多个核酸亚基、或核苷酸的分子，并且可与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包含选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的一个或多个核苷酸。核苷酸可以包含核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(po3)基团。核苷酸可以包含核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或rna可以指包含经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。多脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或dna可以指包含经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，其可选自脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、尿苷三磷酸(dutp)和脱氧胸苷三磷酸(dttp)dntp，其包括可检测标签，诸如发光标签或标记(例如荧光团)。核苷酸可以包含可掺入到正生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补的a、c、g、t或u具有特异性的、或与嘌呤(即，a或g，或其变体)或嘧啶(即，c、t或u，或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其衍生物或变体。在一些情况下，仅举数例，多核苷酸是短干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、质粒dna(pdna)、短发夹rna(shrna)、小核rna(snrna)、信使rna(mrna)、前体mrna(pre
‑
mrna)、反义rna(asrna)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，诸如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千个碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。多核苷酸可以从细胞或组织中分离。如本文所述，多核苷酸序列可以包括分离和纯化的dna/rna分子、合成的dna/rna分子和合成的dna/rna类似物。
26.多核苷酸，例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以包含一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5
‑
氟尿嘧啶、5
‑
溴尿嘧啶、5
‑
氯尿嘧啶、5
‑
碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4
‑
乙酰胞嘧啶、5
‑
(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5
‑
羧基甲基氨基甲基
‑2‑
硫代尿苷、5
‑
羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β
‑
d
‑
半乳糖基q核苷、肌苷、n6
‑
异戊烯基腺嘌呤、1
‑
甲基鸟嘌呤、1
‑
甲基肌苷、2,2
‑
二甲基鸟嘌呤、2
‑
甲基腺嘌呤、2
‑
甲基鸟嘌呤、3
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
甲基胞嘧啶、n6
‑
腺嘌呤、7
‑
甲基鸟嘌呤、5
‑
甲基氨基甲基尿嘧啶、5
‑
甲氧基氨基甲基
‑2‑
硫尿嘧啶、β
‑
d
‑
甘露糖基q核苷、5'
‑
甲氧基羧甲基尿嘧啶、5
‑
甲氧基尿嘧啶、2
‑
甲硫基
‑
d46
‑
异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶
‑5‑
羟基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷(queosine)、2
‑
硫代胞嘧啶、5
‑
甲基
‑2‑
硫尿嘧啶、2
‑
硫尿嘧啶、4
‑
硫尿嘧啶、5
‑
甲基尿嘧啶、尿嘧啶
‑5‑
羟基乙酸甲酯、尿嘧啶
‑5‑
羟基乙酸(v)、5
‑
甲基
‑2‑
硫尿嘧啶、3
‑
(3
‑
氨基
‑3‑
n
‑2‑
羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6
‑
二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸可以包括其磷酸部分中的修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括较大长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α
‑
硫代三磷酸和β
‑
硫代三磷酸)。核酸分子还可以在碱基部分(例如，在通常可用于
与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可以包含胺修饰的基团，诸如氨基烯丙基1
‑
dutp(aa
‑
dutp)和氨基己基丙烯酰胺
‑
dctp(aha
‑
dctp)，以允许共价附接胺反应性部分，诸如n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)。本披露的寡核苷酸中的标准dna碱基对或rna碱基对的替代物可以提供更高的位/立方毫米密度，更高的安全性(抵抗天然毒素的意外或有目的的合成)，光编程聚合酶的更容易区分，或更低的二级结构。在betz k,malyshev da,lavergne t,welte w,diederichs k,dwyer tj,ordoukhanian p,romesberg fe,marx a.nat.chem.biol.[自然
‑
化学生物学]2012年7月；8(7):612
‑
4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过援引并入本文中。
[0027]
多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。如本文所用，术语“线性rna”或“线性多核糖核苷酸”可互换使用，并且意指具有自由5'和3'末端的多核糖核苷酸。在一些实施例中，线性rna具有自由5'末端或3'末端。如本文所用，术语“circrna”或“环状多核糖核苷酸”或“环状rna”可互换使用，并且意指通过共价或非共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。在一些情况下，环状多核糖核苷酸具有连续环，其中相应线性多核糖核苷酸的典型自由5'和3’末端经由共价或非共价键或经由非核酸接头(例如，非核酸聚合物或蛋白)连接在一起。在一些情况下，本文提供的环状多核糖核苷酸可由两个或更多个线性多核糖核苷酸形成，这些线性多核糖核苷酸经由共价键或非共价键连接在一起以形成连续环结构。不受理论的束缚，可能的是，rna的多个区段可以由dna产生并且其5’自由端和3’自由端退火以产生一“串”rna，当只留有一个5’自由端和一个3’自由端时，该“串”rna最终可能会被环化。
[0028]
如本文所用，术语“目的美容多肽”是指经选择以在本披露的美容组合物的多核糖核苷酸中编码的任何多肽。如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用的该术语意指任何大小、结构或功能的蛋白、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，并且可以是缔合的或连接的。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
[0029]
如本文所用，术语“混合物”意指由混合的两种或更多种不同物质制成的材料。在一些情况下，本文所述的混合物可以是两种或更多种不同物质的均质混合物，例如，该混合物可以在混合物的任何给定样品中具有相同比例的其组分(例如，两种或更多种物质)。在一些情况下，如本文所提供的混合物可以是两种或更多种不同物质的异质混合物，例如混合物的组分(例如两种或更多种物质)的比例可在整个混合物中变化。在一些情况下，混合物是液体溶液，例如混合物以液相存在。在一些情况下，液体溶液可被视为包含液体溶剂和溶质。在液体溶剂中混合溶质可称为“溶解”过程。在一些情况下，液体溶液是液体在液体中的溶液(例如，液体溶质溶解在液体溶剂中)、固体在液体中的溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)、或气体在液体中的溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)。在一些情况下，存在多于一种溶剂和/或多于一种溶质。在一些情况下，混合物是胶体、液体悬浮液或乳液。在一些情况下，混合物是固体混合物，例如混合物以固相存在。
[0030]
如本文所用，术语“细胞渗透剂”意指当与细胞接触时促进进入细胞的试剂。在一些情况下，细胞渗透剂促进细胞膜的直接渗透，例如，经由与细胞膜的带负电荷的磷脂的直接静电相互作用，或通过诱导膜蛋白或磷脂双层的构型变化的瞬时孔形成。在一些情况下，细胞渗透剂促进胞吞作用介导的易位至细胞中。例如，在某些情况下，细胞渗透剂可以刺激细胞经历胞吞过程，由此细胞膜可以向内折叠到细胞中。在某些实施例中，细胞渗透剂有助于形成跨细胞膜转运的暂时性结构。不希望受特定理论的束缚，如本文所提供的细胞渗透剂可以增加细胞膜的渗透性或增加分子内化到细胞膜中，其结果是，当细胞与细胞渗透剂同时接触时，与不含细胞渗透剂的其他方面相同的递送相比，递送至细胞中可以更有效。
[0031]
如本文所用，术语“有效负载”意指由如本文所披露的多核糖核苷酸递送的任何分子。在一些情况下，有效负载是核酸、蛋白、化学品、核糖核蛋白或其任何组合。在一些情况下，有效负载是直接包含在如本文所披露的多核糖核苷酸内的核酸序列。在一些情况下，有效负载例如经由互补杂交或经由蛋白
‑
核酸相互作用与如本文所披露的多核糖核苷酸附接或缔合。在某些情况下，有效负载是由包含在多核糖核苷酸内、附接于多核糖核苷酸或与多核糖核苷酸缔合的核酸序列编码的蛋白。在一些情况下，“附接”意指两个分子之间的共价键或非共价相互作用。在一些情况下，当在有效负载与多核糖核苷酸之间的相互作用的背景下使用时，“缔合”可以意指有效负载与多核糖核苷酸经由其间的一个或多个其他分子间接连接。在一些情况下，附接或缔合可以是瞬时的。在一些情况下，有效负载在一种条件下与多核糖核苷酸附接或缔合，但在另一种条件下不与多核糖核苷酸附接或缔合，例如，取决于环境ph条件或者存在或不存在刺激或结合伴侣。
[0032]
如本文所用，术语“醇”意指其中羟基官能团(
‑
oh)与碳结合的任何有机化合物。如本文所述的醇可以包括但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇和脂环族醇。在一些情况下，醇可以指乙醇。在一些情况下，醇可以包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
‑
生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。
[0033]
如本文所用，术语受试者身体的“表面区域”是指受试者的暴露于外部环境的或具有暴露于外部环境的可能性的任何区域。受试者身体(例如哺乳动物身体，例如人体)的表面区域包括皮肤、指甲、毛发、睫毛以及耳腔和眼睛的表面区域。在一些情况下，受试者身体的表面区域通常可以指上皮细胞排列在其下方的外部区域。例如，皮肤可以是如本文所讨论的一种类型的表面区域，并且可以由表皮和真皮组成，表皮形成皮肤的最外层并且可以包括上皮细胞在许多其他类型的细胞中的有组织的组装。
[0034]
如本文所用，术语“局部递送”意指将物质递送至皮肤或可通过非侵入性方式接近的上皮层。通常，美容组合物的局部递送具有对受试者具有局部作用，例如，局部递送的美容组合物在递送美容组合物的身体特定部位(例如皮肤)处或其附近具有药效学作用。
[0035]
如本文所用，术语“美容效果”意指受试者的外皮成员外观的变化。受试者的外皮成员可以包括但不限于皮肤、指甲、毛发、睫毛和其他组织。本文所述的美容效果可以包括受试者外皮成员外观的变化，诸如但不限于改善皮肤外观、增强皮肤年轻化、增加保湿和/或弹性、预防或减少皱纹、使皮肤或毛发变亮或变暗、改变毛发颜色或密度、和/或提供其他
抗衰老护理。
[0036]
如本文所用，术语“表达序列”意指编码产物，例如肽或多肽或调控核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包含多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并被称为“密码子”。
[0037]
如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。
[0038]
如本文使用的，术语“基本上对
……
有抗性”可以指相较于参考物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。
[0039]“多肽”和“蛋白”可互换使用并且意指通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。如本文所述的多肽可以包括全长蛋白(例如，完全加工的蛋白)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白的片段或合成的多肽片段)。多肽可以包括天然存在的氨基酸(例如，天然合成的肽中常见并且已知以一个字母缩写(a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v)的二十种氨基酸之一)和非天然存在的氨基酸(例如，不是天然合成的肽中常见的二十种氨基酸之一的氨基酸)，包括合成的氨基酸、氨基酸类似物、经修饰的氨基酸和氨基酸模拟物)。
[0040]
如本文所用，术语“载体”意指通过环状多核糖核苷酸的共价修饰、经由部分或完全包封剂或其组合促进组合物(例如环状多核糖核苷酸)转运或递送至细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载体的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白)或阳离子载体(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。
[0041]
如本文所用，术语“裸递送”或“裸rna”意指用于递送至细胞的rna配制品，其不借助于载体并且不对有助于递送至细胞的部分进行共价修饰。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体或蛋白载体。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含未经共价修饰的环状多核糖核苷酸且不含载体的配制品。如本文所用，术语“稀释剂”意指包含无活性溶剂的美容上可接受的媒介物，本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解在其中。稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲剂、等渗剂或其混合物。美容上可接受的稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙烯乙二醇、1,3
‑
丁二醇(1,3
‑
butylene glycol)、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、丙三醇、四氢糠醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及1,3
‑
丁二醇(1,3
‑
butanediol)。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。
[0042]
如本文所用，术语“消毒剂”意指抑菌、杀菌和/或主动杀灭微生物、灭活微生物或防止微生物生长的任何试剂。杀灭微生物的消毒剂可以是抗微生物剂和/或防腐剂。在一些实施例中，消毒剂是液体，诸如醇、碘或过氧化氢。在一些实施例中，消毒剂是紫外光或激光。在一些实施例中，消毒剂是通过电或通过其他方式(例如，蒸气、接触)传递的热。
附图说明
[0043]
当结合附图阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的实施例。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。
[0044]
图1说明了一个实例，其中将示例性的线性和环状rna局部递送至小鼠的耳朵皮肤，并在递送后6小时至3天检查它们在耳朵组织中的rna水平。
[0045]
图2a和图2b是总结了在增进剂(boost)(乙醇)的帮助下局部递送线性或环状rna后6小时、1天、3天或12天得自小鼠耳朵打孔样品的qpcr结果的图。图2a显示了使用用于检测线性和环状rna的引物进行的qpcr测定的结果。图2b显示了使用用于检测环状rna而不是线性rna的引物进行的qpcr测定的结果。
[0046]
图3a和图3b是总结了在增进剂(乙醇)和transit mrna剂(米卢斯生物有限责任公司(mirus bio,llc)，一种阳离子、非脂质体聚合物脂质转运剂)两者的帮助下局部递送线性或环状rna后6小时、1天、3天或12天得自小鼠耳朵打孔样品的qpcr结果的图。图3a显示了使用用于检测线性和环状rna的引物进行的qpcr测定的结果。图3b显示了使用用于检测环状rna而不是线性rna的引物进行的qpcr测定的结果。
[0047]
图4说明了使用dmso凝胶(rna)或单独的dmso凝胶(媒介物)局部施用的rna的蛋白表达。
[0048]
图5说明了用强生(johnson&johnson)婴儿润肤露(rna)或单独的强生婴儿润肤露(媒介物)配制的局部施用的rna的蛋白表达。
[0049]
图6说明了使用乙醇(rna)或单独的乙醇(媒介物)的情况下局部施用的rna的蛋白表达。
[0050]
图7显示了局部施用circrna
‑
cy5导致将rna递送至组织的荧光图像(b/w)。
[0051]
图8显示了局部施用circrna
‑
cy5导致将rna递送至组织的荧光图像的定量。
[0052]
图9显示了局部施用mrna
‑
cy5导致将rna递送至组织的荧光图像(b/w)。
[0053]
图10显示了局部施用mrna
‑
cy5导致将rna递送至组织的荧光图像的定量。
[0054]
图11显示了当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用mrna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0055]
图12显示了当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用mrna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0056]
图13显示了当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0057]
图14显示了局部施用与10％乙醇混合的环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0058]
图15显示了局部施用与10％异丙醇混合的环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0059]
图16显示了当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用环状rna导致在施用后第1天和第4天将rna递送至组织。
[0060]
图17显示了局部施用与pbs、pbs和10％乙醇、或pbs和10％异丙醇混合的线性mrna导致在施用后第1天将rna递送至组织，而局部施用与pbs和10％乙醇、或pbs和10％异丙醇
混合的线性mrna导致在施用后第4天将rna递送至组织。
[0061]
图18显示了当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用circrna导致组织中功能性蛋白的表达。
[0062]
图19显示了当circrna与10％乙醇一起施用时，局部施用circrna导致将rna递送至组织。
[0063]
图20显示了当circrna与10％异丙醇一起施用时，局部施用circrna导致将rna递送至组织。
[0064]
图21显示了当在施加前用乙醇擦拭物擦拭皮肤时，局部施用mrna导致将rna递送至组织。
[0065]
图22显示了当mrna仅与pbs一起施用时，局部施用mrna导致将rna递送至组织。
[0066]
图23显示了当mrna与10％异丙醇一起施用时，局部施用mrna导致将rna递送至组织。
具体实施方式
[0067]
本披露整体涉及多核糖核苷酸的组合物、制剂和递送及其在美容用途方面的应用。多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸(circrna)或其组合。多核糖核苷酸可以包含有效负载。有效负载可以是美容有效负载，诸如编码具有美容效果的任何蛋白或肽的序列。在一些方面，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。
[0068]
在一些方面，本披露提供了用于将多核糖核苷酸递送至细胞的组合物和方法。在一些情况下，本文提供的组合物和方法将多核糖核苷酸递送到细胞中以改变受试者的表面区域的外观，诸如受试者的外皮系统的成员。在某些实施例中，本文提供的组合物和方法特别可用于将多核糖核苷酸局部递送至受试者的细胞中。
[0069]
本文披露的组合物可以包括美容多核糖核苷酸和醇(例如乙醇)的混合物。本文披露的方法可以包括在包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物的组合物中递送多核糖核苷酸。在一些方面，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包括美容多核糖核苷酸和用于将多核糖核苷酸递送到细胞中的醇。在一些实施例中，该试剂盒包括消毒剂。
[0070]
本文披露的组合物可以包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物。本文披露的方法可以包括在包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物的组合物中递送多核糖核苷酸。在一些方面，本披露提供了包含美容多核糖核苷酸和用于将多核糖核苷酸递送至细胞中的细胞渗透剂的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括消毒剂。
[0071]
在一些实施例中，将本文所述的美容组合物直接施用至表面区域(例如，局部表面区域或外皮成员)。在一些实施例中，本文所述的美容组合物在施加消毒剂后施加至受试者的表面区域。
[0072]
本文提供的组合物、方法和试剂盒可以提供简单有效的将多核糖核苷酸递送至细胞中的解决方案。与不存在醇或细胞渗透剂相比，在存在醇或细胞渗透剂的情况下，多核糖核苷酸可以更有效地递送至细胞中。在一些情况下，与不存在醇或细胞渗透剂的情况下的多核苷酸递送效率相比，本文所述的醇或细胞渗透剂可使多核苷酸递送效率增加至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、
250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、8000％、10,000％、20,000％或50,000％。用于多核糖核苷酸递送的组合物
[0073]
在一些方面，本披露提供了用于递送多核糖核苷酸的组合物或美容组合物。多核糖核苷酸可以包含有效负载，诸如美容有效负载。美容有效负载可以是具有美容效果的任何蛋白或肽。在一些方面，美容有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。组合物或美容组合物可以包含用于将多核糖核苷酸递送至细胞的醇(例如乙醇)。这些组合物或美容组合物可以包含细胞渗透剂。细胞渗透剂被配置成增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0074]
