1.本发明涉及未使用交联剂制备且能够轻易注入到人体内的用于预防或治疗关节内病变的组合物及其制备方法。
背景技术：
：：2.退行性骨关节炎为因关节软骨磨损而导致关节内出现退行性变化的疾病，虽然尚未明确，但已知，其病因与衰老现象或体重过重增加密切相关。最近，作为骨关节炎的治疗方法，除减少体重、运动疗法等非药物治疗及使用非甾体类消炎镇痛剂等药物治疗外，广泛使用在关节内起到润滑作用的透明质酸注射液，其结果，可获得缓解症状并提高功能的功效。3.临床应用的低分子透明质酸(hyaluronan，hylan)需每周注射5次，并且，高分子透明质酸(hyruanplus，araganplus，)需每周注射3次。最大限度地减缓分解并能够维持体内滞留的xl-ha(durolanetm，synovian)也产品化为单剂量。4.透明质酸为关节软骨基质的组成成分，属于干涉制造蛋白聚糖(proteoglycan)的粘多糖类的一种，通过β1-4糖苷(glycosidic)键合连接的n-乙酰基-d-葡糖胺(nacetyl-d-glucosamine)和d-葡萄糖醛酸(d-glucuronicacid)的糖蛋白复合物。透明质酸由n-乙酰基-d-葡糖胺和d-葡萄糖醛酸组成，作为上述反复单位线性连接的生物高分子物质，大量存在于眼球的玻璃体液、关节的滑液及鸡冠等。透明质酸因优秀的生物相容性和粘弹性而广泛应用于眼科用手术辅助剂、药物传递物质及滴眼剂等的医疗及医疗用品、化妆品用途等。但由于，其本身在体内(invivo)或酸、碱等条件下容易被分解而导致其用途受到限制。因此，正在广泛开展开发结构稳定的透明质酸衍生物。5.透明质酸衍生物以手术后的防粘连剂、皱纹改善剂、成形辅助物、药物传递物及细胞培养支架(scaffold)等多种用途开发，尤其，正在积极研究用于商业用途的皱纹改善剂和成形辅助剂等。6.作为透明质酸衍生物的一种，使用交联剂将透明质酸相互共价键合而成的透明质酸交联物具有优秀的生物相容性、物理稳定性及生物降解性。7.但由于，通过现有公知方法制备的透明质酸交联物(透明质酸衍生物)对于透明质酸分解酶及热量的稳定性相对较低且难以去除未反应的化学物质，因此，在将其用作高纯度的生物相容性物质层面上存在限制。尤其，作为将多官能环氧类交联剂(polyfunctionalepoxide-basedcrosslinkingagent)用作交联剂的示例有通过美国专利第4716224号的方法制备的透明质酸交联物，其物理粘弹性低且添加的交联剂浓度高，因此，有可能以活性状态残留在反应物，或者，因反应后残留的未反应物残留量较高而具有反应效率降低且提纯过程变得困难的问题。即，虽然这种方法通过在碱性水溶液中混合交联剂和透明质酸来使得其在液相(liquidphase)中诱发交联反应，但是，在通常情况下，其反应性非常低，因此，需增加反应浓度或添加大量交联剂来提高物性，在此情况下，不仅难以制备成高浓度，而且，将产生在提纯过程中难以完美去除添加的大量交联剂的问题。8.因此，需要一种提高透明质酸的稳定性来使其长时间滞留在体内的同时容易适用于体内且无毒性的物质。技术实现要素：9.技术问题10.为了解决因交联剂引起的现有技术问题，在研究使透明质酸长时间滞留在体内的方法的过程中，本发明人确认到，当混合透明质酸和普朗尼克时，不仅增加滞留在体内的时间，还可轻易用作注射剂。进而，通过确认透明质酸和普朗尼克的混合物对于关节内病变及炎症的治疗效果来完成了本发明。11.因此，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物。12.本发明的再一目的在于，提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物的制备方法。13.本发明的另一目的在于，提供用于预防或治疗关节内病变的药物组合物。14.本发明的还有一目的在于，提供用于治疗关节内病变的注射剂用组合物。15.本发明的又一目的在于，提供用于治疗关节内病变的支架。16.本发明的又一目的在于，提供关节损伤治疗方法。17.本发明的又一目的在于，提供用于粘性补充的组合物。18.技术方案19.为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物，其包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。20.并且，本发明提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物的制备方法，其包括：步骤(1)，准备1w/v％至10w/v％的透明质酸作为第一溶液；步骤(2)，准备1w/v％至15w/v％的普朗尼克作为第二溶液；以及步骤(3)，混合上述第一溶液及第二溶液。21.并且，本发明提供用于预防或治疗关节内病变的药物组合物，其包含水凝胶组合物作为有效成分，上述水凝胶组合物包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。22.并且，本发明提供用于治疗关节内病变的注射剂用组合物，其包含上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物作为有效成分。23.并且，本发明提供用于治疗关节内病变的支架，其包含上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物作为有效成分。24.并且，本发明提供关节损伤治疗方法，其包括向个体给药上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物的步骤。25.并且，本发明提供用于粘性补充的组合物，其包含水凝胶组合物作为有效成分，上述水凝胶组合物包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。26.发明的效果27.当将本发明的水凝胶直接注入于关节的损伤部位时，由于具有治疗相应部位的关节内病变及炎症的效果，因此，本发明的水凝胶可有效用作用于预防或治疗关节内病变的组合物及粘性补充剂。尤其，本发明未使用交联剂制备的水凝胶可提高生物相容性、物理特性及对于热和裂合酶的稳定性，因增加的粘弹性而使关节内的分解时间较长，因此，具有吸收时间增加的优点。当用作注射剂时，能够长时间维持功效且无细胞毒性，因此，生物相容性非常优秀。由此，即使在体内的多种环境条件下，本发明的水凝胶还能够有用地使用，而且，可轻易注入于人体内并以无毒状态长时间滞留在体内。附图说明28.图1为示出随着温度及浓度产生变化的单独由透明质酸钠组成的水凝胶或单独由普朗尼克127(f127)组成的水凝胶的粘性的图。29.图2为示出随着透明质酸钠及普朗尼克127混合物的温度及浓度产生变化的水凝胶粘性的图。30.图3a至图3f为示出随着透明质酸钠单独、透明质酸钠及普朗尼克127混合物的浓度及温度变化产生的水凝胶的粘弹模量变化的图(图3a为针对1w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图，图3b为针对2w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图，图3c为针对3w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图，图3d为针对4w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图，图3e为针对5w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图，图3f为针对6w/v％的透明质酸钠+5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％的普朗尼克的图)。31.图4为示出用酶处理透明质酸钠和普朗尼克127混合物来确认水凝胶的分解能力的图。32.图5为示出针对与本发明的水凝胶相混合的细胞经过24小时后确认细胞存活率的图。33.图6为示出在利用大鼠制作的骨关节炎碘醋酸钠(mia，monosodiumiodoacetate)模型后给药本发明的水凝胶来确认骨关节炎炎症治疗效果的图。34.图7为示出在利用大鼠制作的骨关节炎内侧半月板损伤(dmm)模型经过8周后注入本发明的水凝胶来确认骨关节炎部位的程度及治疗关节炎的结果的图。具体实施方式35.以下，详细说明本发明。36.本发明提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物，其包含透明质酸及普朗尼克。37.本发明的水凝胶的特征在于，通过混合透明质酸及普朗尼克来制备而成，且未使用交联剂。因此，本发明的透明质酸及普朗尼克可在临床使用范围内适当混合使用。优选地，在能够获得对于关节内病变的预防或治疗效果的浓度范围内，能够以提高注射相容性并增加生物体滞留时间的适当混合比例混合来使用。38.本发明提供用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物，其包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。39.