在一些情况下，本文提供的组合物或美容组合物适用于美容应用，例如，多核糖核苷酸是当将组合物施用给受试者时具有美容效果的美容多核糖核苷酸。在一些方面，多核糖核苷酸编码用于治疗或护理皮肤、毛发、指甲或睫毛的美容蛋白。
[0075]
在一些方面，本披露提供了美容组合物和施用本文所述的组合物或美容组合物的方法。在一些实施例中，将本文所述的组合物或美容组合物直接施用至表面区域(例如，局部表面区域或外皮成员)。在一些实施例中，本文所述的组合物或美容组合物在施加消毒剂后施加至受试者的表面区域(例如外皮成员)。
[0076]
这些组合物或美容组合物可以包含细胞渗透剂和多核糖核苷酸。细胞渗透剂被配置成增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，本文提供的组合物适用于美容应用，例如，多核糖核苷酸是当将组合物施用给受试者时具有美容效果的美容多核糖核苷酸。在一些方面，本披露提供了美容组合物和施用本文所述的美容组合物的方法。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。醇
[0077]
如本文所述的醇可以用于将多核糖核苷酸(例如，美容多核糖核苷酸)递送到细胞中。醇可以与如本文所述的多核糖核苷酸混合，用于将多核糖核苷酸递送至细胞中。该混合物可以包含至少约0.3％v/v至约75％v/v的醇。该醇可以是乙醇。在一些实施例中，将混合物施加至受试者的表面区域。在一些实施例中，该混合物是美容组合物。
[0078]
醇可以是包含一个或多个羟基官能团的任何醇。在一些情况下，醇是但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇或脂环族醇。醇可以包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇、变性醇、苯甲醇，特别是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸和羟乙基纤维素中的一种或多种。在某些实施例中，醇是乙醇。
[0079]
在其他情况下，本文提供的组合物、美容组合物和方法仅包括醇而不具有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，醇是乙醇，并且组合物、美容组合物和方法不具有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，醇是细胞渗透剂。在一些情况下，醇不是细胞渗透剂。
[0080]
本文披露的组合物可以包括醇和多核糖核苷酸的混合物。在一些情况下，多核糖核苷酸存在于与醇的预混合混合物中。在一些情况下，多核糖核苷酸在与细胞接触之前与醇分开提供。在这些情况下，多核糖核苷酸在施加至细胞时与醇接触，并混合在一起以将多
核糖核苷酸递送至细胞中。不受特定理论的束缚，混合物中醇的浓度可以有助于递送效率。因此，在一些情况下，在混合物中以预定的浓度提供醇。在一些其他情况下，当醇和多核糖核苷酸最初是分开的，但当施加以用于递送时混合在一起时，醇以相对于多核糖核苷酸足够的量提供，该量将确保其在混合物中达到最小预定浓度。
[0081]
在一些情况下，醇占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％体积比(v/v)。在一些情况下，醇占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。
[0082]
在一些情况下，醇占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％重量比(w/w)。在一些情况下，醇占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％w/w。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％w/w。在一些情况下，醇占混合物的约10％v/v。
[0083]
在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v，或其间的任何百分比v/v。在一些实施例中，醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v，或其间的任何百分比v/v。
[0084]
在一些情况下，本文所述的混合物是液体溶液。例如，醇本身是液体物质。在这些情况下，多核糖核苷酸也可以溶解在液体溶液中。
[0085]
在一些情况下，乙醇占混合物的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％体积比(v/v)。在一些情况下，乙醇占混合物的至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％v/v。
[0086]
在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v，或其间的任何百分比v/v。在一些实施例中，乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v，或其间的任何百分比v/v。细胞渗透剂
[0087]
本文所述的细胞渗透剂可以包括增强将多核糖核苷酸递送至细胞中的任何物质。细胞渗透剂可以包括有机化合物或无机分子。在一些情况下，细胞渗透剂是具有一个或多个官能团的有机化合物，诸如但不限于烷烃、烯烃和芳烃；卤素取代的烷烃、烯烃和芳烃；醇、酚(苯的衍生物)、醚、醛、酮和羧酸；胺和腈。在一些实施例中，细胞渗透剂可溶于极性溶剂。在一些实施例中，细胞渗透剂不溶于极性溶剂。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0088]
细胞渗透剂可以包括有机化合物，诸如具有一个或多个羟基官能团的醇。在一些情况下，细胞渗透剂包括醇，诸如但不限于一元醇、多元醇、不饱和脂族醇和脂环族醇。细胞渗透剂可以包括以下一种或多种：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
‑
生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在某些实施例中，细胞渗透剂包括乙醇。
[0089]
在其他情况下，本文提供的组合物和方法仅包括醇作为细胞渗透剂，而不具有或不使用任何其他试剂来增强多核糖核苷酸向细胞中的递送。在一些情况下，细胞渗透剂包括乙醇和可增强多核糖核苷酸递送至细胞中的任何其他醇。在一些情况下，细胞渗透剂包括乙醇和可增强多核糖核苷酸递送至细胞中的任何其他有机或无机分子。在一些情况下，细胞渗透剂包括乙醇和脂质体或纳米颗粒，诸如在国际公开号wo 2013006825、wo 2016036735、wo 2018112282 a1和wo 2012031043 a1中描述的那些，其各自通过援引以其全文并入本文。在一些情况下，细胞渗透剂包括乙醇和细胞渗透肽或蛋白，诸如以下文献中
描述的那些：bechara等人,cell
‑
penetrating peptides:20 years later,where do we stand？[细胞渗透肽：20年后，我们在哪里？]febs letters[欧洲生化学会联合会快报]587(12):1693
‑
1702(2013)；langel,cell
‑
penetrating peptides:processes and applications[细胞渗透肽：过程和应用](佛罗里达州波卡拉顿crc出版社(crc press,boca raton fl,2002))；el
‑
andaloussi等人,curr.pharm.des.[当今药物设计]11(28):3597
‑
611(2003)；deshayes等人,cell.mol.life sci.[细胞和分子生命科学]62(16):1839
‑
49(2005)；美国专利公开号us20130129726、us20130137644和us20130164219，其各自通过援引以其全文并入本文)。在一些情况下，乙醇与其他细胞渗透剂的比率为约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250、1:500或1:1000。在一些情况下，乙醇与其他细胞渗透剂的比率为至少约1:0.001、1:0.002、1:005、1:008、1:0.01、1:0.02、1:0.05、1:0.08、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:120、1:150、1:200、1:250或1:500。
[0090]
本文披露的组合物可以包含细胞渗透剂和多核糖核苷酸的混合物。在一些情况下，多核糖核苷酸存在于与细胞渗透剂预混合的混合物中。在一些情况下，多核糖核苷酸在与细胞接触之前与细胞渗透剂分开提供。在这些情况下，多核糖核苷酸与细胞渗透剂在施加至细胞时接触，并混合在一起以将多核糖核苷酸递送至细胞中。不受特定理论的束缚，混合物中细胞渗透剂的浓度可有助于递送效率。因此，在一些情况下，在混合物中以预定浓度提供细胞渗透剂。在一些其他情况下，当细胞渗透剂和多核糖核苷酸最初是分开的，但当施加以用于递送时混合在一起时，细胞渗透剂以相对于多核糖核苷酸足够的量提供，该量将确保其在混合物中达到最小预定浓度。
[0091]
在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％体积比(v/v)。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。
[0092]
在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约
0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％重量比(w/w)。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的至多约0.01％、至多约0.02％、至多约0.03％、至多约0.04％、至多约0.05％、至多约0.06％、至多约0.07％、至多约0.08％、至多约0.09％、至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％w/w。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约98％w/w。在一些情况下，细胞渗透剂占混合物的约10％v/v。
[0093]
在一些情况下，本文所述的混合物是液体溶液。例如，细胞渗透剂本身是液体物质。替代性地，细胞渗透剂是固体、液体或气体物质并溶解在液体载体例如水中。在这些情况下，多核糖核苷酸也可以溶解在液体溶液中。
[0094]
在一些情况下，乙醇占混合物的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％体积比(v/v)。在一些情况下，乙醇占混合物的至多约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％v/v。在一些情况下，乙醇占混合物的约10％v/v。多核糖核苷酸
[0095]
本披露的方面涉及用于将多核糖核苷酸例如美容多核糖核苷酸递送到细胞中的组合物和方法。多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸。在一些情况下，美容多核糖核苷酸对施用多核糖核苷酸的受试者的外皮成员的外观具有美容效果。受试者的外皮成员可以包括但不限于皮肤、睫毛、指甲和毛发。本披露的方面提供了包含美容多核糖核苷酸的美容组合物，当通过局部施用将组合物递送到受试者的细胞中时，这些美容组合物对受试者具有美容效果。如本文所述的多核糖核苷酸可以与醇(例如乙醇)在美容组合物中混合。多核糖核苷酸可以与细胞渗透剂混合。如本文所述的多核糖核苷酸可以与美容上可接受的稀释剂在不含任何载体的美容组合物中混合。
[0096]
多核糖核苷酸可以包括表达产物的序列。来自多核糖核苷酸的序列的表达和/或多核糖核苷酸与靶标的结合可以具有多种美容效果。在一些情况下，多核糖核苷酸调节细胞功能，例如瞬时或长期调节。在某些实施例中，美容细胞功能发生稳定地改变，例如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，美容细胞功能发生瞬时地改变，例如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10
小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0097]
多核糖核苷酸可以是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸或至少约1,000个核苷酸。在一些情况下，多核糖核苷酸具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点，用于从多核糖核苷酸表达序列。本领域技术人员可以理解，线性或环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生线性或环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。在一些情况下，本文提供的线性或环状多核糖核苷酸的最大大小可受包装和递送rna至靶标的能力的限制。在一些情况下，多核糖核苷酸的大小是足以编码有用多肽的长度，并且因此小于约20,000个核苷酸、小于约15,000个核苷酸、小于约10,000个核苷酸、小于约7,500个核苷酸、或小于约5,000个核苷酸、小于约4,000个核苷酸、小于约3,000个核苷酸、小于约2,000个核苷酸、小于约1,000个核苷酸、小于约500个核苷酸、小于约400个核苷酸、小于约300个核苷酸、小于约200个核苷酸、小于约100个核苷酸的长度可能是有用的。
[0098]
本文提供的多核糖核苷酸可以相对于参考序列，特别是亲本多核糖核苷酸具有一个或多个修饰，诸如取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、切割、聚腺苷酸化、剪接、聚a序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。多核糖核苷酸可以包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：吡啶
‑4‑
酮核糖核苷、5
‑
氮杂
‑
尿苷、2
‑
硫代
‑5‑
氮杂
‑
尿苷、2
‑
硫尿苷、4
‑
硫代
‑
假尿苷、2
‑
硫代
‑
假尿苷、5
‑
羟基尿苷、3
‑
甲基尿苷、5
‑
羧基甲基尿苷、1
‑
羧基甲基
‑
假尿苷、5
‑
丙炔基尿苷、1
‑
丙炔基
‑
假尿苷、5
‑
牛磺酸基甲基尿苷、1
‑
牛磺酸基甲基假尿苷、5
‑
牛磺酸基甲基
‑2‑
硫代
‑
尿苷、1
‑
牛磺酸基甲基
‑4‑
硫代
‑
尿苷、5
‑
甲基
‑
尿苷、1
‑
甲基
‑
假尿苷、4
‑
硫代
‑1‑
甲基
‑
假尿苷、2
‑
硫代
‑1‑
甲基
‑
假尿苷、1
‑
甲基_1_去氮_假尿苷、2
‑
硫代
‑1‑
甲基
‑1‑
去氮
‑
假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2
‑
硫代
‑
二氢尿苷、2
‑
硫代
‑
二氢假尿苷、2
‑
甲氧基尿苷、2
‑
甲氧基
‑4‑
硫代
‑
尿苷、4
‑
甲氧基
‑
假尿苷和4
‑
甲氧基
‑2‑
硫代
‑
假尿苷。在一些情况下，mrna包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：5
‑
氮杂
‑
胞苷、假异胞苷、3
‑
甲基
‑
胞苷、n4
‑
乙酰基胞苷、5
‑
甲酰基胞苷、n4
‑
甲基胞苷、5
‑
羟基甲基胞苷、1
‑
甲基
‑
假异胞苷、吡咯并
‑
胞苷、吡咯并
‑
假异胞苷、2
‑
硫代
‑
胞苷、2
‑
硫代
‑5‑
甲基
‑
胞苷、4
‑
硫代
‑
假异胞苷、4
‑
硫代
‑1‑
甲基
‑
假异胞苷、4
‑
硫代
‑1‑
甲基
‑1‑
去氮
‑
假异胞苷、1
‑
甲基
‑1‑
去氮
‑
假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5
‑
氮杂
‑
折布拉林、5
‑
甲基
‑
折布拉林、5
‑
氮杂
‑2‑
硫代
‑
折布拉林、2
‑
硫代
‑
折布拉林、2
‑
甲氧基
‑
胞苷、2
‑
甲氧基
‑5‑
甲基
‑
胞苷、4
‑
甲氧基
‑
假异胞苷和4
‑
甲氧基
‑1‑
甲基
‑
假异胞苷。在一些情况下，mrna包含选自由以下组成的组的至少一种核苷：2
‑
氨基嘌呤、2,6
‑
二氨基嘌呤、7
‑
去氮
‑
腺嘌呤、7
‑
去氮
‑8‑
氮杂
‑
腺嘌呤、7
‑
去氮
‑2‑
氨基嘌呤、7
‑
去氮
‑8‑
氮杂
‑2‑
氨基嘌呤、7
‑
去氮
‑
2,6
‑
二氨基嘌呤、7
‑
去氮
‑8‑
氮杂
‑
2,6
‑
二氨基嘌呤、1
‑
甲基腺苷、n6
‑
甲基腺苷、n6
‑
异戊烯基腺苷、n6
‑
(顺式
‑
羟基异戊烯基)腺苷、2
‑
甲基硫代
‑
n6
‑
(顺式
‑
羟基异戊烯基)腺苷、n6
‑
甘氨酰氨甲酰基腺苷、n6
‑
苏氨酰氨甲酰基腺苷、2
‑
甲基硫代
‑
n6
‑
苏氨酰氨甲酰基腺苷、n6,n6
‑
二甲基腺苷、7
‑
甲基腺嘌呤、2
‑
甲基硫代
‑
腺嘌呤和2
‑
甲氧基
‑
腺嘌呤。在一些情况下，mrna包含选自由以下组成的组
的至少一种核苷：1
‑
甲基
‑
肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7
‑
去氮
‑
鸟苷、7
‑
去氮
‑8‑
氮杂
‑
鸟苷、6
‑
硫代
‑
鸟苷、6
‑
硫代
‑7‑
去氮
‑
鸟苷、6
‑
硫代
‑7‑
去氮
‑8‑
氮杂
‑
鸟苷、7
‑
甲基
‑
鸟苷、6
‑
硫代
‑7‑
甲基
‑
鸟苷、7
‑
甲基肌苷、6
‑
甲氧基
‑
鸟苷、1
‑
甲基鸟苷、n2
‑
甲基鸟苷、n2,n2
‑
二甲基鸟苷、8
‑
氧代
‑
鸟苷、7
‑
甲基
‑8‑
氧代
‑
鸟苷、1
‑
甲基
‑6‑
硫代
‑
鸟苷、n2
‑
甲基
‑6‑
硫代
‑
鸟苷和n2,n2
‑
二甲基
‑6‑
硫代
‑
鸟苷。在一些实施例中，多核糖核苷酸缺少帽。在一些实施例中，多核糖核苷酸缺少聚a尾。在一些实施例中，多核糖核苷酸是非免疫原性的。在一些实施例中，多核糖核苷酸是免疫原性的。
[0099]
多核糖核苷酸可以包括任何有用的修饰，诸如针对糖、核碱基或核苷间键(例如针对连接的磷酸/针对磷酸二酯键/针对磷酸二酯骨架)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna)或其杂交体的核糖核酸(rna)修饰。本文描述了其他修饰。
[0100]
不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键合(例如骨架结构)可以存在于本文提供的多核糖核苷酸中的不同位置。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于多核糖核苷酸的任何一个或多个位置，使得多核糖核苷酸的功能基本上不降低。环状多核糖核苷酸可包含约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％>、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％到80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。
[0101]
在一些情况下，混合物中多核糖核苷酸的浓度为至少约0.1ng/ml、至少约0.2ng/ml、至少约0.5ng/ml、至少约1ng/ml、至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约20ng/ml、至少约50ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约30μg/ml、至少约40μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约1mg/ml、至少约2mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml。在一些情况下，混合物中多核糖核苷酸的浓度为至多约0.1ng/ml、至多约0.2ng/ml、至多约0.5ng/ml、至多约1ng/ml、至多约5ng/ml、至多约10ng/ml、至多约20ng/ml、至多约50ng/ml、至多约100ng/ml、至多约200ng/ml、至多约500ng/ml、至多约1μg/ml、至多约2μg/ml、至多约3μg/ml、至多约4μg/ml、至多约5μg/ml、至多约10μg/ml、至多约20μg/ml、至多约30μg/ml、至多约40μg/ml、至多约50μg/ml、至多约100μg/ml、至多约200μg/ml、至多约300μg/ml、至多约400μg/ml、至多约500μg/ml、至多约1mg/ml、至多约2mg/ml、至多约5mg/ml、至多约10mg/ml、至多约20mg/ml、至多约50mg/ml、或至多约100mg/ml。
[0102]
在一些情况下，混合物中多核糖核苷酸的浓度为约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.5ng/ml、约1ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约20ng/ml、约50ng/ml、约100ng/ml、约200ng/ml、约500ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约30μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml、约50mg/ml、或约100mg/ml。
[0103]
组合物可以包含多核糖核苷酸和醇(例如乙醇)。在某些特定的实施例中，组合物包含线性多核糖核苷酸和醇。在某些特定的实施例中，组合物包含环状多核糖核苷酸(circrna)和醇。由于环状结构，与相应的线性rna相比，circrna具有改善的稳定性、延长的半衰期、降低的免疫原性和/或改善的功能性(例如，本文所述的功能)。
[0104]
组合物可以包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂。在某些特定的实施例中，组合物包含线性多核糖核苷酸和细胞渗透剂。在某些特定的实施例中，组合物包含环状多核糖核苷酸(circrna)和细胞渗透剂。由于环状结构，与相应的线性rna相比，circrna具有改善的稳定性、延长的半衰期、降低的免疫原性和/或改善的功能性(例如，本文所述的功能)。
[0105]
在一些情况下，本文提供的环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些情况下，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些情况下，半衰期延长约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更长。在一些情况下，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。有效负载和美容效果
[0106]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含至少一种可以对多核糖核苷酸被递送到的受试者具有美容效果的有效负载。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。有效负载可以是美容有效负载。美容有效负载可以是在施用给细胞、组织或外皮成员后具有美容效果的任何有效负载。有效负载可以是多核糖核苷酸中负责表达产物的一个或多个序列。在一些实施例中，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。
[0107]
美容有效负载可以是施用后具有美容效果的任何蛋白或肽。例如，美容有效负载可以是胶原蛋白或其片段、弹性蛋白或其片段、纤连蛋白或其片段、角蛋白或其片段、肉毒杆菌毒素或其片段、α
‑
黑素细胞刺激激素的片段。美容有效负载可以是任何细胞外基质蛋白或其片段。在一些实施例中，美容有效负载是具有美容效果的任何生物活性肽，诸如棕榈酰
‑
kttks肽、gekg肽或包含kek基序的肽。生物活性肽是一种包含短氨基酸序列(5
‑
20个氨基酸)的肽，该序列来源于对整个身体内的内源性蛋白的酶促加工(例如，来源于皮肤中的