优选地，本发明的水凝胶可包含1w/v％至9w/v％、1w/v％至8w/v％、1w/v％至7w/v％、1w/v％至6w/v％、1w/v％至5w/v％、1w/v％至4w/v％、1w/v％至3w/v％、1w/v％至2w/v％、2w/v％至10w/v％、2w/v％至9w/v％、2w/v％至8w/v％、2w/v％至7w/v％、2w/v％至6w/v％、2w/v％至5w/v％、2w/v％至4w/v％、2w/v％至3w/v％、3w/v％至10w/v％、3w/v％至9w/v％、3w/v％至8w/v％、3w/v％至7w/v％、3w/v％至6w/v％、3w/v％至5w/v％、3w/v％至4w/v％、4w/v％至10w/v％、4w/v％至9w/v％、4w/v％至8w/v％、4w/v％至7w/v％、4w/v％至6w/v％、4w/v％至5w/v％、5w/v％至10w/v％、5w/v％至9w/v％、5w/v％至8w/v％、5w/v％至7w/v％、5w/v％至6w/v％、6w/v％至10w/v％、6w/v％至9w/v％、6w/v％至8w/v％、6w/v％至7w/v％、7w/v％至10w/v％、7w/v％至9w/v％、7w/v％至8w/v％、8w/v％至10w/v％、8w/v％至9w/v％或9w/v％至10w/v％的透明质酸，但并不限定于此。40.并且，本发明的水凝胶可包含1w/v％至14w/v％、1w/v％至13w/v％、1w/v％至12w/v％、1w/v％至11w/v％、1w/v％至10w/v％、1w/v％至9w/v％、1w/v％至8w/v％、1w/v％至7w/v％、1w/v％至6w/v％、1w/v％至5w/v％、1w/v％至4w/v％、1w/v％至3w/v％、1w/v％至2w/v％、2w/v％至15w/v％、2w/v％至14w/v％、2w/v％至13w/v％、2w/v％至12w/v％、2w/v％至11w/v％、2w/v％至10w/v％、2w/v％至9w/v％、2w/v％至8w/v％、2w/v％至7w/v％、2w/v％至6w/v％、2w/v％至5w/v％、2w/v％至4w/v％、2w/v％至3w/v％、3w/v％至15w/v％、3w/v％至14w/v％、3w/v％至13w/v％、3w/v％至12w/v％、3w/v％至11w/v％、3w/v％至10w/v％、3w/v％至9w/v％、3w/v％至8w/v％、3w/v％至7w/v％、3w/v％至6w/v％、3w/v％至5w/v％、3w/v％至4w/v％、4w/v％至15w/v％、4w/v％至14w/v％、4w/v％至13w/v％、4w/v％至12w/v％、4w/v％至11w/v％、4w/v％至10w/v％、4w/v％至9w/v％、4w/v％至8w/v％、4w/v％至7w/v％、4w/v％至6w/v％、4w/v％至5w/v％、5w/v％至15w/v％、5w/v％至14w/v％、5w/v％至13w/v％、5w/v％至12w/v％、5w/v％至11w/v％、5w/v％至10w/v％、5w/v％至9w/v％、5w/v％至8w/v％、5w/v％至7w/v％、5w/v％至6w/v％、6w/v％至15w/v％、6w/v％至14w/v％、6w/v％至13w/v％、6w/v％至12w/v％、6w/v％至11w/v％、6w/v％至10w/v％、6w/v％至9w/v％、6w/v％至8w/v％、6w/v％至7w/v％、7w/v％至15w/v％、7w/v％至14w/v％、7w/v％至13w/v％、7w/v％至12w/v％、7w/v％至11w/v％、7w/v％至10w/v％、7w/v％至9w/v％、7w/v％至8w/v％、8w/v％至15w/v％、8w/v％至14w/v％、8w/v％至13w/v％、8w/v％至12w/v％、8w/v％至11w/v％、8w/v％至10w/v％、8w/v％至9w/v％、9w/v％至15w/v％、9w/v％至14w/v％、9w/v％至13w/v％、9w/v％至12w/v％、9w/v％至11w/v％、9w/v％至10w/v％、10w/v％至15w/v％、10w/v％至14w/v％、10w/v％至13w/v％、10w/v％至12w/v％、10w/v％至11w/v％、11w/v％至15w/v％、11w/v％至14w/v％、11w/v％至13w/v％、11w/v％至12w/v％、12w/v％至15w/v％、12w/v％至14w/v％、12w/v％至13w/v％、13w/v％至15w/v％、13w/v％至14w/v％或14w/v％至15w/v％的普朗尼克，但并不限定于此。41.根据本发明的一实施例，当包含约3w/v％至8w/v％的透明质酸、约5w/v％至10w/v％的普朗尼克时，本发明的水凝胶表现出优秀的关节内病变及炎症治疗效果，尤其，当包含约4w/v％至9w/v％的透明质酸及约10w/v％的普朗尼克时，表现出最优秀的骨关节炎治疗效果。42.