细胞外基质蛋白)。具有美容效果的生物活性肽可以是调节美容细胞功能(例如调节胶原蛋白或黑色素稳态)的任何肽。在一些实施例中，美容有效负载是载体肽(诸如铜肽或x
‑
50myocept)，该载体肽携带微量元素，诸如锰和铜。由载体肽调节的美容效果可以是皮肤抗衰老。在一些实施例中，美容有效负载是神经递质抑制肽，诸如xep
‑
30、棕榈酰三肽
‑
38、棕榈酰四肽
‑
28阿基瑞林(argirelin)和蛇毒血清(syn
‑
ake)。由神经递质抑制肽调节的美容效果可以减少表情线皱纹。在一些实施例中，美容有效负载是酶抑制肽，诸如trylagen、三氟乙酰三肽
‑
2、丝素肽和大豆肽。由酶抑制剂调节的美容效果可以是抗衰老。在一些实施例中，美容有效负载是信号肽，诸如棕榈酰寡肽
‑
7、铜肽、棕榈酰五肽
‑
4和matrixyl
‑
3000。由信号肽调节的美容效果可以是抗衰老。
[0108]
在一些情况下，有效负载在施用后对受试者具有美容效果。多核糖核苷酸具有的美容效果可以包括改变受试者的外皮成员的外观，诸如但不限于改善皮肤外观、增强皮肤年轻化、增加保湿和/或弹性、预防或减少皱纹、使皮肤或毛发变亮或变暗、改变毛发颜色或密度、和/或提供其他抗衰老护理。表达序列
[0109]
在一些情况下，如本文所述的多核糖核苷酸包含至少一个编码肽或多肽的表达序列。如本文所述的多核糖核苷酸包含至少一种编码具有美容效果的肽或多肽的表达序列。该肽可以包括但不限于蛋白、小肽、拟肽(例如类肽)、氨基酸和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。肽可以具有小于约500,000克/摩尔的分子量、小于约200,000克/摩尔的分子量、小于约100,000克/摩尔的分子量、小于约50,000克/摩尔的分子量、小于约20,000克/摩尔的分子量、小于约10,000克/摩尔的分子量、小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量，以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。目的多肽可以包括例如完整多肽、多种多肽或多肽片段，其可以独立地由一种或多种核酸、多种核酸、核酸片段或任何前述核酸的变体编码。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0110]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含编码美容蛋白的表达序列，该美容蛋白可有助于改变受试者的外皮成员的外观，诸如但不限于皮肤、毛发、睫毛、指甲和其他组织。美容蛋白的一些实例可以包括但不限于蛋白替代品(例如，表达因衰老而降低的蛋白的替代品)、蛋白补充品、激素、细胞因子、细胞重编程/转分化因子、转录因子。在一些实施例中，蛋白是美容蛋白，诸如毛发、皮肤或指甲蛋白。
[0111]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以编码位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达产物的量相比，调控元件可以增加表达产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一种调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。多个调控元件是本领域普通技术人员众所周知的。
[0112]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些情况下，翻译起始序列是科扎克或夏因
‑
达尔加诺(shine
‑
dalgarno)序列。
[0113]
在一些情况下，多核糖核苷酸起始于不是第一起始密码子的密码子，例如aug。多核糖核苷酸的翻译可以起始于替代的翻译起始序列，例如但不限于acg、agg、aag、ctg/cug、
gtg/gug、ata/aua、att/auu、ttg/uug。在一些情况下，翻译由真核起始因子4a(eif4a)起始。在其他实施例中，翻译从多核糖核苷酸的内部核糖体进入位点(ires)元件起始。ires元件可以包含能够接合真核核糖体的rna序列。在一些情况下，ires元件为至少约5nt、至少约8nt、至少约9nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约40nt、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约350nt或至少约500nt。在一个实施例中，ires元件衍生自生物体的dna，该生物体包括但不限于病毒、哺乳动物和果蝇。此类病毒dna可以衍生自但不限于小核糖核酸病毒互补dna(cdna)、脑心肌炎病毒(emcv)cdna和脊髓灰质炎病毒cdna。在一个实施例中，衍生ires元件的果蝇dna包括但不限于来自黑腹果蝇(drosophila melanogaster)的触角足基因。
[0114]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列并且每个表达序列可以或可以不具有终止元件。在一些情况下，多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列并且表达序列缺少终止元件。在一些实施例中，多核糖核苷酸是缺少终止元件的环状多核糖核苷酸，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。在一些情况下，多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的端部包括终止元件。在一些情况下，一个或多个表达序列缺少终止元件。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如uaa、uga、uag。
[0115]
多核糖核苷酸可以包含例如修饰内源基因和/或外源基因的表达的调控核酸。在一些情况下，多核糖核苷酸包含一个或多个编码(例如，互补于)调控核酸的表达序列。调控核酸可以包括但不限于非编码rna，诸如但不限于trna、lncrna、mirna、rrna、snrna、微rna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、y rna和hnrna。
[0116]
在一个实例中，调控核酸靶向宿主基因。调控核酸可以包括但不限于与内源基因杂交的核酸(例如，如本文其他地方所述的mirna、sirna、mrna、lncrna、rna、dna、反义rna、grna)、与外源核酸(例如病毒dna或rna)杂交的核酸、与rna杂交的核酸、干扰基因转录的核酸、干扰rna翻译的核酸、稳定rna或去稳定rna的核酸(例如通过靶向降解)，以及调节dna或rna结合因子的核酸。在一个实施例中，序列是mirna。
[0117]
多核糖核苷酸可以编码与内源基因或基因产物(例如，mrna)的全部或片段基本上互补或完全互补的调控核酸。调控核酸可以与内含子和外显子之间的边界处的、外显子之间的、或邻近外显子的序列互补，从而防止特定基因的新生成的核rna转录物成熟为用于转录的mrna。与特定基因互补的调控核酸可与该基因的mrna杂交并阻止其翻译。反义调控核酸可以是dna、rna或其衍生物或杂交体。在一些情况下，调控核酸包含与参与内源基因或外源基因表达调控的蛋白结合的蛋白结合位点。
[0118]
在一些情况下，如本文所提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸。在一些情况下，如本文所提供的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于参考物的翻译效率至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％或更高。在一些情况下，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率10％。在一些情况下，环状多核糖核苷酸的翻译效率高于线性对应物的翻译效率300％。
[0119]
在一些情况下，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地
以基本上相等的比率产生表达产物。在一些情况下，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上相等的比率产生。在一些情况下，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。
[0120]
在一些情况下，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些情况下，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些情况下，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。
[0121]
在一些情况下，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译得出(“连续”表达产物)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含交错元件(stagger element)(例如，在翻译期间引起核糖体停顿的元件)，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致产生由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译产生的多肽产物(允许产生“离散”表达产物)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸被配置成使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些情况下，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些情况下，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些情况下，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。
[0122]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含非翻译区(utr)。包含基因的基因组区域的utr可以转录但不翻译。在一些情况下，utr可以在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些情况下，utr可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个utr与第二表达序列的另一个utr相同、连续或重叠。在一些情况下，内含子是人内含子。在一些情况下，内含子是全长人内含子，例如zkscan1。
[0123]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含内嵌有一段或多段腺苷和尿苷的utr。这些au富集签名可能会增加表达产物的转化率。
[0124]
utr au富集元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。工程化特定的多核糖核苷酸时，可以将are的一个或多个拷贝引入多核糖核苷酸中，并且are的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对are进行识别和去除或工程化至多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白的翻译和产生。
[0125]
应当理解，可以将来自任何基因的任何utr掺入多核糖核苷酸的相应侧翼区中。作为一个非限制性实例，可以掺入的utr或其片段是在美国临时申请号us 61/775,509和us 61/829,372或国际专利申请号pct/us2014/021522中列出的utr；其各自的内容通过援引以其全文并入本文。此外，可以使用任何已知基因的多个野生型utr。提供不是野生型基因的
变体的人工utr也在本发明的范围内。这些utr或其部分可以放置在与选择它们的转录物中相同的方向，或者可以改变方向或位置。因此，可以将5'或3'utr反向、缩短、加长、与一个或多个其他5'utr或3'utr制成嵌合体。如本文所用，与utr序列有关时，术语“改变的”是指utr已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，3'或5'utr可以通过如上所传授的方向或位置的更改相对于野生型或天然utr改变，或者可以通过额外核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变。这些产生“改变的”utr的任何更改(无论是3'还是5')都包含变体utr。
[0126]
在一个实施例中，可以使用双、三或四utr，如5'或3'utr。如本文所用，“双”utr是其中相同utr的两个拷贝被串联或基本上串联地编码的一种情况。例如，可以如美国专利公开号20100129877中所述使用双β球蛋白3'utr，该专利的内容通过援引以其全文并入本文。
[0127]
在一些情况下，多核糖核苷酸可以包括聚a序列。在一些情况下，聚a序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚a序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些情况下，聚a序列是约10个至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000)。
[0128]
在一个实施例中，相对于整个多核糖核苷酸的长度设计聚a序列。该设计可以基于编码区的长度、特定特征或区域(如第一或侧翼区)的长度，或者基于多核糖核苷酸表达的最终产物的长度。在本文中，聚a序列的长度可以比环状多核糖核苷酸或其特征长10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。聚a序列也可以设计为其所属的多核糖核苷酸的一部分。在本文中，聚a序列可以是构建体的总长度的或构建体总长度减去聚a序列后的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。进一步，工程化的结合位点和环状多核糖核苷酸与聚a结合蛋白的缀合可以增强表达。
[0129]
在一个实施例中，将多核糖核苷酸设计为包括聚a
‑
g四分体(quartet)。g
‑
四分体可以是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由dna和rna中的富含g的序列形成。在一个实施例中，g
‑
四分体被掺入聚a序列的端部。在一些情况下，聚a
‑
g四分体产生的蛋白产量等于单独使用120个核苷酸的聚a序列所得的蛋白产量的至少75％。
[0130]
在一些情况下，多核糖核苷酸包含聚a、缺少聚a或具有经修饰的聚a以调节多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些情况下，缺少聚a或具有经修饰的聚a的多核糖核苷酸改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性、半衰期、表达效率等。加密原
[0131]
如本文所述，多核糖核苷酸可以包含加密原以减少、逃避或避免细胞先天免疫反应。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。在一些实施例中，与参照化合物触发的免疫反应相比，本文提供的环状多核糖核苷酸导致来自宿主的免疫反应降低，例如，与相应的线
性多核苷酸或包含加密原的线性多核苷酸相比，环状多核糖核苷酸产生降低的免疫反应，与缺少加密原的相应线性多核糖核苷酸相比，环状多核糖核苷酸产生降低的免疫反应。在一些实施例中，多核糖核苷酸的免疫原性比缺少加密原的对应物的免疫原性小。
[0132]
在一些实施例中，多核糖核苷酸在哺乳动物例如人中是非免疫原性的。在一些实施例中，多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
[0133]
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括序列或表达产物。
[0134]
在一些实施例中，包含加密原的多核糖核苷酸具有的半衰期至少是缺乏加密原的对应物的半衰期。在一些实施例中，多核糖核苷酸具有的半衰期相对于对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期延长约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更长。在一些实施例中，多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0135]
在一些实施例中，包含加密原的多核糖核苷酸调节美容细胞功能，例如瞬时或长期调节细胞功能。在某些实施例中，美容细胞功能发生稳定地改变，例如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，美容细胞功能发生瞬时地改变，例如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0136]
在一些实施例中，包含加密原的多核糖核苷酸是至少约20个碱基对、至少约30个碱基对、至少约40个碱基对、至少约50个碱基对、至少约75个碱基对、至少约100个碱基对、至少约200个碱基对、至少约300个碱基对、至少约400个碱基对、至少约500个碱基对或至少约1,000个碱基对。在一些实施例中，包含加密原的多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解的是，包含加密原的多核糖核苷酸的最大大小可以与产生多核糖核苷酸和/或使用多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。
[0137]
在一些实施例中，包含加密原的环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期延长约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29
天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0138]
在一些实施例中，包含加密原的环状多核糖核苷酸调节美容细胞功能，例如瞬时或长期调节细胞功能。在某些实施例中，美容细胞功能发生稳定地改变，例如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，美容细胞功能发生瞬时地改变，例如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0139]
在一些实施例中，包含加密原的环状多核糖核苷酸是至少约20个碱基对、至少约30个碱基对、至少约40个碱基对、至少约50个碱基对、至少约75个碱基对、至少约100个碱基对、至少约200个碱基对、至少约300个碱基对、至少约400个碱基对、至少约500个碱基对或至少约1,000个碱基对。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，可能的是，rna的多个区段可以由dna产生并且其5’自由端和3'自由端退火以产生一“串”rna，当只留有一个5'自由端和一个3'自由端时，该“串”rna最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装rna并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用多肽的长度，并且因此，小于约20,000个碱基对、小于约15,000个碱基对、小于约10,000个碱基对、小于约7,500个碱基对、或小于约5,000个碱基对、小于约4,000个碱基对、小于约3,000个碱基对、小于约2,000个碱基对、小于约1,000个碱基对、小于约500个碱基对、小于约400个碱基对、小于约300个碱基对、小于约200个碱基对、小于约100个碱基对的长度可以是有用的。切割序列
[0140]
在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少一个切割序列。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。在一些实施例中，切割序列与表达序列相邻。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含切割序列，诸如在牺牲型多核糖核苷酸、可切割多核糖核苷酸或自切割多核糖核苷酸中。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含两个或更多个切割序列，导致将多核糖核苷酸分离成多个产物，例如mirna、线性rna、较小的环状多核糖核苷酸等。其他试剂
[0141]
在一些情况下，组合物或美容组合物包含除醇或细胞渗透剂和多核糖核苷酸之外的试剂。例如，除了多核糖核苷酸之外，组合物或美容组合物还可以包含一种或多种活性剂，例如美容剂。在一些情况下，包含一种或多种活性剂(例如美容剂)的组合物可使用一种或多种美容上可接受的载体配制，这些载体包括赋形剂、稀释剂和/或例如促进将一种或多
种活性剂加工成可施用的制剂的助剂。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0142]
在一些情况下，美容组合物进一步包含引起如本文所述的受试者的外皮成员的外观变化的美容剂。美容剂可以包括但不限于甘油、蓖麻(ricinus communis)籽油、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、卵磷脂、辛酸/癸酸甘油三酯、山梨坦橄榄油酸酯、鲸蜡硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、麦角硫因、异山梨醇二辛酸酯、山嵛酸甘油酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙基己酯、二甲基甲硅烷基化硅石、丁二醇、透明质酸钠、厚朴(magnolia officinalis)树皮提取物、依克多因(ectoin)、四己基癸醇抗坏血酸酯、泛醇、氢化蓖麻油、白蜂蜡(cera alba)、巴西棕榈(copernicia cerifera)蜡、pca钠、尿素、海藻糖、三醋精、聚季铵盐
‑
51、磷酸甲基葡萄糖苷、赖氨酸铜/脯氨酸铜、鲸蜡硬脂醇聚醚
‑
20、天冬氨酸镁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸铜、c8
‑
22烷基丙烯酸酯/甲基丙烯酸交联聚合物、鳄梨(persea gratissima)油、角鲨烷、月见草(oenothera biennis)油、香精、尿囊素、硬脂醇甘草亭酸酯、麦芽糊精、生育酚、葡萄(vitis vinifera)籽提取物、黄原胶、精氨酸、库拉索芦荟(aloe barbadensis)叶汁、澳洲胡桃(macadamia ternifolia)籽油、苯氧乙醇、乙基己基甘油、植酸钠和松口蘑(tricholoma matsutake)提取物、环戊硅氧烷、ci 2
‑
15烷基苯甲酸酯、二氧化钛、氧化锌、聚二甲基硅氧烷、聚甘油
‑
3聚二甲基硅羟乙基聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷/peg
‑
10/15交联聚合物、硬脂酸、氢氧化铝、氯化钠、甘油、厚朴(magnolia officinalis)树皮提取物、依克多因、辛甘醇、替普瑞酮、透明质酸钠、葡萄(vitis vinifera)籽提取物、四己基癸醇抗坏血酸酯、麦角硫因、生育酚乙酸酯、生育酚乙酸酯、生育酚、麦芽糖糊精、卵磷脂、棕榈酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、peg/ppg
‑
18/18聚二甲基硅氧烷、聚甘油
‑
3交联聚合物、月桂酸己酯、环己硅氧烷、三乙氧基甲硅烷基乙基聚二甲基甲硅烷氧基乙基己基聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷/乙烯基聚二甲基硅氧烷交联聚合物、聚甘油
‑
4异硬脂酸酯、鲸蜡基peg/ppg
‑
10/1聚二甲基硅氧烷、二甲基甲硅烷基化硅石、三乙氧基辛基硅烷、苯氧基乙醇、乙基己基甘油、丁二醇、己二醇、香精、云母和二氧化硅、壬二酰二甘氨酸钾、金缕梅(hamamelis virginiana)提取物、甘油、甲基葡糖醇聚醚
‑
20、厚朴(magnolia officinalis)树皮提取物、麦角硫因、依克多因、戊二醇、柳树(salix nigra)树皮提取物、天冬氨酸镁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸铜、指橙(microcitrus austraiasica)果提取物、米赫毛霉(mucor miehei)提取物、氨基葡萄糖盐酸盐、尿素、苯氧乙醇、乙基己基甘油、聚山梨醇酯20、厚朴(magnolia glauca)花水、pca钠、山梨酸钾、尿囊素、甘草酸二钾、变性醇、乙二胺四乙酸二钠、乳酸、麦芽糊精、卵磷脂、生育酚、葡萄(vitis vinifera)籽提取物、氢氧化钠、辛酸/癸酸甘油三酯、素方花(jasminum officinale)提取物、突厥蔷薇(rosa damascena)花油、香叶天竺葵(pelargonium graveolens)油、柠檬(citrus medica limonum)皮油、茶树(camellia sinensis)叶提取物、绿薄荷(mentha viridis)叶油和北美圆柏(juniperus virginiana)油。
[0143]
在一些情况下，美容剂包括但不限于五肽
‑
18、乙酰基六肽
‑
8、辛基聚甲基硅氧烷、甘油、丁二醇、β
‑
葡聚糖(燕麦)、异山梨醇二辛酸酯、聚二甲基硅氧烷、异硬脂醇、丁二醇椰油酸酯、聚丙烯酸酯
‑
13、厚朴(magnolia officinalis)树皮提取物、麦角硫因、依克多因、棕榈酰四肽
‑
7、乙酰基四肽
‑
5、四己基癸醇抗坏血酸酯、酪氨酸、橙皮苷甲基查尔酮、松口蘑(tricholoma matsutake)提取物、珊瑚藻(corallina officinalis)提取物、透明质酸钠、硅酸铝钾钠、二氧化硅、普鲁兰多糖、硬脂醇聚醚
‑
20、二肽
‑
2、乙基纤维素、聚山梨醇酯20、
聚异丁烯、聚二甲基硅氧烷醇、泛醇、米(oryza sativa)糠油、卵磷脂、尿囊素、黄原胶、油棕(elaeis guineensis)油、生育三烯酚、生育酚、苯氧乙醇、麦芽糖糊精、葡萄(vitis vinifera)籽提取物、植酸钠、香精、乙基己基甘油、云母和二氧化钛。
[0144]
在一些实施例中，如本文所述的多肽被配制在美容配制品中。美容配制品可以包含以下一种或多种：有机硅、气溶胶、抗氧化剂、清洁剂、着色剂、附加调理剂、沉积剂、电解质、润肤剂和油、去角质剂、泡沫促进剂、香精、湿润剂、闭塞剂、杀虱剂、ph控制剂、颜料、防腐剂、杀菌剂、其他溶剂、稳定剂、防晒剂、悬浮剂、鞣剂、其他表面活性剂、增稠剂、维生素、植物药、蜡、流变改性剂、去屑剂、抗粉刺剂、抗龋齿剂和伤口愈合促进剂。在一些实施例中，美容配制品可以包含磨料、抗粉刺剂、抗皮肤老化剂、溶脂剂、去头屑剂、抗炎剂、刺激预防剂、刺激抑制剂、抗氧化剂、收敛剂、抑汗剂、防腐剂、抗静电剂、粘合剂、缓冲剂、载体材料、螯合剂、细胞刺激剂、清洁剂、护理剂、脱毛剂、表面活性物质、除臭剂、止汗剂、软化剂、乳化剂、酶、精油、纤维、成膜剂、定型剂、发泡剂、泡沫稳定剂、防止起泡的物质、泡沫促进剂、胶凝剂、凝胶形成剂、护发剂、毛发定型剂、直发剂、保湿助剂(moisture
‑
donating agent)、保湿物质、保水物质、漂白剂、增强剂、去污剂、荧光增白剂、浸渍剂、防污剂、减摩剂、润滑剂、保湿霜、软膏、遮光剂、增塑剂、覆盖剂、抛光剂、光泽剂、聚合物、粉末、蛋白、再油剂(re
‑
oiling agent)、研磨剂、有机硅、皮肤舒缓剂、皮肤清洁剂、护肤剂、皮肤修复剂、亮肤剂、皮肤保护剂、皮肤软化剂、毛发促进剂、冷却剂、皮肤冷却剂、温暖剂、暖肤剂、稳定剂、紫外线吸收剂、紫外线过滤剂、洗涤剂、织物调理剂、悬浮剂、晒黑剂、增稠剂、维生素、油、蜡、脂肪、磷脂、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸、α
‑
羟基酸、多羟基脂肪酸、液化剂、染料、颜色保护剂、颜料、防腐蚀剂、香料、调味物质、气味物质、多元醇、表面活性剂、电解质、有机溶剂或有机硅衍生物以及附加助剂和添加剂等。
[0145]
在一些情况下，本文所述的组合物或美容组合物可以进一步包含美容上可接受的赋形剂，诸如但不限于溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质脂质体、脂质纳米颗粒、核
‑
壳纳米颗粒、聚合物、脂质体复合物(lipoplex)、肽、蛋白、细胞、透明质酸酶及其混合物。组合物或美容组合物可进一步包含其他试剂以维持适当的物理或化学性质，诸如但不限于盐浓度、重量渗透摩尔浓度、ph、疏水性/亲水性和溶解度。例如，组合物包含稳定剂，例如适当浓度的葡萄糖，例如约4.5g/l。在一些实施例中，多核糖核苷酸是非免疫原性的。在一些实施例中，多核糖核苷酸是免疫原性的。组合物或美容组合物可进一步包含适当的佐剂或可增强或抑制多核糖核苷酸免疫原性的其他试剂。佐剂可以是亲水性和亲脂性胶凝剂、亲水性和亲脂性活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香精、填充剂、遮蔽剂、颜料、气味吸收剂、染料或其任何组合。
[0146]
美容上可接受的载体的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、盐水、阿拉伯树胶、角蛋白、尿素、麦芽、米粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、二醇、湿润剂(例如，尿素)、二醇类(例如，丙烯乙二醇)、脂肪酸(例如，油酸)、表面活性剂(例如，肉豆蔻酸异丙酯和月桂基硫酸钠)、吡咯烷酮、单月桂酸甘油酯、亚砜、萜烯(例如，薄荷醇)、胺、酰胺、烷烃、烷醇、水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、聚合物诸如聚乙二醇以及水。如果需要，载体还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。
稳定性
[0147]
本文提供的多核糖核苷酸在递送至细胞或组织中后可以是稳定的，从而允许多核糖核苷酸的翻译，导致对递送该多核糖核苷酸的细胞或组织的美容效果。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。在一些实施例中，多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸并且用于短期美容效果，诸如用于持续至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时或其间的任何时间的美容效果。在一些实施例中，多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸并且用于长期美容效果，诸如持续至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更长时间或其间的任何时间的美容效果。在一些实施例中，多核糖核苷酸对例如核酸外切酶的降解具有实质性抗性。在一些实施例中，多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，多核糖核苷酸缺少酶促切割位点，例如dicer切割位点。
[0148]
在一些实施例中，多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含介导多核糖核苷酸的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导环状多核糖核苷酸转录成与环状多核糖核苷酸互补的线性多核糖核苷酸(线性互补)。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可以在细胞中体内环化为互补的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可以进一步自复制成另一个环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸具有与起始环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包括hdv复制结构域(如beeharry等人,virol[病毒学],2014,450
‑
451:165
‑
173所描述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，经历有丝分裂的细胞将多核糖核苷酸传递给子代。美容组合物的递送
[0149]
本文提供的美容组合物可以部分地基于组合物的预期施用途径来配制。在本披露的某些方面，本文提供的组合物或美容组合物可以在受试者的特定部位或附近局部施用。组合物可以如本文所述并且进一步包含美容上可接受的赋形剂。直接局部施加例如粘性液体、溶液、悬浮液、凝胶、胶冻、乳膏、润肤露、软膏、泡沫、精华液或气溶胶可用于局部施用。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0150]
组合物或美容组合物可以包含醇(例如乙醇)和多核糖核苷酸。组合物或美容组合物可以包含细胞渗透剂和多核糖核苷酸。组合物或美容组合物可以包含稀释剂和多核糖核苷酸，其中组合物或美容组合物不含任何载体。
[0151]
本文提供的美容组合物可以用于改变(alter、modify或change)受试者的外皮成员的外观，诸如但不限于改善皮肤外观、增强皮肤年轻化、增加保湿和/或弹性、预防或减少皱纹、使皮肤或毛发变亮或变暗、改变毛发颜色或密度、和/或提供其他抗衰老护理。本文提供的方法可以减少皮肤老化的可见迹象，包括：用本文所述的组合物去皮肤角质；用本文所述的组合物处理皮肤；和/或用本文所述的组合物润湿皮肤。本文提供的方法可以漂白皮肤。本文提供的方法可以治疗或护理皮肤(例如头皮、面部皮肤)、指甲、角蛋白纤维(例如毛发或睫毛)或其任何组合。
[0152]
本文提供的美容组合物可以被配制成直接施用在受试者的表面区域上，诸如但不限于前额、头皮、毛囊、毛发、上眼睑、下眼睑、眉毛、睫毛、眶下区域、眶周区域、太阳穴、鼻子、鼻梁、脸颊、舌头、鼻唇沟、嘴唇、眼周区域、下巴线、耳朵、颈部、乳房、前臂、上臂、手掌、手、手指、指甲、背部、腹部、侧面、臀部、大腿、小腿、脚、脚趾、牙龈、舌头等。
[0153]
本文所述的美容组合物可以是液体制剂，诸如悬浮液、糖浆或酏剂。在一些情况下，将水溶液包装以按原样使用，或冻干，并在施用之前将冻干制剂与无菌溶液组合。美容组合物可以以溶液或悬浮液的形式递送。通常，诸如胶冻、乳膏、润肤露和软膏等配制品可以使区域更长时间暴露于一种或多种活性剂，而溶液中的配制品(例如，喷雾)可以提供更立即的短期暴露。
[0154]
如本文所述的组合物或美容组合物可以具有约7的ph。在一些实施例中，组合物或美容组合物具有与水大致相同的粘度。组合物或美容组合物可以基本上不含疏水性或亲脂性基团。在一些实施例中，组合物或美容组合物基本上不含烃。组合物或美容组合物可以基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。组合物或美容组合物可以不含甘油、丙烯乙二醇或其组合。
[0155]
在一些实施例中，递送如本文所述的多核糖核苷酸(例如，美容多核糖核苷酸)的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和乙醇的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中乙醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，递送如本文所述的美容多核糖核苷酸的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中醇占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，递送如本文所述的美容多核糖核苷酸的方法包括将包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物的美容组合物施加至受试者的外皮成员，其中细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。在一些实施例中，乙醇、醇或细胞渗透剂占混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v，或其间的任何百分比v/v。在一些实施例中，乙醇、醇或细胞渗透剂占混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v，或其间的任何百分比v/v。
[0156]
通常，如本文所述的组合物或美容组合物将多核糖核苷酸递送至受试者的真皮或表皮组织。在一些实施例中，多核糖核苷酸在不使用离子导入法的情况下递送。经皮施用
[0157]
用于局部施用的配制品可以呈液体、半固体剂型(例如，糊剂、乳膏、润肤露、粉末、软膏或凝胶)、贴片、膜或喷雾的形式。在一些情况下，局部组合物可以为可施加至有需要的受试者的皮肤的受影响区域(例如经皮或皮肤施用)的乳膏或凝胶。不同的释放曲线可以通过不同的形式实现，诸如但不限于控制释放、延迟释放、延长释放或持续释放。局部美容组合物可以每天多次、每天一次或根据需要经常施加。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式
存在。
[0158]
在一些情况下，美容组合物可被配制用于直接施加在皮肤区域上(例如，经皮或皮肤施用)。本文提供的美容组合物可以包含皮肤病学可接受的稀释剂。此类稀释剂与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的任何皮肤病学稀释剂。此类稀释剂可由本领域的普通技术人员容易地选择。本文提供的美容组合物可以包含美容上可接受的稀释剂。此类稀释剂与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的任何美容稀释剂。此类稀释剂可由本领域的普通技术人员容易地选择。在配制皮肤软膏时，一种或多种试剂可以配制在油质烃基质、无水吸收基质、油包水吸收基质、水包油水可洗去型基质和/或水溶性基质中。
[0159]
软膏和乳膏例如用水性或油性基质并添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。润肤露可以用水性或油性基质配制，并且通常还包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。用于递送美容剂的透皮贴片的构造和使用是本领域已知的。此类贴片可被构造用于连续、脉冲或按需递送美容剂。
[0160]
可用于形成组合物和剂型的润滑剂可以包括硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇类、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或其混合物。另外的润滑剂包括例如syloid硅胶、合成二氧化硅的凝聚型气溶胶或其混合物。润滑剂可以任选地以小于组合物的约1重量％的量加入。
[0161]
本文提供的组合物或美容组合物可以呈适于局部施用的任何形式，包括润肤剂或乳液，水性、水醇性或油性溶液，润肤露或精华液分散体，水性、无水或油性凝胶，通过将脂肪相分散于水相中(o/w或水包油)或相反地(w/o或油包水)获得的乳液，微乳液或替代性地离子型和/或非离子型微囊、微粒或脂质囊泡分散体。在一些实施例中，组合物或美容组合物呈包含至少一个油相的乳液的形式。在一些实施例中，组合物或美容组合物呈包含乳化剂(诸如两性、阴离子、阳离子、非离子乳化剂或其任何混合物)的乳液的形式。除了多核糖核苷酸和其他活性成分之外，本文提供的组合物的各种成分的量可以是本领域中使用的那些。这些组合物可以构成用于面部、手、身体和/或粘膜或用于清洁皮肤的保护、治疗或护理乳膏、乳、润肤露、凝胶或泡沫。组合物还可以由构成皂或清洁条的固体制剂组成。
[0162]
在一些实施例中，组合物或美容组合物可以具有不同水平的流动性。在一些实施例中，组合物或美容组合物可以是白色或有色的乳膏、香膏、乳、润肤露、精华液、糊剂或泡沫。在一些实施例中，组合物或美容组合物可以作为气溶胶施加。在一些实施例中，组合物或美容组合物可以以固体形式例如棒施加。
[0163]
组合物或美容组合物可以包含湿润剂。例如，湿润剂是尿素和吡咯烷酮羧酸与甾醇、鲸蜡醇和polowax的组合。
[0164]
本文提供的用于局部(local/topical)施用的组合物或美容组合物可以包含一种或多种抗微生物防腐剂，诸如季铵化合物、有机汞制剂、对羟基苯甲酸酯、芳族醇、氯丁醇等。眼部施用
[0165]
本文提供的组合物或美容组合物可以通过眼睛施用，例如以滴眼剂或软膏递送。将组合物局部施加至眼睛可以使眼睛中的细胞(例如视网膜)与醇(例如乙醇)和多核糖核
苷酸的混合物接触。将组合物局部施加至眼睛可以使眼睛中的细胞(例如视网膜)与细胞渗透剂和多核糖核苷酸的混合物接触。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0166]
如果单独的细胞渗透剂和多核糖核苷酸的混合物本身处于液相中，则可以通该混合物来制备滴眼剂。替代性地，通过将细胞渗透剂和多核糖核苷酸的固体混合物溶解在无菌水溶液诸如生理盐水、缓冲溶液等中，或通过使将在使用前溶解的粉末组合物合并来制备滴眼剂。替代性地，通过将醇(例如乙醇)和多核糖核苷酸的固体混合物溶解在无菌水溶液诸如生理盐水、缓冲溶液等中，或通过使将在使用前溶解的粉末组合物合并来制备滴眼剂。如本领域已知的，可以选择其他媒介物，它们包括但不限于：平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚诸如聚乙二醇、聚乙烯基类化合物诸如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物诸如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物诸如矿物油和白凡士林、动物脂肪诸如羊毛脂、丙烯酸聚合物诸如羧基聚亚甲基凝胶、植物脂肪诸如花生油和多糖诸如葡聚糖，以及糖胺聚糖诸如透明质酸钠。如果需要，可以添加通常用于滴眼剂的添加剂。此类添加剂包括等渗剂(例如，氯化钠等)、缓冲剂(例如，硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇等)、增稠剂(例如，糖诸如乳糖、甘露醇、麦芽糖等；例如，透明质酸或其盐诸如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如，粘多糖诸如硫酸软骨素等；例如，聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其他试剂)。其他施用
[0167]
在一些实施例中，本文所述的组合物或美容组合物被配制用于粘膜，例如嘴唇。多核糖核苷酸可以是环状rna或线性rna。
[0168]
在一些情况下，组合物或美容组合物被配制用于施用至上皮细胞。该组合物或美容组合物可以不含任何载体，而包含稀释剂和如本文所述的多核糖核苷酸。在一些实施例中，将该组合物或美容组合物直接施加至上皮细胞以递送多核糖核苷酸(例如，美容多核糖核苷酸)。多核糖核苷酸可以是环状rna或线性rna。预处理
[0169]
如本文所述的组合物或美容组合物可以在将消毒剂施加至表面(例如外皮成员)后再施加至该表面(例如，用消毒剂预处理该表面(例如外皮成员)以递送多核糖核苷酸)。该表面可以是受试者的表面区域。受试者的表面区域可以包括细胞，诸如上皮细胞。表面可以是外皮成员，诸如毛发、指甲或皮肤。
[0170]
消毒剂可以是杀菌、抑菌和/或主动杀灭微生物、灭活微生物或防止微生物生长的任何试剂。在一些实施例中，消毒剂是醇、碘或过氧化氢。消毒剂可以是紫外光或激光。在一些实施例中，消毒剂是以电的方式或通过其他方式诸如通过蒸气或接触传递的热。
[0171]
可以通过各种方法将消毒剂施加至受试者的表面区域(例如，外皮成员)。例如，消毒剂可以通过包含消毒剂的擦拭物或拭子施加。擦拭物或棉签可以是垫、棉球或棉头涂抹器。在一些实施例中，消毒剂作为喷雾而施加。可以使用各种装置来施加消毒剂。例如，可以使用产生紫外光或激光的装置。在其他实施例中，可以使用产生热量的装置。
[0172]
预处理后施加至表面区域的组合物或美容组合物可以不含任何载体，而包含多核糖核苷酸和稀释剂。多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸。
[0173]
在一些实施例中，消毒剂、美容组合物或它们的组合可以通过按摩到皮肤中而施加。在一些实施例中，在施用美容组合物之前使消毒剂干燥。防腐剂
[0174]
本文提供的组合物或美容组合物可以包含用于单次施用的材料，或者可以包含用于多次施用的材料(例如，“多剂量”试剂盒)。组合物或美容组合物可以包含一种或多种防腐剂，诸如硫柳汞或2
‑
苯氧乙醇。防腐剂可以用于防止使用期间的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸、onamer m或本领域技术人员已知的其他试剂。在眼科产品中，例如，此类防腐剂可以按0.004％至0.02％的水平使用。在本文所述的组合物或美容组合物中，防腐剂例如苯扎氯铵可以按重量计以0.001％至小于0.01％，例如0.001％至0.008％，优选约0.005％的水平使用。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0175]
聚核糖核苷酸对周围环境中丰富的rna酶可能敏感。本文提供的组合物或美容组合物可以包括抑制rna酶活性的试剂，从而防止多核糖核苷酸降解。在一些情况下，组合物包含本领域技术人员已知的任何rna酶抑制剂。替代性地或另外，本文提供的组合物中的多核糖核苷酸和细胞渗透剂和/或药学上可接受的稀释剂或载体、媒介物、赋形剂或其他试剂可以在无rna酶的环境中制备。组合物可以在无rna酶的环境中配制。
[0176]
在一些情况下，本文提供的组合物可以是无菌的。组合物可以在本领域已知的合适媒介物中配制成无菌溶液或悬浮液。组合物可以通过常规的已知灭菌技术灭菌，例如组合物可以无菌过滤。盐
[0177]
在一些情况下，本文提供的组合物或美容组合物包含一种或多种盐。为了控制张力，本发明提供的组合物可以包含生理盐诸如钠盐。其他盐可以包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。在一些情况下，组合物或美容组合物与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。该一种或多种药学上可接受的盐可以包含无机离子例如钠、钾、钙、镁离子等的盐。此类盐可以包括与无机酸或有机酸的盐，该无机酸或有机酸诸如为盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。缓冲剂/ph
[0178]
本文提供的组合物或美容组合物可以包含一种或多种缓冲剂，诸如tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(例如，具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂以5
‑
20mm的范围包括在内。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0179]
本文提供的组合物或美容组合物可以具有约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约7.0至约7.8的ph。组合物或美容组合物可以具有约7的ph。洗涤剂/表面活性剂
[0180]
本文提供的组合物或美容组合物可以根据预期的施用途径包含一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为“吐温”)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以dowfax
tm
商品名出售的环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，诸如线性eo/po嵌段共聚物；辛苯聚醇，其重复乙氧基(氧基
‑
l,2
‑
乙烷二基)的数目可以变化，例如辛苯聚醇
‑
9(triton x
‑
100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(igepal ca
‑
630/np
‑
40)；磷脂诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，诸如tergitol