因此，优选地，上述水凝胶组合物可包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克，更优选地，可包含4w/v％至9w/v％的透明质酸及9w/v％至11w/v％的普朗尼克，但并不限定于此。43.根据本发明的一实施例，若包含小于上述范围浓度的透明质酸，则有可能导致水凝胶的物理粘弹性降低，从而产生本发明的水凝胶所目标的关节内病变及炎症治疗效果降低的问题，若包含大于上述范围浓度的透明质酸，则有可能导致粘弹性增加，从而导致关节内注射相容性(injection)及注射剂功效减少，或者，有可能在给药后会引起关节部位持续不适的问题。并且，若包含小于上述范围浓度的普朗尼克，则有可能随着物理粘弹性的降低而导致注射剂相容性减少，若包含大于上述范围浓度的普朗尼克，则因粘弹性的增加而导致注射剂相容性及注射剂功效减少，有可能在给药后会引起关节部位持续不适或在生物体内诱发细胞毒性(cytotoxicity)的问题。44.在实际情况下，当本发明的水凝胶包含1％浓度或2％浓度的透明质酸时，相比于包含3％浓度以上的水凝胶，表现出显著稀释的浓度。45.本发明的透明质酸可以为透明质酸本身或透明质酸盐，上述透明质酸盐可以为选自由透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴及透明质酸四丁基铵组成的组中的一种或一种以上，但并不限定于此。46.并且，本发明的普朗尼克可不受限地包含所属领域中公知的普朗尼克，例如，可以为普朗尼克f127、普朗尼克p123或普朗尼克l44。47.在本发明中，上述关节内病变可以为软骨损伤或关节炎。48.作为本发明的病变及炎症的治疗对象的软骨是指透明软骨(hyalinecartilage)、纤维软骨(fibrocartilage)或弹性软骨(elasticcartilage)。纤维软骨为由白色纤维组织和软骨组织以多种比例混合而成的软骨，虽然抗压性较强，但易撕裂，以致密状态排列形成。纤维软骨以与透明软骨或结合组织相连接的方式存在，通过在产生扭曲或压迫的部位起到缓冲作用来以能够实现限制性动作的方式维持弹力。透明软骨主要由ii型胶质组成，虽然能够观察到均匀分布的纤维成分和无定形物质，但是，弹性软骨与透明软骨的差异在于，弹性软骨的基质内弹性纤维较为丰富，而相比于透明软骨及弹性软骨，纤维软骨具有如下的明显差异，即，无定形物质较少且胶质纤维较多并以规定排列连接而成。尤其，组成纤维软骨的胶质纤维的差异在于，胶质为i型胶质，因此，不同于弹性软骨、透明软骨，纤维软骨并没有明显的软骨膜。在纤维软骨中，已知形成层板的i型胶质纤维束与相邻的层板排列形成为直角，因此，不同于其他软骨，由于上述特征性排列，纤维软骨能够在椎间盘等具有特别的弹性，从而可有效承受因体重负荷等而生成的压力。49.在本发明中，上述软骨可包括存在于透明软骨、椎间盘或髋臼唇、关节半月板部位中的多种纤维软骨及存在于外耳(externalear)、会厌及部分喉软骨区域中的多种弹性软骨，优选地，可以为选自由半月板(meniscus)、关节软骨(articularcartilage)、耳软骨、鼻软骨、肘软骨、膝软骨、肋软骨、踝关节软骨、气管软骨、喉软骨、脊椎软骨、椎间盘软骨(intervertebraldisc)、耻骨联合(symphysispubis)软骨、关节内纤维软骨复合体(fibrocartilagecomplex)、颞下颌关节软骨、胸锁关节(sternoclavicularjoint)的关节盘、髋臼窝(acetabularfossa)软骨、外耳(externalear)及会厌(epiglottis)组成的组中的一种以上。50.上述半月板为位于大腿骨与胫骨的关节面之间且在维持膝关节功能时起到非常重要的结构之一，不仅分散膝关节的荷重及压力并吸收冲击，而且，通过在关节软骨起到润滑作用并吸收外部冲击来保护关节软骨，从而起到非常重要的作用。像这样，半月板由位于膝关节之间的半月状软骨形成，软骨盘在关节之间起到缓冲作用，在站立、走动或跑动情况下，当体重从上往下传递时，通过吸收冲击来防止关节软骨产生损伤。由此可知，在预防退行性关节炎层面上，软骨盘非常重要。51.并且，上述关节内病变可因选自由退行性关节炎、风湿性关节炎、半月板损伤、椎间盘突出症、耻骨间盘损伤、颞下颌关节损伤、胸锁关节盘损伤、腕关节三角纤维软骨复合体撕裂、尺骨撞击综合征、外耳(externalear)缺损及会厌(epiglottis)软骨缺损或喉软骨缺损组成的组中的一种以上疾病引起，但并不限定于此。52.更具体地，本发明的用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物可用于向选自由退行性关节炎(degenerativearthritis)、发炎性关节炎(inflammatoryarthritis)、风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、骨软骨瘤病(osteochondromatosis)、捻挫(distortion)、滑囊炎(bursitis)、半月板损伤(menstruation)、半月板撕裂(meniscaltear)、半月板囊肿(meniscuscyst)、侧部韧带损伤(collateralligamentrupture)、前十字韧带损伤(anteriorcruciateligamentinjury)、后十字韧带损伤(posteriorcruciateligamentinjury)、关节内玻璃体(intra-articularvitreous)、剥脱性骨软骨炎(exfoliationosteochondritis)、皱襞综合征(plicasyndrome)、膝内翻(genuvarum)、膝外翻(knock-knee)及弹响膝(snappingknee)组成的组中的一种以上疾病给药。53.本发明的水凝胶组合物的特征在于，能够用注射器注射(injectable)。本发明的水凝胶的特征在于，通过混合透明质酸和普朗尼克来制备而成，通过改善在不同温度条件下的弹性及粘度来增加注射相容性。因此，若利用本发明的水凝胶，则可通过调节高弹性和粘度来将其用作注入型治疗剂，无需外科手术。像这样，当以注入型治疗剂、填充剂或注射剂等剂型使用时，本发明的水凝胶可适用于治疗因磨损、撕裂、退行性关节炎等而损伤的关节。54.本发明的用于预防或治疗关节内病变的水凝胶组合物可通过如下方法制备，其方法包括：步骤(1)，准备1w/v％至10w/v％的透明质酸作为第一溶液；步骤(2)，准备1w/v％至15w/v％的普朗尼克作为第二溶液；以及步骤(3)，混合上述第一溶液及第二溶液。55.上述第一溶液及第二溶液可不受限地使用对人体无害且能够溶解的溶液。可根据用途使用选自由生理盐水(salinesolution)、蒸馏水、缓冲溶液、化妆品防腐剂及药用防腐剂组成的组中的一种以上制备，但并不限定于此。并且，溶液还可包含治疗关节内病变及炎症所需的生理活性物质，上述生理活性物质可以为生长因子。56.并且，本发明提供用于预防或治疗关节内病变的药物组合物，其可包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。57.上述关节内病变可以为纤维软骨缺损或弹性软骨缺损，是指纤维软骨、纤维软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节膜、软骨下骨等)因机械刺激或炎症反应而受损的纤维软骨损伤或因其他先天性或后天性因素产生的弹性软骨损伤或缺陷。上述关节内病变可以为选自由退行性关节炎、风湿性关节炎、软骨损伤、半月板损伤、椎间盘突出症、耻骨间盘损伤、颞下颌关节损伤、胸锁关节盘损伤、腕关节三角纤维软骨复合体撕裂、尺骨撞击综合征、外耳缺损(externalear)及会厌(epiglottis)软骨缺损或喉软骨缺损组成的组中的一种以上。上述椎间盘突出症还称为椎间盘突出(disc)，还可发生在椎体间或耻骨之间。上述退行性关节炎及风湿性关节炎为因纤维软骨或弹性软骨的损伤引起或恶化的疾病，可通过使纤维软骨或弹性软骨的损伤得到修复并再生来实现治疗或改善。与此关联地，在本发明所属领域中，为了治疗膝关节的早期退行性骨关节炎，在进行软骨板切除术中进行最低限度的切除，或在软骨板缺损严重的情况下，通过执行软骨板移植术等手术方法来使纤维软骨或弹性软骨的损失最小化，或者，可通过代替方法来减少退行性骨关节炎的发病。58.本发明的水凝胶通过混合普朗尼克和透明质酸来制备而成，由于在不同温度条件下的弹性及粘度得到改善，使得注射相容性得以改善，本发明提供用于治疗关节内病变的注射剂用组合物，其包含上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物作为有效成分。59.本发明的组合物为用于软骨再生的水凝胶组合物，可有效利用注射器等以最低浸湿程度向损伤关节的需治疗部位给药。尤其，也可在体内的多种环境中有效使用，可轻易注入于体内并以无毒性的状态长时间滞留在体内，因此，可将其用作治疗用载体。60.由此，本发明提供用于治疗关节内病变的支架，其包含上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物作为有效成分。61.并且，本发明提供受损的关节内病变的治疗方法，其包括向个体给药上述用于预防或治疗关节内病变的药物组合物的步骤。62.在本发明中所使用的术语“个体”是指包括人在内的具有关节内病变且能够通过给药本发明的上述药物组合物来改善症状的哺乳动物，例如，马、羊、猪、山羊、狗等，优选地，是指人。