tm np系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂基醚(brij 30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为“span”)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯、辛苯聚醇(诸如辛苯聚醇
‑
9(triton x
‑
100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(“ctab”)或脱氧胆酸钠。该一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂可以仅以痕量存在。在一些情况下，组合物可以包含各自少于1mg/ml的辛苯聚醇
‑
10和聚山梨醇酯80。本文可以使用非离子表面活性剂。表面活性剂可按其“hlb”(亲水/亲脂平衡)分类。在一些情况下，表面活性剂具有至少10、至少15和/或至少16的hlb。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。油类
[0181]
本文提供的组合物或美容组合物可以包含一种或多种油。在一些实施例中，组合物或美容组合物包含含有至少一种油的油相。例如，油是来自动物源的烃油，诸如角鲨烷。油可以是植物来源的烃油，诸如包含4至10个碳原子的液体脂肪酸甘油三酯，诸如庚酸或辛酸甘油三酯，或者另外，向日葵、玉米、大豆、西葫芦、葡萄籽、芝麻、榛子、杏、澳洲坚果、阿拉拉(arara)、鳄梨和蓖麻油、辛酸/癸酸甘油三酯(诸如由迪博斯特林公司(stearineries dubois)出售的那些由或诺贝尔炸药公司(dynamit nobel)以名称miglyol 810、812和818出售的那些)、荷荷巴油、乳木果油。在一些实施例中，油包含合成酯和醚，包括来自脂肪酸的合成酯和醚，诸如具有式r1coor2和r1or2的油，其中r1表示含有8至29个碳原子的脂肪酸部分，并且r2表示含有3至30个碳原子的支化或非支化烃链，例如，purcellin oil、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸乙基
‑2‑
己酯、硬脂酸辛基
‑2‑
十二烷基酯、芥酸辛基
‑2‑
十二烷基酯、异硬脂酸异硬基酯；羟基酯，诸如乳酸异硬脂基酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、苹果酸二异硬脂基酯、柠檬酸三异鲸蜡基酯、脂肪醇庚酸酯、脂肪醇辛酸酯和脂肪醇癸酸酯；多元醇酯，诸如丙烯乙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯和二乙二醇二异壬酸酯；以及季戊四醇酯，诸如季戊四醇四异硬脂酸酯。在一些实施例中，油包含来自矿物或合成来源的直链或支链烃，诸如挥发性或非挥发性石蜡油及其衍生物、凡士林、聚癸烯、氢化聚异丁烯，诸如parleam
tm
(由日本凝胶脂肪公司(nippon gel fats company)出售)。油可包含具有8至26个碳原子的脂肪醇，诸如鲸蜡醇、硬脂醇及其混合物(鲸蜡硬脂醇)、辛基十二烷醇、2
‑
丁基辛醇、2
‑
己基癸醇、2
‑
十一烷基十五烷醇、油醇或亚油醇；烷基脂肪醇，包括乙氧基化的，诸如油醇聚醚
‑
12；部分烃和/或硅氟化的油，诸如文献jp
‑
a
‑2‑
295912中描述的那些。在一些实施例中，氟化油包括由bnfl氟化学品公司(bnfl fluorochemicals)以商标flutec pc 1
tm
和flutec pc3
tm
出售的全氟甲基环戊烷和全氟
‑
1,3二甲基环己烷；全氟
‑
1,2
‑
二甲基环丁烷；全氟烷烃，诸如由3m公司以商标pf 5050
tm
和pf 5060
tm
出售的十二氟戊烷和十四氟己烷，或由阿托化学公司(atochem)以商标foralkyl
tm
出售的溴全氟辛基化物；由3m公司以商标msx 4518
tm
出售的九氟甲氧基丁烷，和九氟乙氧基异丁烷；全氟吗啉衍生物，诸如由3m公司以商标pf
‑
5052
tm
出售的4
‑
三氟甲基全氟吗啉；硅油，诸如聚甲基硅氧烷(pdms)，无论是否有挥发性、具有直链还是环状有机硅链、在室温下呈液态还是糊状，包括环聚二甲基硅氧烷(环甲硅油)，诸如环己硅氧烷；包含烷基、烷氧基或苯
基的聚二甲基硅氧烷，无论是作为侧基还是在有机硅链末端，具有2至24个碳原子；苯基化有机硅，诸如苯基聚三甲基硅氧烷、苯基聚二甲基硅氧烷、苯基三甲基甲硅烷氧基二苯基硅氧烷、二苯基聚二甲基硅氧烷、二苯基甲基二苯基三硅氧烷、2
‑
苯基乙基三甲基
‑
甲硅烷氧基硅酸酯和聚甲基苯基硅氧烷；及其混合物。有效递送
[0182]
本文提供的组合物、美容组合物、方法和试剂盒可以为将多核糖核苷酸(例如美容多核糖核苷酸)递送到细胞中提供易于操作且有效的解决方案。在一些情况下，将多核糖核苷酸递送至细胞中是美容性的。在一些情况下，与没有醇的递送相比，在本文所述的醇的存在下的递送效率可以相对较高。在一些情况下，与没有细胞渗透剂的递送相比，在本文所述的细胞渗透剂的存在下的递送效率可以相对较高。在一些情况下，与没有预处理的递送相比，在使用本文所述的消毒剂(例如，醇)预处理后，递送效率可以相对较高。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。多核糖核苷酸包含有效负载。有效负载可以是美容有效负载。美容有效负载可以是在施用给细胞、组织或外皮成员后具有美容效果的任何有效负载。有效负载可以是多核糖核苷酸中负责表达产物的一个或多个序列。在一些实施例中，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。
[0183]
在一些情况下，递送效率表示为递送至细胞中的多核糖核苷酸的量与接触细胞的总多核糖核苷酸的量的比率。在一些情况下，递送效率表示为递送至细胞中的多核糖核苷酸的量与施用在细胞附近的总多核糖核苷酸的量的比率(例如，当多核糖核苷酸直接施加在皮肤区域上时递送至皮肤细胞中的量)。本文提供的方法的递送效率可以为至少约0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些情况下，本文提供的方法的递送效率可以为约0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
[0184]
在一些情况下，本文提供的组合物和方法的美容效果根据观察到的由于组合物的施用而导致的受试者外皮成员外观变化来测量。替代性地，美容效果由受试者中或受试者的一个或多个细胞中多核糖核苷酸的丰度决定。在其他情况下，如果组合物包含编码待在受试者中表达的蛋白的表达序列，则表达产物可以作为本文提供的组合物和方法的递送效率的指标而测量。
[0185]
与线性多核糖核苷酸相比，本文提供的组合物和方法可以特别更有效地递送环状多核糖核苷酸。递送至细胞的环状多核糖核苷酸的量是包含线性多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物接触细胞时递送的线性多核糖核苷酸的量的至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0倍。在一些情况下，递送至细胞的环状多核糖核苷酸的量是包含线性多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物接触细胞时递送的线性多核糖核苷酸的量的至少1.1倍。
[0186]
当体内施用时，取决于施用途径，多核糖核苷酸可以根据本文提供的方法递送至接近受试者表面区域的任何类型的细胞中。例如，可以通过本文提供的方法将多核糖核苷酸通过本文提供的方法递送至位于皮肤下或位于腔或通道表面上的上皮细胞。上皮细胞的非限制性类型包括单层鳞状上皮、单层立方上皮、单层柱状上皮、假复层柱状上皮、复层鳞
状上皮、复层立方上皮、复层柱状上皮和移行上皮。多核糖核苷酸可以通过本文提供的方法递送至表面区域(例如皮肤)下方的任何类型的细胞，这些细胞包括但不限于角化细胞、梅克尔细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞。多核糖核酸可以通过本文提供的方法递送至皮肤下方组织的任何部分，诸如表皮、基底膜、真皮和皮下组织。本文提供的组合物、方法和试剂盒可适于多核糖核苷酸的延长递送。例如，可以将多核糖核苷酸和醇(例如乙醇)配制用于延长释放、控制释放、延迟释放或持续释放，使得可以实现特定的美容效果或者可以将多核糖核苷酸递送至受试者的期望位置。例如，可以将多核糖核苷酸和醇(例如乙醇)配制成贴片的形式，该贴片将粘附于受试者的皮肤区域持续延长的时间段，例如至少约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、5周、2个月、3个月、4个月或甚至更长。在一些情况下，贴片中的多核糖核苷酸和细胞渗透剂在延长的时间段内递送，例如，只要贴片粘附在皮肤区域上。多核糖核苷酸和细胞渗透剂可以被配制用于延长释放、控制释放、延迟释放或持续释放，使得可以实现特定的美容效果或者可以将多核糖核苷酸递送至受试者的期望位置。例如，可以将多核糖核苷酸和细胞渗透剂配制成贴片的形式，该贴片将粘附于受试者的皮肤区域持续延长的时间段，例如至少约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、5周、2个月、3个月、4个月或甚至更长。在一些情况下，贴片中的多核糖核苷酸和细胞渗透剂在延长的时间段内递送，例如只要贴片粘附在皮肤区域上。
[0187]
在一些情况下，组合物、美容组合物、方法和试剂盒提供被递送至细胞中并在延长的时间段内具有美容效果的多核糖核苷酸。例如，多核糖核苷酸对rna酶的敏感性很小或不敏感，或者它们在细胞内的半衰期很长。因此，多核糖核苷酸可以在长时间段内存在并且可能具有活性，例如至少约24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、5周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、2年、3年或甚至更长。在一些情况下，多核糖核苷酸可以具有约24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、5周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、2年或3年的半衰期。试剂盒和施加工具
[0188]
取决于不同的预期施用途径，本文提供的组合物可以按不同的方式包装，和/或在一些情况下，包装在不同的试剂盒中，这些试剂盒包括组合物和被配置成经由预期途径将组合物施用给受试者的一种或多种施加工具。如上所讨论，本文提供的组合物可以被配制用于通过不同的途径施用，这些途径包括直接局部施用(例如，经皮)或眼用。在一些方面，本披露提供了用于施用包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂的组合物的试剂盒。在一些方面，本披露提供了用于施用包含美容多核糖核苷酸和醇的美容组合物的试剂盒。在一些方面，本披露提供了用于施用包含美容多核糖核苷酸和乙醇的美容组合物的试剂盒。在一些方面，本披露提供了用于在如本文所述的预处理之后施用包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物的试剂盒。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。多核糖核苷酸可以包含有效负载。有效负载可以是美容有效负载。美容有效负载可以是在施用给细胞、组织或外皮成员后具有美容效果的任何有效负载。有效负载可以是多核糖核苷酸中
负责表达产物的一个或多个序列。在一些实施例中，有效负载是选自由胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和肉毒杆菌毒素或其任何片段组成的组的美容蛋白或肽。
[0189]
试剂盒可被配置用于直接局部施用，例如直接施加在皮肤上。在一些情况下，试剂盒包括含有如本文所提供的组合物的基材或支架。基材或支架可以呈贴片、擦拭物、棉签(q
‑
tip)的形式，或允许将组合物直接施加至受试者的皮肤表面上的任何其他形式。擦拭物或棉签可以是垫、棉球或棉头涂抹器。基材或支架可以由一次性材料或生物可降解材料制成。
[0190]
在一些情况下，本文提供包括去角质垫和本文所述的组合物的试剂盒。在一些情况下，去角质垫包含吸附或吸收在其上的本文所述的组合物。在一些情况下，本文所述的基材是洁面垫(facial pad)。在一些情况下，基材可以是纤维层，例如使用非弹性体原材料构成的并且至少在一个方向上具有可伸长性的纤维层，例如棉花、桉树或生物纤维素。作为纤维层，可以使用纸、非织造织物、织造织物等。纤维层可以是亲水性的并具有液体保留性能。纤维层可以由使用亲水性原料获得的亲水性纤维制成，也可以由非弹性体原料或由其形成的纤维制成。在一些情况下，试剂盒包括本文提供的液体组合物和被配置成转移或分配液体组合物的转移工具。转移工具可以简单地为吸管、洗耳器或移液吸管。转移工具也可以被设计成具有附加特征，诸如刻度、致动、报警系统或自动分配系统。
[0191]
本文提供的试剂盒可以进一步包括含有所配制的组合物的容器，诸如瓶子、盒子、胶囊或分配器。所披露的容器也可以是施加工具。在一些情况下，提供用于分配本文所述的组合物的液体或固体配制品的分配器。例如，可以使用移液吸管将液体滴到皮肤表面或眼睛上用于眼内递送。如果需要，可以在如本文所述的容器中保持无菌性、湿度和/或温度。在一些情况下，如果需要，如上所讨论的吸入器可以是用于储存液体、固体或气溶胶形式的组合物的容器。当然，替代性地，也可以单独提供容器和施加工具。
[0192]
本文提供的试剂盒可以包括第一施加工具、第二施加工具、消毒剂以及包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物，其中第一施加工具被配置成将消毒剂施加至受试者的表面区域(例如外皮成员)，并且第二施加工具被配置成将美容组合物施加至受试者的表面区域(例如外皮成员)。消毒剂可以是醇、碘、过氧化氢、紫外光、激光或热。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。第一施加工具可以是擦拭物或拭子，其中擦拭物或拭子包含消毒剂。替代性地，第一施加工具可以是施加紫外光或激光的装置，或施加热量的装置。第二施加工具可以包括移液管。在一些实施例中，第二施加工具包括基材，并且其中基材嵌入有混合物。通常，基材由天然或人造纤维制成。在一些实施例中，第二施加工具包括贴片、喷雾器或去角质垫。在一些情况下，第二施加工具被配置成以受控方式释放混合物。表面区域可以是外皮成员，例如毛发、睫毛、指甲和皮肤(例如面部皮肤、头皮等)及其任何组合。产生方法
[0193]
在一些情况下，本文提供的组合物或美容组合物中的多核糖核苷酸包含非天然存在的且可使用重组dna技术(下文详细描述了方法；例如，使用dna质粒体外衍生)或化学合
成而产生的脱氧核糖核酸序列。多核糖核苷酸可以以线性或环状形式存在。
[0194]
在本发明的范围内，用于产生rna环的dna分子可以包括天然存在的原始核酸序列的dna序列、其修饰形式或编码通常未在自然中发现的合成多肽的dna序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。dna分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组dna技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶切割核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(pcr)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。
[0195]
多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些情况下，线性多核糖核苷酸可由核糖核苷酸合成或由dna构建体转录。使用本领域技术人员可获得的技术，从dna构建体的转录可以在细胞内或体外进行。
[0196]
在一些情况下，线性初级构建体或线性mrna可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'
‑
/3'
‑
键可以是分子内键或分子间键。
[0197]
制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于例如khudyakov&fields,artificial dna:methods and applications[人工dna：方法与应用],crc出版社(2002)；zhao,synthetic biology:tools and applications[合成生物学：工具和应用],(第一版),学术出版社(academic press)(2013)；和egli&herdewijn,chemistry and biology of artificial nucleic acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),威利
‑
vch出版社(wiley
‑
vch)(2012)。
[0198]
多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号us 6210931、美国专利号us5 773244、美国专利号us 5766903、美国专利号us 5712128、美国专利号us 5426180、美国公开号us 20100137407、国际公开号wo 1992001813和国际公开号wo 2010084371；其各自的内容通过援引以其全文并入本文)。
[0199]
本文引用的所有参考文献和出版物均通过援引并入本文。实施例
[0200]
在一些方面，本披露的美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v。
[0201]
在一些方面，本披露的美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该细胞渗透剂被配置用于局部施用。
[0202]
在一些方面，本披露的美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中该有效负载对细胞或组织具有生物效应。
[0203]
在一些方面，本披露的美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该多核糖核苷酸的量有效产生对细胞或组织的美容效果，并且其中该细胞渗透剂的量有效产生对细胞或组织的美容效果。
[0204]
在一些方面，本披露的美容组合物包含多核糖核苷酸、细胞渗透剂和局部递送赋形剂，其中该局部递送赋形剂包含稳定剂或其他载体。
[0205]
在一些方面，本披露的美容组合物包含负载有多核糖核苷酸和细胞渗透剂的生物可降解支架。
[0206]
在一些方面，将美容多核糖核苷酸递送至细胞或组织的方法包括使该细胞或组织接触包含该美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v。
[0207]
在一些方面，将美容组合物递送至细胞或组织的方法包括使细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的美容组合物接触，其中细胞渗透剂被配置用于局部施用。在一些实施例中，细胞渗透剂包含醇。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，醇包括乙醇。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％v/v。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的约10％v/v。在一些实施例中，该方法进一步包括将美容多核糖核苷酸与细胞渗透剂混合。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前呈固体形式。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前被冻干。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前呈液体形式。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸在混合之前溶解在溶剂中。
[0208]
在一些方面，一种方法包括将美容组合物施加在受试者的外皮成员上，其中该组合物包含含有美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物。在一些实施例中，细胞渗透剂包含醇。在一些实施例中，醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。在一些实施例中，醇包括乙醇。在一些实施例中，递送是局部的。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％v/v。在一些实施例中，细胞渗透剂占混合物的约10％v/v。在一些实施例中，外皮成员包括皮肤、指甲或毛发。在一些实施例中，施加包括将混合物液滴直接沉积到外皮成员上。在一些实施例中，施加包括用嵌入有混合物的贴片、凝胶或膜擦拭外皮成员。在一些实施例中，施加包括将混合物喷雾到外皮成员上。在一些实施例中，细胞包括上皮细胞。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸包括线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，美容多核糖核苷酸包括环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于线性对应物至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于线性对应物至少5倍。在一些实施例中，多核糖核苷酸具有短期美容效果。在一些实施例中，多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸具有长期美容效果。在一些实施例中，多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，混合物中美容多核糖核苷酸的浓度
为至少约1ng/ml、至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约50ng/ml、至少约100ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约500μg/ml、至少约1mg/ml、至少约2mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml。
[0209]
在一些方面，本披露的试剂盒包含施加工具和美容组合物，该美容组合物包含含有美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物，其中施加工具被配置成将混合物施加至受试者的外皮成员。在一些实施例中，施加工具包括移液管。在一些实施例中，施加工具包括基材，并且其中基材嵌入有美容组合物。在一些实施例中，基材由天然或人造纤维制成。在一些实施例中，施加工具包括贴片。在一些实施例中，施加工具包括去角质垫。在一些实施例中，施加工具包括喷雾器。在一些实施例中，施加工具被配置成以受控方式释放混合物。在一些实施例中，外皮成员包括皮肤、指甲或毛发。编号的实施例[1]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和乙醇的混合物，其中该乙醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[2]如段落[1]所述的美容组合物，其中该乙醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。[3]如段落[1]所述的美容组合物，其中该乙醇占该混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。[4]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和醇的混合物，其中该醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[5]如段落[4]所述的美容组合物，其中该醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。[6]如段落[4]所述的美容组合物，其中该醇占该混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。[7]如段落[4]