63.本发明的用于预防或治疗关节内病变的药物组合物可向关节等目标部位直接注射或移植来使用。64.本发明的药物组合物可经常、每天、每周、每周数次、每隔两个月、每月数次、以月单位的频率给药，或者，也可为了缓解症状而以所需频率进行给药。当用于关节内时，可根据关节的尺寸及状态的严重程度来调节组合物的剂量。向该关节的后续给药频率基于上述关节中的症状复发时间存在间隔。65.针对任意特定患者的特定剂量水平可基于所采用的组合物活性、年龄、体重、整体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合及治疗中的特定疾病严重程度等多种因素来作出适当调节。药物组合物可被制备成剂量单位并给药。但是，在特别情况下，可适用更多或更少的剂量单位。上述剂量单位的给药均可通过上述组合物的单次给药和/或以特定间隔分剂量的多次给药来执行，或者，给药可通过多个较小剂量单位执行。66.在一具体例中，关节内病变因半月板损伤引起，例如，上述组合物向膝等关节空间给药。67.例如，针对具有膝关节半月板损伤的个体，可向每个膝关节执行1次、2次或3次的约2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml以上的注射。在其他关节的情况下，给药的体积可基于其关节尺寸作出调节。68.本发明的药物组合物包含上述水凝胶组合物作为有效成分，除此之外，还可包含药剂学上可接受的载体。69.本发明的组合物所包含的药剂学上可接受的载体为制剂时通常使用的载体，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除上述成分外，本发明的组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。70.本发明的药物组合物可通过本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员容易实施的方法并利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来制剂化，可制备成单剂量形态或内入于多剂量容器内来制备。在此情况下，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者，也可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且，还可包含分散剂或稳定剂。71.在本发明中，术语“治疗”是指通过组合物的给药或涂敷来有效治疗关节内病变或炎症或者关节疾病等的所有行为。本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员可参照韩国医药协会等所提供的资料来了解针对软骨损伤或关节疾病等本发明组合物有效的疾病的准确基准，由此，可判断改善、增强及治疗的程度。72.在本发明中，术语“预防”是指通过给药本发明的组合物来抑制或缓解本组合物有效疾病发病的所有行为。对于本发明所属领域的普通技术人员显而易见的是，在出现相关疾病的早期症状或者出现之前服用或给药的情况下，对关节内病变或炎症具有治疗效果的本发明组合物可预防上述疾病。73.并且，本发明提供用于粘性补充的组合物，其包含水凝胶组合物作为有效成分，上述水凝胶组合物包含1w/v％至10w/v％的透明质酸及1w/v％至15w/v％的普朗尼克。74.上述粘性补充为当前唯一经过验证的针对早期症状的骨关节疾病治疗方法，是指通过向患者的关节内注射一次或一次以上的透明质酸来补充患有关节症的患者的滑液囊中有所降低的透明质酸盐(hyaluronate)水平的治疗方法。75.在互不矛盾的情况下，上述本发明的内容同等适用，本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员通过适当变更来实施的所有内容均属于本发明的范畴。76.以下，通过实验例及实施例详细说明本发明，但是，本发明的范畴并不仅限定于以下实验例及实施例。77.实施例1.水凝胶制备78.制备用于治疗损伤关节的病变及炎症的水凝胶组合物。79.1.1利用透明质酸钠和普朗尼克f127制备水凝胶80.为了利用透明质酸钠和普朗尼克f127制备水凝胶，制备第一溶液及第二溶液。当混合第一溶液和第二溶液时，在盐水(saline)中溶解透明质酸钠(sodiumhyaluronate，3.3m3/kg)来制备第一溶液，以使得最终浓度变为1w/v％至10w/v％，并且，向普朗尼克(pluronic)f127(basf)粉末添加盐水并在4℃的温度条件下进行溶解来制备第二溶液，以使得浓度变为1w/v％至15w/v％。81.1.2凝胶化确认82.将单独包含透明质酸钠的溶液作为第一溶液，将单独包含普朗尼克f127的溶液作为第二溶液，混合第一溶液及第二溶液后，分别在室温及37℃的温度条件下确认是否产生凝胶化(gelation)。其中，为了直接确认是否产生凝胶化，通过混合低浓度的3w/v％透明质酸钠和普朗尼克来制备水凝胶，是否产生凝胶化的结果如图2所示(左侧实验组：3w/v％的透明质酸钠及5w/v％的普朗尼克，中间实验组：3w/v％的透明质酸钠及6w/v％的普朗尼克，右侧实验组：3w/v％的透明质酸钠及7w/v％的普朗尼克)。83.其结果如图1及图2所示，经确认，当单独包含透明质酸钠时，在室温及37℃的温度条件下，通过凝胶化(gelation)形成三维结构体水凝胶。但是，当单独包含普朗尼克f127时，在室温及37℃的温度条件下，处于液体状态。并且，同时，在室温及37℃的温度条件下，将其作为第一溶液及第二溶液混合的组合物均通过凝胶化形成三维结构体水凝胶。尤其，如图2所示，经确认，即使包含低浓度的3w/v％透明质酸钠也产生凝胶化。84.实施例2.随着添加普朗尼克f127产生变化的可注射性(injectability)85.当向透明质酸钠添加普朗尼克f127时，确认水凝胶的可注射性。混合透明质酸钠以使得最终浓度变为1w/v％至10w/v％，混合普朗尼克f127以使得最终浓度变为0w/v％至15w/v％。确认各个制备例在室温条件下的可注射性变化，其结果如表1所示。86.表1[0087][0088]测定可注射性的结果如上述表1所示，在透明质酸钠的浓度为1w/v％至10w/v％及普朗尼克f127的浓度为0w/v％至15w/v％的整个浓度范围内，18g注射器均表现出可注射性，但是，当透明质酸酸的浓度增加至9％以上时，21g注射器表现出较低的可注射性。尤其，确认到在透明质酸钠的浓度为1w/v％至6w/v％及普朗尼克f127的浓度为0w/v％至15w/v％的浓度中，注射便利性尤为优秀。[0089]实施例3.随着添加普朗尼克f127产生变化的不同温度条件下的粘弹性模量确认[0090]当向透明质酸钠添加普朗尼克f127时，确认水凝胶在不同温度条件下的粘度特性。混合透明质酸钠以在最终混合组合物中的浓度变为1w/v％至6w/v％，在上述浓度范围内，表现出最佳注射便利性。制备普朗尼克f127以在最终混合组合物中的浓度变为5w/v％、8w/v％、10w/v％、13w/v％或15w/v％。为了测定随着温度产生变化的粘弹性，使用直径为25mm的板并利用振动模式的流变仪(mcr702，antonpaarkorea)装置进行测定(条件，角频率(angularfrequency)：10rad/s、切应变(shearstrain)：1％、间隔(gap)：1mm、升温速度：2℃/min)。[0091]在不同温度条件下的粘度测定结果如图3a至图3f所示，经确认，在单独包含透明质酸钠的情况下，虽然并没有随着温度产生粘度变化，但是，随着作为温度感应型的普朗尼克f127的浓度产生粘度变化。由此，相比于单独包含透明质酸钠，使用基于普朗尼克f127的浓度选择的混合制剂在室温条件下更加便于注射，并且，在向关节腔内给药的情况下，随着水凝胶的粘度提高，可判断治疗效果维持得更久。[0092]实施例4.透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶的分解能力确认[0093]为了确认本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶的分解能力而利用胰蛋白酶(trypsin)来测定分解方式。混合透明质酸钠以使得其最终浓度变为1w/v％至8w/v％，混合普朗尼克f127以使得其最终浓度变为5w/v％至15w/v％。分解能力的测定结果如图4所示，在单独包含透明质酸钠的情况下，随着浓度的分解程度存在时间上的差异。在1％或3％的情况下，若经过6小时，则难以区分其形态，而在其他浓度的情况下，若经过24小时，则因均被分解而难以区分凝胶形态。但是，在混合透明质酸钠和普朗尼克制备的水凝胶可持续30天左右。由此判断，当向关节腔内给药水凝胶时，相比于仅包含透明质酸钠的单独的水凝胶，混合透明质酸钠和普朗尼克制备的水凝胶可通过减少关节腔内的分解速度来使得治疗效果维持得更久。[0094]实施例5.透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶内的细胞存活率确认[0095]为了确认本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶的细胞毒性而确认细胞存活率。混合透明质酸钠以使其最终浓度变为3w/v％至8w/v％，混合普朗尼克f127以使其最终浓度变为0w/v％至15w/v％。