‑
[6]中任一段所述的美容组合物，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、
苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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α
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生育酚、sd醇、sd醇40、c12
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。[8]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[9]如段落[8]所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。[10]如段落[8]所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。[11]如段落[8]
‑
[10]中任一段所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂是醇。[12]如段落[11]所述的美容组合物，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
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400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
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16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。[13]如段落[1]
‑
[12]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸编码蛋白或肽、或其片段。[14]如段落[13]所述的美容组合物，其中该蛋白或肽是美容蛋白或肽、或其片段。[15]如段落[13]或[14]所述的美容组合物，其中该蛋白是毛发或睫毛(例如角蛋白纤维)、指甲或皮肤蛋白。[16]如段落[13]或[14]所述的美容组合物，其中该蛋白是胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、肉毒杆菌毒素或其片段。[17]如段落[1]
‑
[15]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物是液体、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫、精华液、软膏或棒。[18]如段落[1]
‑
[16]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸是美容多核糖核苷酸。[19]如段落[1]
‑
[18]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。[20]如段落[1]
‑
[19]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸是mrna。[21]如段落[1]
‑
[20]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸缺乏帽或聚a尾。[22]如段落[1]
‑
[18]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。
[23]如段落[1]
‑
[22]中任一段所述的美容组合物，其中该多核糖核苷酸包含经修饰的核糖核苷酸。[24]如段落[1]
‑
[23]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物具有约7的ph。[25]如段落[1]
‑
[24]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物具有与水大致相同的粘度。[26]如段落[1]
‑
[25]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。[27]如段落[1]
‑
[26]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物基本上不含烃。[28]如段落[1]
‑
[27]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物基本上不含阳离子脂质体。[29]如段落[1]
‑
[28]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。[30]如段落[1]
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[29]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物是基本上游离形式的甘油、丙烯乙二醇或其组合。[31]如段落[1]
‑
[30]中任一段所述的美容组合物，其中该美容组合物是抗皱组合物。[32]如段落[4]
‑
[31]中任一段所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂可溶于极性溶剂。[33]如段落[4]
‑
[32]中任一段所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂不溶于极性溶剂。[34]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中该醇被配置用于局部施用。[35]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中该多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中该有效负载对细胞具有美容效果。[36]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和醇，其中该多核糖核苷酸的量有效产生对细胞或组织的美容效果，并且其中该醇的量有效产生对细胞或组织的美容效果。[37]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸、醇和局部递送赋形剂，其中该局部递送赋形剂包含稳定剂。[38]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该细胞渗透剂或醇被配置用于局部施用。[39]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中该有效负载对细胞具有美容效果。[40]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂，其中该多核糖核苷酸的量有效产生对细胞或组织的美容效果，并且其中该细胞渗透剂的量有效产生对细胞或组织的美容效果。
[41]一种美容组合物，该美容组合物包含多核糖核苷酸、细胞渗透剂和局部递送赋形剂，其中该局部递送赋形剂包含稳定剂。[42]如段落[37]或段落[41]所述的美容组合物，其中该稳定剂包含葡萄糖(4.5g/l)。[43]如段落[38]
‑
[42]中任一段所述的美容组合物，其中该细胞渗透剂包含醇。[44]如段落[34]
‑
[43]中任一段所述的美容组合物，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
‑
生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。[45]如段落[44]所述的美容组合物，其中该醇是乙醇。[46]一种将美容多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括a)将消毒剂施加至该受试者的外皮成员；b)将包含该美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物施加至该外皮成员。[47]如段落[46]所述的方法，其中该消毒剂是醇、紫外光、激光或热。[48]一种将美容多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括a)将醇施加至该受试者的外皮成员；b)将包含该美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物施加至该外皮成员。[49]一种将多核苷酸递送至上皮细胞的方法，该方法包括将包含稀释剂和未修饰的美容多核糖核苷酸而不含任何载体的美容组合物施加至该上皮细胞。[50]一种将多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括将包含美容多核糖核苷酸和乙醇的混合物的美容组合物施加至该受试者的外皮成员，其中该乙醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[51]一种将多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括将包含美容多核糖核苷酸和醇的混合物的美容组合物施加至该受试者的外皮成员，其中该醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[52]一种将多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括将包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物的美容组合物局部施加至该受试者的外皮成员，其中该细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[53]如段落[49]
‑
[52]中任一段所述的方法，其中该美容组合物将该美容多核糖核苷酸递送至该受试者的真皮或表皮组织。[54]如段落[53]所述的方法，其中该美容组合物在不使用离子导入法的情况下将该美容多核糖核苷酸递送至该受试者的真皮或表皮组织。[55]一种将美容多核糖核苷酸递送至细胞或组织的方法，该方法包括使该细胞或组织与包含该美容多核糖核苷酸和醇的混合物接触，其中该醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[56]一种将美容组合物递送至细胞或组织的方法，该方法包括使该细胞或组织与
包含美容多核糖核苷酸和醇的美容组合物接触，其中该醇被配置用于局部施用。[57]一种体内递送美容多核糖核苷酸的方法，该方法包括将包含该多核糖核苷酸和细胞渗透剂或醇的混合物施加在受试者的外皮成员上。[58]一种递送美容多核糖核苷酸的方法，该方法包括将包含该美容多核糖核苷酸和醇的混合物施加在受试者的外皮成员上。[59]一种将美容多核糖核苷酸递送至细胞或组织的方法，该方法包括使该细胞或组织与包含该美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物接触，其中该细胞渗透剂或醇占该混合物的至少约0.3％v/v至约75％v/v。[60]一种将美容组合物递送至细胞或组织的方法，该方法包括使该细胞或组织与包含美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的美容组合物接触，其中该细胞渗透剂或醇被配置用于局部施用。[61]一种递送美容多核糖核苷酸的方法，该方法包括将包含该美容多核糖核苷酸和细胞渗透剂的混合物施加在受试者的外皮成员上。[62]如段落[59]
‑
[61]中任一段所述的方法，其中该细胞渗透剂包含醇。[63]如段落[47]
‑
[62]中任一段所述的方法，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
‑
生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。[64]如段落[47]
‑
[63]所述的方法，其中该醇包括乙醇。[65]如段落[55]
‑
[64]中任一段所述的方法，其中该乙醇、醇或细胞渗透剂占该混合物的至少约0.3％v/v至约70％v/v、至少约0.3％v/v至约60％v/v、至少约0.3％v/v至约50％v/v、至少约0.3％v/v至约40％v/v、至少约30％v/v至约20％v/v、至少约0.3％v/v至约15％v/v、至少约0.3％v/v至约10％v/v、至少约0.3％v/v至约5％v/v、至少约0.3％v/v至约1％v/v、或至少约0.3％v/v至约0.5％v/v。[66]如段落[55]
‑
[64]中任一段所述的方法，其中该乙醇、醇或细胞渗透剂为该混合物的至少约0.5％v/v至约75％v/v、至少约1％v/v至约75％v/v、至少约5％v/v至约75％v/v、至少约10％v/v至约75％v/v、至少约15％v/v至约75％v/v、至少约20％v/v至约75％v/v、至少约30％v/v至约75％v/v、至少约40％v/v至约75％v/v、至少约50％v/v至约75％v/v、至少约60％v/v至约75％v/v、或至少约70％v/v至约75％v/v。[67]如段落[55]
‑
[66]中任一段所述的方法，进一步包括将该美容多核糖核苷酸与该醇混合。[68]如段落[55]
‑
[66]中任一段所述的方法，进一步包括将该美容多核糖核苷酸与该细胞渗透剂混合。[69]如段落[67]或[68]所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸在混合之前呈固体形式。[70]如段落[69]所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸在混合之前被冻干。[71]如段落[67]或[68]所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸在混合之前呈液体形式。
[72]如段落[67]或[68]所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸在混合之前溶解在溶剂中。[73]如段落[46]
‑
[72]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸包含有效负载或编码有效负载的序列，并且其中该有效负载对细胞或组织具有美容效果。[74]如段落[46]
‑
[73]中任一段所述的方法，其中该有效负载是美容蛋白或美容肽。[75]如段落[46]
‑
[73]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸的量有效产生对细胞的美容效果，并且该细胞渗透剂的量有效产生对细胞或组织的美容效果。[76]如段落[46]
‑
[74]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸编码蛋白或肽、或其片段。[77]如段落[76]所述的方法，其中该蛋白或肽是美容蛋白或美容肽。[78]如段落[76]或[77]所述的方法，其中该蛋白是毛发、皮肤或指甲蛋白。[79]如段落[76]或[77]所述的方法，其中该蛋白是胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、肉毒杆菌毒素或其片段。[80]如段落[46]
‑
[78]中任一段所述的方法，其中该组合物是液体、精华液、凝胶、润肤露、糊剂、乳膏、泡沫或棒。[81]如段落[46]
‑
[80]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。[82]如段落[46]
‑
[81]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸是mrna。[83]如段落[46]
‑
[82]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸缺乏帽或聚a尾。[84]如段落[46]
‑
[80]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。[85]如段落[46]
‑
[84]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸包含经修饰的核糖核苷酸。[86]如段落[46]
‑
[85]中任一段所述的方法，其中该美容组合物具有约7的ph。[87]如段落[46]
‑
[86]中任一段所述的方法，其中该美容组合物具有与水大致相同的粘度。[88]如段落[46]
‑
[87]中任一段所述的方法，其中该美容组合物基本上不含疏水性或亲脂性基团。[89]如段落[46]
‑
[88]中任一段所述的方法，其中该美容组合物基本上不含烃。[90]如段落[46]
‑
[89]中任一段所述的方法，其中该美容组合物基本上不含阳离子脂质体。[91]如段落[46]
‑
[90]中任一段所述的方法，其中该美容组合物基本上不含脂肪酸、脂质、脂质体、胆固醇或其任何组合。[92]如段落[46]
‑
[91]中任一段所述的方法，其中该美容组合物不含甘油、丙烯乙二醇或其组合。[93]如段落[55]
‑
[92]中任一段所述的方法，其中该细胞渗透剂可溶于极性溶剂。[94]如段落[55]
‑
[93]中任一段所述的方法，其中该细胞渗透剂不溶于极性溶剂。
[95]如段落[46]
‑
[94]中任一段所述的方法，其中该美容组合物进一步包含美容上可接受的赋形剂。[96]如段落[46]
‑
[95]中任一段所述的方法，其中该递送是局部的。[97]如段落[46]
‑
[96]中任一段所述的方法，其中该外皮成员包括皮肤、毛发或指甲。[98]如段落[46]
‑
[54]、[57]、[61]或[62]
‑
[97]中任一段所述的方法，其中施加包括将该混合物的液滴直接沉积到该外皮成员上。[99]如段落[46]
‑
[54]、[57]、[61]或[62]
‑
[97]中任一段所述的方法，其中施加包括用嵌入有该混合物的贴片、凝胶或膜擦拭该外皮成员。[100]如段落[46]
‑
[54]、[57]、[61]或[62]
‑
[97]中任一段所述的方法，其中施加包括将该混合物喷雾到该外皮成员上。[101]如段落[49]或[62]
‑
[100]中任一段所述的方法，其中该细胞包括上皮细胞。[102]如段落[84]至[101]中任一段所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸具有的翻译效率高于线性对应物至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。[103]如段落[84]至[102]中任一段所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸具有的翻译效率是线性对应物的至少5倍。[104]如段落[46]
‑
[103]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸具有短期美容效果。[105]如段落[46]
‑
[104]中任一段所述的方法，其中该美容多核糖核苷酸具有长期美容效果。[106]如段落[46]
‑
[105]中任一段所述的方法，其中该混合物中该美容多核糖核苷酸的浓度为至少约50ng/ml、至少约100ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约500μg/ml、至少约1mg/ml、至少约2mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml。[107]一种试剂盒，该试剂盒包括施加工具和如段落[1]
‑
[33]中任一段所述的美容组合物，其中该施加工具被配置成将该美容组合物施加至受试者的外皮成员。[108]一种试剂盒，该试剂盒包括第一施加工具、第二施加工具、消毒剂以及包含美容多核糖核苷酸和稀释剂而不含任何载体的美容组合物，其中该第一施加工具被配置成将消毒剂施加至受试者的外皮成员，并且该第二施加工具被配置成将该组合物施加至该受试者的外皮成员。[109]如段落[108]所述的试剂盒，其中该消毒剂是醇、紫外光、激光或热。[110]如段落[109]所述的试剂盒，其中该醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、鲸蜡醇、乙二醇、丙烯乙二醇(propylene glycol)、变性醇、苯甲醇，特殊是变性醇、二醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇(peg)
‑
400、乙氧基化脂肪酸、羟乙
基纤维素、异丙醇、二甲氨基乙醇、视黄醇、d
‑
α
‑
生育酚、sd醇、sd醇40、c12
‑
16、月桂醇、肉豆蔻醇、丁二醇和丙二醇(propanediol)。[111]如段落[108]
‑
[110]中任一段所述的试剂盒，其中该第一施加工具是擦拭物。[112]如段落[111]所述的试剂盒，其中该擦拭物包含消毒剂。[113]如段落[108]或[109]所述的试剂盒，其中该第一施加工具是施加紫外光或激光的装置。[114]如段落[108]或[109]所述的试剂盒，其中该第一施加工具是施加热量的装置。[115]一种试剂盒，该试剂盒包括施加工具以及包含多核糖核苷酸和细胞渗透剂或醇的混合物，其中该施加工具被配置成将该混合物施加至受试者的外皮成员。[116]如段落[107]
‑
[115]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具包括移液管。[117]如段落[107]
‑
[115]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具包括基材，并且其中该基材嵌入有该混合物。[118]如段落[117]所述的试剂盒，其中该基材由天然或人造纤维制成。[119]如段落[107]
‑
[118]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具包括贴片。[120]如段落[107]
‑
[118]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具包括喷雾器。[121]如段落[107]
‑
[118]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具包括去角质垫。[122]如段落[107]
‑
[121]中任一段所述的试剂盒，其中该施加工具或第二施加工具被配置成以受控方式释放该混合物。[123]如段落[107]
‑
[122]中任一段所述的试剂盒，其中该外皮成员包括皮肤、指甲、睫毛或毛发。实例
[0210]
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但无意于限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。实例1：用于局部递送的rna配制品
[0211]
本实例证明用于局部递送的rna配制品。
[0212]
为了确定rna的局部作用，配制rna用于递送至上皮组织。
[0213]
如本文所述，根据以下方案用细胞渗透剂配制rna：10ng包含egf orf的线性或环状rna5μl 80％的乙醇35μlpbs+葡萄糖(4.5g/l)实例2：线性rna的局部递送
[0214]
本实例证明rna的局部递送。
[0215]
为了确定局部递送效果，配制rna并递送至上皮组织。如本文所述，将用细胞渗透剂配制的线性rna局部递送至耳朵组织。
[0216]
如实例1配制线性rna样品(50μl)并施加至小鼠的耳朵。在将样品施加至耳朵之前，用异丙醇擦拭物擦拭耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0217]
在选择的时间点(施加后6小时、1天、3天或12天)，针对每个rna样品收集耳朵组织(通过单次耳朵打孔)并储存在组织储存试剂(例如，渗透组织以稳定和保护未冷冻样品中的细胞rna)中。实例3：局部递送环状rna
[0218]
本实例证明rna的局部递送。
[0219]
为了确定局部递送效果，配制rna并递送至上皮组织。如本文所述，将rna与细胞渗透剂一起配制并局部递送至耳朵组织。
[0220]
如实例1配制环状rna样品(50μl)并施加至小鼠的两只耳朵。在将样品施加至耳朵之前，用异丙醇擦拭物擦拭耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥耳朵上的样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。在选择的时间点(施加后6小时、1天、3天或12天)，收集每个rna样品的耳朵组织(通过单次耳朵打孔)。实例4：局部递送后rna的持久性
[0221]
本实例证明在局部递送后rna的存在。
[0222]
为了测定rna持久性，分析组织样品中的所递送的rna。如本文所述，分析耳朵打孔样品在rna局部递送后不同时间点的持久性。
[0223]
在rna稳定试剂中收集来自实例3的耳朵打孔样品和未处理的耳朵打孔样品，并使用标准rna组织提取试剂盒(maxwell rsc simply rna)提取rna。
[0224]
向每个样品中添加200μl体积的1
‑
硫代甘油/均化溶液。通过每毫升均化溶液添加20μl 1
‑
硫代甘油来制备工作溶液。替代性地，将600μl 1
‑
硫代甘油添加到30ml均化溶液瓶中。在使用之前，将1
‑
硫代甘油/均化溶液在冰上或在2
‑
10℃下冷却。
[0225]
用手持匀浆器和无菌杵将组织样品在200μl经冷却的1
‑
硫代甘油/均化溶液中均化，直到没有可见的组织碎片残留。每个样品再均化15
‑
30秒以完全均化。
[0226]
为了检查在不同时间点rna的存在，经由q
‑
pcr检查样品的rna。使用qpcr测量耳朵打孔样品中线性和环状rna的存在。为了检测扩增的线性和环状rna引物，使用了nluc orf。(f：agatttcgttggggactggc(seq id no:7)，r：caccgctcaggacaatcctt(seq id no:8))。为了仅检测环状rna，扩增5
’‑3’
接合部的引物允许检测环状而非线性rna构建体(f：ctggagacgtggaggagaac(seq id no:9)，r：ccaaaagacggcaatatggt(seq id no:10))。
[0227]
在局部递送后6小时、24小时和72小时检测线性和环状rna。在注射后3天，在小鼠耳朵中检测到比线性rna更高水平的环状rna(图1)。
[0228]
如本实例所示，局部施用的线性和环状rna可在体内检测到。实例5：局部递送后mrna的蛋白表达
[0229]
本实例描述了局部递送后蛋白的存在。
[0230]
为了确定局部递送的rna是否可以被翻译，通过蛋白印迹分析组织样品在不同时
间点的蛋白表达。在局部递送rna后，分析耳朵打孔样品的蛋白表达。
[0231]
简言之，收集耳朵打孔样品并储存在rna稳定试剂(英杰公司(invitrogen))中。用微量管匀浆器(飞世尔科技公司(fisher scientific))在ripa缓冲液中均化组织并提取蛋白。每个样品以14k x g离心15分钟。
[0232]
去除上清液，将沉淀物在70℃下溶于2
×
sds样品缓冲液(0.125m tris
‑
hcl，ph 6.8，4％sds，30％甘油，5％2
‑
巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15分钟。
[0233]
使用市售标准品(伯乐公司(biorad))作为尺寸标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(密理博公司(millipore))之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司(rockland))可视化印迹。
[0234]
预期gfp蛋白在耳朵打孔样品中显现，并在环状rna和线性rna中检测到。实例6：当rna溶液中包含乙醇时，rna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0235]
本实例证明当rna溶液中包含乙醇时，经由体内局部施用将rna递送至细胞和组织的能力。
[0236]
在本实例中，用emcv ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0237]
环状rna在体外生成。从dna模板体外转录未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。然后将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific)，目录号am7000)中。在本实例中，环状rna也经hplc纯化。
[0238]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计线性mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，线性rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5’和3’人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0239]
然后将rna在pbs/葡萄糖(4.5g/l)和乙醇(10％v/v)中稀释，使得每个样品的总样品体积为50μl，并且每个样品的总rna为3.5pmol。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0240]
在时间＝0时，使用移液管尖端将50μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。作为阴性对照，使用未处理的小鼠。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0241]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后6小时、1天、3天和12天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。使用trizol提取从耳朵打孔样品分离总rna。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。从总rna合成cdna，使用nluc orf特异性引物在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与肌动蛋白和未处理的阴性对照相对化。
[0242]
在局部施用后6小时和1天、3天和12天，在组织样品中检测到环状rna和线性rna，并且显示出比仅媒介物对照更大的信号(图2a和图2b)。
[0243]
本实例证明当用乙醇递送时，环状rna和线性rna通过局部施用成功地递送至组
织，并在组织中持续延长的时间段。实例7：当用transit配制时，rna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0244]
本实例证明当将transit用于在rna溶液中配制时，通过体内局部施用将rna递送至细胞和组织的能力。
[0245]
在本实例中，用emcv ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0246]
环状rna在体外生成。从dna模板体外转录未修饰的线性rna。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。然后将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。在本实例中，环状rna也经hplc纯化。
[0247]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计线性mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，线性rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5'和3'人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0248]
将rna在pbs/葡萄糖(4.5g/l)中稀释，得到在10μl溶液中的3.5pmol。然后将该rna溶液添加到transit(米卢斯生物有限责任公司，mir5700)(10μl)、增进剂(米卢斯生物有限责任公司，mir5700)(5μl)和pbs/葡萄糖(4.5g/l)(25μl)中。每个样品的总样品体积为50μl，每个样品的总rna为3.5pmol。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0249]
在时间＝0时，使用移液管尖端将50μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。作为阴性对照，使用未处理的小鼠。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0250]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后6小时、1天、3天和12天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。使用trizol提取从耳朵打孔样品分离总rna。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。从总rna合成cdna，使用nluc orf特异性引物在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与肌动蛋白和未处理的阴性对照相对化。
[0251]
在局部施用后6小时、1天、3天和12天，在组织样品中检测到环状rna和线性rna，并且显示出比仅媒介物对照更大的信号(图3a和图3b)。
[0252]
本实例证明当用transit递送时，环状rna和线性rna通过局部施用成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。实例8：用二甲亚砜(dmso)凝胶配制的经修饰的线性rna的体内局部施用
[0253]
本实例证明当用dmso凝胶配制时，通过局部施用在体内递送线性rna的能力。
[0254]
对于本实例，rna包括编码高斯荧光素酶(gluc)的orf。
[0255]
在本实例中，经修饰的线性rna由三联生物技术公司(trilink biotechnologies)定制合成，并包括上面列出的所有基序。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用cleancap
tm ag加帽并被聚腺苷酸化(120a)。dmso医用凝胶(medi gel)(21世纪化学公司
(21
st century chemical inc.))可商购获得。
[0256]
将rna在rna储存溶液中稀释至1pmol/μl的浓度。将5pmol的rna与19μl dmso医用凝胶(21世纪化学公司)和1μl rnasin plus rna酶抑制剂(普洛麦格公司(promega))组合，每次施加总共25μl。不含rna的配制品用作对照。
[0257]
在时间＝0时，使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部施加至小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0258]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的rna表达。在递送后24和48小时从小鼠获取耳朵打孔样品。将组织样品置于冰上的1x荧光素酶细胞裂解缓冲液(赛默科技公司(thermo scientific))中30分钟，然后冷冻。
[0259]
使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermo scientific pierce))测试高斯荧光素酶的活性。将样品解冻并短暂离心以除去任何组织碎片。将20μl缓冲溶液添加到96孔板(corning 3990)中。简言之，将1x腔肠素(coelenterazine)底物添加到每个孔中。添加底物并在光度计仪器(普洛麦格公司)中混合后立即读板。
[0260]
在局部施加后24和48小时在组织样品中检测到高斯荧光素酶活性，并且观察到高于仅媒介物对照(图4)。
[0261]
本实例证明当用dmso医用凝胶(21世纪化学公司)配制时，线性rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例9：用基于乳膏的软膏配制的经修饰的线性rna的体内局部施用
[0262]
本实例证明当用基于乳膏的软膏(强生婴儿润肤露)配制时，通过局部施用在体内递送线性rna的能力。
[0263]
对于本实例，rna包括编码高斯荧光素酶(gluc)的orf。
[0264]
在本实例中，经修饰的线性rna由三联生物技术公司(trilink biotechnologies)定制合成，并包括上面列出的所有基序。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用cleancap
tm ag加帽并被聚腺苷酸化(120a)。婴儿润肤露(强生公司)可商购获得。
[0265]
将rna稀释至1pmol/μl的浓度。将5pmol的rna与19μl强生婴儿润肤露(无香料；强生公司)和1μl rnasin plus rna酶抑制剂(普洛麦格)组合，每次施加总共25μl。不含rna的配制品用作对照。
[0266]
在时间＝0时，使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部施加至小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0267]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的rna表达。在递送后24和48小时从小鼠获取耳朵打孔样品。将组织样品置于冰上的1x荧光素酶细胞裂解缓冲液(赛默科技公司(thermo scientific))中30分钟，然后冷冻。
[0268]
使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermo scientific pierce))测试高斯荧光素酶的活性。将样品解冻并短暂离心以除去任何组织碎片。将20μl缓冲溶液添加到96孔板(corning 3990)中。简言之，将1x腔肠素(coelenterazine)底物添加到每个孔中。添加底物并在光度计仪器(普洛麦格公司)中混合后立即读板。
[0269]
在局部施加后24和48小时在组织样品中检测到高斯荧光素酶活性，并且观察到高
于仅媒介物对照(图5)。
[0270]
本实例证明当用基于乳膏的软膏配制时，线性rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例10：使用乙醇体内局部施用经修饰的线性rna
[0271]
本实例证明使用乙醇通过局部施用在体内递送线性rna的能力。
[0272]
对于本实例，rna包括编码高斯荧光素酶(gluc)的orf。
[0273]
在本实例中，经修饰的线性rna由三联生物技术公司(trilink biotechnologies)定制合成，并包括上面列出的所有基序。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用cleancap
tm ag加帽并被聚腺苷酸化(120a)。乙醇(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich))可商购获得。
[0274]
用rna储存溶液将rna稀释至1pmol/μl的浓度。将5pmol的rna与19μl乙醇和1μl rnasin plus rna酶抑制剂(普洛麦格)组合，每次施加总共25μl。类似地制备仅媒介物对照，但不含rna。
[0275]
在时间＝0时，使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部施加至小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0276]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的rna表达。在递送后24和48小时从小鼠获取耳朵打孔样品。将组织样品置于冰上的1x荧光素酶细胞裂解缓冲液(赛默科技公司(thermo scientific))中30分钟，然后冷冻。
[0277]
使用高斯荧光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司(thermo scientific pierce))测试高斯荧光素酶的活性。将样品解冻并短暂离心以除去任何组织碎片。将20μl缓冲溶液添加到96孔板(corning 3990)中。简言之，将1x腔肠素(coelenterazine)底物添加到每个孔中。添加底物并在光度计仪器(普洛麦格公司)中混合后立即读板。
[0278]
在局部施加后24和48小时在组织样品中检测到高斯荧光素酶活性，并且观察到高于仅媒介物对照(图6)。
[0279]
本实例证明当采用乙醇时，线性rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例11：局部施用环状rna导致将rna递送至组织
[0280]
本实例证明通过体内局部施用将环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0281]
在本实例中，用编码促红细胞生成素蛋白(epo)的orf设计环状rna。
[0282]
环状rna在体外生成。线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7 rna聚合酶启动子转录。在本实例中，将cy5
‑
utp用于生成cy5标记的rna。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0283]
将环状rna在具有5％乙醇的pbs/葡萄糖(4.5g/l)中稀释，使得每个样品的总样品体积为25μl，并且每个样品的总rna为12皮摩尔。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用
之前立即制备混合物。
[0284]
在时间＝0时，用异丙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0285]
为了确定环状rna向组织的递送，在施用后的不同时间点通过荧光显微镜分析组织样品。在施用后6小时、1天和3天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在冰冷的pbs中。然后在evos ii荧光显微镜下观察组织样品。然后使用imagej对图像的荧光定量。
[0286]
在局部施用后6小时、1天和3天，在组织样品中检测到cy5信号，并显示出比未显示任何荧光的阴性对照更大的信号(图7和图8)。这表明环状rna被成功递送至组织。
[0287]
本实例证明环状rna通过局部施用成功地递送，并在组织中持续延长的时间段。实例12：mrna的局部施用导致将rna递送至组织
[0288]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织的能力。
[0289]
在本实例中，用编码绿色荧光蛋白(egfp)的orf设计mrna。在本实例中，经修饰的线性mrna由三联生物技术公司定制合成，并包括上面列出的所有基序。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5'和3'人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。mrna包括在3'端共价结合的cy5荧光团标记。
[0290]
将mrna在具有5％乙醇的pbs/葡萄糖(4.5g/l)中稀释，使得每个样品的总样品体积为25μl，并且每个样品的总rna为12皮摩尔。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0291]
在时间＝0时，用异丙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将25μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0292]
为了确定rna向组织的递送，在施用后的不同时间点通过荧光显微镜分析组织样品。在施用后6小时、1天和3天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在冰冷的pbs中。然后在evos ii荧光显微镜下观察组织样品。然后使用imagej对图像的荧光定量。
[0293]
在局部施用后6小时、1天和3天，在组织样品中检测到cy5信号，并显示出比未显示任何荧光的阴性对照更大的信号(图9和图10)。这表明mrna被成功递送至组织。
[0294]
本实例证明mrna通过局部施用成功地递送，并在组织中持续延长的时间段。实例13：当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，mrna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0295]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织的能力。
[0296]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5’和3’人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0297]
然后将rna用仅pbs或用pbs和10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0298]
在时间＝0时，用浸在70％乙醇中的棉拭子擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭
菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0299]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0300]
在局部施用后，对于仅pbs中的mrna在第1天以及对于pbs+10％etoh中的mrna在第1天和第4天在组织样品中检测到mrna，并且显示出比阴性对照更大的信号(图11)。
[0301]
本实例证明当在施用前用乙醇擦拭物擦拭皮肤时，mrna通过局部施用成功递送，并在组织中持续延长的时间段。实例14：当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，mrna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0302]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织的能力。
[0303]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5’和3’人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0304]
然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0305]
在时间＝0时，用商业异丙醇擦拭物(cvs，297584)擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0306]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0307]
在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到mrna，并且显示出比阴性对照更大的信号(图12)。
[0308]
本实例证明当在施用前用异丙醇擦拭物擦拭皮肤时，mrna通过局部施用成功递送，并在组织中持续延长的时间段。实例15：当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0309]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0310]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0311]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0312]
然后将rna用仅pbs或用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0313]
在时间＝0时，用乙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0314]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0315]
在用乙醇擦拭物擦拭皮肤再局部施用后，对于仅pbs中的环状mrna在第1天和第4天以及对于pbs+10％etoh中的mrna在第1天在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比相关的仅媒介物对照更大的信号(图13)。
[0316]
本实例证明当在施用前用乙醇擦拭物擦拭皮肤时，环状rna通过局部施用成功递送，并在组织中持续延长的时间段。实例16：局部施用环状rna导致将rna递送至组织
[0317]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0318]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0319]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以
及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0320]
然后将rna用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0321]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0322]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0323]
在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比相关的阴性对照更大的信号(图14)。
[0324]
本实例证明环状rna通过局部施用至皮肤而成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。实例17：局部施用环状rna导致将rna递送至组织
[0325]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0326]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0327]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0328]
然后将rna用pbs+10％(v/v)异丙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并
且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0329]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0330]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
radcfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0331]
在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比相关的阴性对照更大的信号(图15)。
[0332]
本实例证明环状(endless)rna通过局部施用至皮肤而成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。实例18：当在施加前用异丙醇擦拭物擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0333]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0334]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0335]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
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(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0336]
然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0337]
在时间＝0时，用异丙醇擦拭物(cvs，297584)擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。作为阴性对照，使用仅异丙醇擦拭。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0338]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样
品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0339]
在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且显示出比仅媒介物对照更大的信号(图16)。
[0340]
本实例证明在用异丙醇擦拭物擦拭皮肤后，环状rna通过局部施用成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。实例19：线性mrna的局部施用导致将rna递送至组织
[0341]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织的能力。
[0342]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5'和3'人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0343]
将rna用(1)仅pbs、(2)pbs+10％(v/v)乙醇、(3)pbs+10％(v/v)异丙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0344]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0345]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
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rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0346]
在局部施用后，对于仅pbs中的mrna在第1天以及对于pbs+10％etoh中的mrna和pbs+10％iproh中的mrna在第1天和第4天在组织样品中检测到mrna，并且显示出比相关阴性对照更大的信号(图17)。
[0347]
本实例证明mrna通过局部施用至皮肤而成功地递送至组织，并在组织中持续延长
的时间段。实例20：当在施加前用乙醇擦拭物擦拭组织时，局部施用环状rna导致组织中的蛋白表达。
[0348]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达的能力。
[0349]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0350]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0351]
然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。类似地制备仅媒介物对照样品，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0352]
在时间＝0时，用乙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0353]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysis assay buffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm温育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano
‑
glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μl furimazine底物和49μl pbs并混合。添加底物并混合后，将板温育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。
[0354]
对于仅pbs中的环状rna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且观察到高于相关的仅媒介物对照(图18)。
[0355]
本实例证明环状rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例21：局部施用环状rna导致组织中的蛋白表达
[0356]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达的能力。
[0357]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0358]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰
生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0359]
然后将rna用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0360]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0361]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysis assay buffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm温育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano
‑
glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μl furimazine底物和49μl pbs并混合。添加底物并混合后，将板温育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。
[0362]
对于pbs+10％乙醇(v/v)中的环状rna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且观察到高于相关的仅媒介物对照(图19)。
[0363]
本实例证明环状rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例22：局部施用环状rna导致组织中的蛋白表达
[0364]
本实例证明通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达的能力。
[0365]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0366]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7 rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。将使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0367]
然后将rna用pbs+10％(v/v)异丙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0368]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小
鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0369]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysis assay buffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm温育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano
‑
glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μl furimazine底物和49μl pbs并混合。添加底物并混合后，将板温育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。
[0370]
对于pbs+10％异丙醇中的环状rna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且观察到高于相关的仅媒介物对照(图20)。
[0371]
本实例证明环状rna通过局部施用成功递送，并且能够长时间表达可在组织中检测到的功能性蛋白。实例23：线性mrna的局部施用导致将rna递送至组织和随后的蛋白表达。
[0372]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达的能力。
[0373]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5'和3'人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0374]
将rna用pbs+10％(v/v)乙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0375]
在时间＝0时，用乙醇擦拭物擦拭小鼠的耳朵，干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0376]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysis assay buffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm温育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano
‑
glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μl furimazine底物和49μl pbs并混合。添加底物并混合后，将板温育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。
[0377]
对于pbs+10％乙醇中的环状rna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且在每种情况下均观察到高于相关的仅媒介物对照(图21)。
[0378]
本实例证明当在施用前用乙醇擦拭物擦拭皮肤时，mrna通过局部施用至皮肤而成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段，并且能够表达功能性蛋白。实例24：线性mrna的局部施用导致将rna递送至组织和随后的蛋白表达。
[0379]
本实例证明通过体内局部施用将mrna递送至细胞和组织并实现随后的蛋白表达的能力。
[0380]
在本实例中，用编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计mrna。在本实例中，通过体外转录在公司内部制备经修饰的线性mrna。在本实例中，rna用假尿苷和5
‑
甲基
‑
c完全取代，用包括5'和3'人α
‑
珠蛋白utr的cleancap
tm ag加帽，并被聚腺苷酸化。
[0381]
将rna用(1)仅pbs或(2)pbs+10％(v/v)异丙醇稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0382]
在时间＝0时，使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0383]
为了测定组织中的rna表达，在局部递送后的不同时间点分析组织样品的nluc活性。在递送后4天时从小鼠获取耳朵打孔样品。将每个组织样品压碎成碎片并置于具有1x蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)的50μl冰冷nluc裂解测定缓冲液(lysis assay buffer)中并置于冰上。然后将样品在定轨振荡器上以700rpm温育5分钟，然后在室温下离心以除去组织碎片。然后将50μl上清液转移到新试管中而不扰动组织沉淀物。将50μl各样品转移到96孔板中，并根据制造商的说明进行nano
‑
glo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，#n1110)测定。简言之，向各孔中添加1μl furimazine底物和49μl pbs并混合。添加底物并混合后，将板温育10分钟，然后在光度计仪器(普洛麦格公司)中读数。
[0384]
对于仅pbs中的线性mrna以及pbs+10％异丙醇中的线性mrna，在局部施用后4天，在组织样品中检测到纳米荧光素酶活性，并且在每种情况下均观察到高于相关的仅媒介物对照(图22和图23)。
[0385]
本实例证明mrna通过局部施用至皮肤而成功地递送至组织，并在组织中持续延长的时间段，并且能够表达功能性蛋白。实例25：当在施加前用聚维酮碘擦拭组织时，环状rna的局部施用导致将rna递送至组织。
[0386]
本实例描述通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0387]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0388]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7 rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0389]
然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0390]
在时间＝0时，用作为消毒剂的商业聚维酮碘(10％)擦拭小鼠的耳朵。用无菌棉拭子除去过量的聚维酮碘，并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0391]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
‑
pcr。在bio
‑
rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0392]
预计在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且观察到比仅媒介物对照更大的信号。
[0393]
本实例描述在用聚维酮碘(10％)擦拭皮肤后，环状rna通过局部施用成功递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。实例26：当在施加前用过氧化氢喷雾喷洒组织时，局部施用环状rna导致将rna递送至组织。
[0394]
本实例描述通过体内局部施用将未修饰的环状rna递送至细胞和组织的能力。
[0395]
在本实例中，用ires和编码纳米荧光素酶(nluc)的orf设计环状rna。
[0396]
环状rna在体外生成。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7 rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna 5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。将使用夹板dna(5
’‑
tttttcggctattcccaatagccgttttg
‑3’
(seq id no:11))和t4 rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素
‑
page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mm edta)中洗脱，经乙醇沉淀并重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。
[0397]
然后将rna用仅pbs稀释，使得每个样品的总样品体积为35μl，并且每个样品的总rna为20皮摩尔。作为阴性对照，如上所述制备仅媒介物对照，但不含rna。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前立即制备混合物。
[0398]
在时间＝0时，用作为消毒剂的市售过氧化氢(3％)喷洒小鼠的耳朵，用无菌棉拭子干燥并使用移液管尖端将35μl剂量的各样品局部地逐滴施加至balb/c小鼠的耳朵。通过将耳朵短暂地暴露于灭菌通风橱中的热灯和风扇来干燥样品。在正常条件下将小鼠放回笼中。
[0399]
为了确定rna在组织中的持久性，在递送后的不同时间点使用rt
‑
qpcr分析组织样品的rna。在施用后1天和4天，从每只动物取2mm的耳朵打孔样品并储存在rnalater溶液(赛
默飞世尔科技公司，目录号am7020)中。通过以下方式从耳朵打孔样品分离总rna：在液氮中快速冷却并用玻璃研钵和杵均化，然后进行trizol提取(赛默飞世尔科技公司目录号15596026)。将水相用异丙醇沉淀，并根据制造商的说明用70％etoh洗涤沉淀物。使用superscript iv(赛默科技公司，目录号11766500)从总rna合成cdna。使用itaq
tm
通用绿色超混合液(伯乐公司(bio
‑
rad)，目录号1725124)和对nluc orf具有特异性的引物(f：ccgtatgaaggtctgagcgg(seq id no:12)，r：cagtgtgccatagtgcagga(seq id no:13))在cdna模板上进行rt
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pcr。在bio
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rad cfx384热循环仪上一式三份地测定所有样品。然后将rna水平与管家基因(28s)相对化。
[0400]
预计在局部施用后1天和4天时在组织样品中检测到环状rna，并且观察到比仅媒介物对照更大的信号。
[0401]
本实例描述在用过氧化氢(3％)喷洒皮肤后，环状rna通过局部施用成功递送至组织，并在组织中持续延长的时间段。
[0402]
虽然已经在本文示出和描述了本发明的优选实施例，但是对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施例。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将清楚许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明的实施例的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。序列纳米荧光素酶dna模板seq id no:1emcv iresseq id no:2
高斯荧光素酶dna模板seq id no:3no:3epo dna模板seq id no:4cvb3 ires dna模板seq id no:5
绿色荧光蛋白dna模板seq id no:6