为了确认细胞存活率，首先，培养初始软骨细胞(primarychondrocyte)并混合水凝胶。随后，利用活/死细胞染色试剂盒(live/deadassaykit)(invitrogen)分别对活细胞和死细胞进行染色后，使用荧光显微镜(amf4300，evos，lifetechnology)进行观察。其结果，确认到细胞在大部分浓度条件下存活而没有凋亡，其中，将作为最高浓度的最终浓度为8w/v％的透明质酸钠和最终浓度为10w/v％至15w/v％的普朗尼克f127混合的水凝胶以10倍率图像拍摄4次，并通过以下公式计算细胞存活率并进行比较，其结果如图5所示。[0096]细胞存活率＝活细胞数量/总细胞数量×100[0097]如图5所示，相比于单独包含透明质酸钠，在包含普朗尼克f127制备的水凝胶中几乎没有观察到被染成红色的凋亡细胞，但是，在混合8w/v％的透明质酸钠和15w/v％的普朗尼克制备的水凝胶中，可确认到20％左右的细胞凋亡。并且，基于时间确认水凝胶细胞存活/凋亡的荧光图像的结果，相比于单独包含透明质酸钠的水凝胶，本发明的混合透明质酸钠及普朗尼克f127的水凝胶并没有细胞存活层面上明显差异。由此确认，当向生物体内给药时，本发明的水凝胶不仅长时间滞留于生物体内，而且，具有优秀的生物相容性。[0098]实施例6.在骨关节炎动物模型中的抗炎功效评估[0099]为了验证本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶是否在骨关节炎动物模型中表现出抗炎效果而执行以下实验。为此，针对混合透明质酸钠和普朗尼克的多种浓度，如同在上述实施例中确认的结果，以表现出适当的粘弹性并表现优秀的注射相容性且无法引起细胞凋亡的浓度筛选来制备。因此，在本实验中，利用混合3w/v％的透明质酸钠和5w/v％的普朗尼克、5w/v％的透明质酸钠和10w/v％的普朗尼克或8w/v％的透明质酸钠和10w/v％的普朗尼克制备而成的水凝胶。[0100]首先，为了利用大鼠(rat)制备骨关节炎动物模型，基于体重注射适当量的氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(rompun)来麻醉后，确认大鼠已完全麻醉并剃除右下肢的膝关节部位的毛，随后，在维持姿势的情况下用创可贴进行固定。用聚维酮对两侧膝关节部位进行消毒并触诊膝盖骨来确认膝关节位置。接着，用0.9％盐水稀释作为骨关节炎诱发物质的碘醋酸钠(mia,monosodiumiodoacetate)(sigma.chemicalco.ltd,cat.no.i2512,usa)并使用31g的1ml胰岛素注射器(insulinsyringe)(bdmedical-diabetescare,usa)向右侧膝关节内给药50μl(60mg/ml)。在诱发骨关节炎1周后，测定关节的直径并将其配置为每组同等水平，随后，分别向上述动模模型的关节腔给药一次20μl的单独包含透明质酸钠或混合透明质酸钠和普朗尼克f127制备的混合物。确认大鼠从麻醉中醒来后，允许大鼠能够自由活动并经过1周后，分别测定各组的关节直径，其结果如图6所示。[0101]炎症程度的评估以关节炎变化引起的关节肿胀(jointswelling)作为炎症指标，利用精密数值测定器(电子数显卡尺)(mitutoyo，japan)测定内外直径(diameter)并计算绝对值(absolue)(右关节直径-左关节直径(rightjointdiameter-leftjointdiameter))。[0102]其结果如图6所示，虽然单独包含透明质酸钠的混合物在骨关节炎动物模型中表现出10％至15％左右的抗炎效果，但是，在透明质酸钠和普朗尼克f127混合物处理组中确认到更加优秀的抗炎效果。相比于给药单独包含透明质酸钠的情况，本发明的透明质酸钠和普朗尼克f124混合物可显著减少炎症。尤其，混合5w/v％的透明质酸钠及10w/v％的普朗尼克来制备的水凝胶组合物的抗炎效果尤为优秀。[0103]因此，相比于对照组，本发明的水凝胶可通过组成成分来增加抗炎效果，并且，非常适合用作治疗受损关节中产生的炎症的药物制剂。[0104]实施例7.在骨关节炎动物模型中的关节内病变治疗效果验证[0105]为了验证本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶在骨关节炎动物模型中针对关节内病变的治疗效果，执行以下实验。[0106]首先，为了利用大鼠(rat)制备骨关节炎动物模型，基于体重注射适当量的氯胺酮和甲苯噻嗪来麻醉后，确认大鼠已完全麻醉并剃除两侧下肢的膝关节部位的毛，随后，在维持姿势的情况下用创可贴进行固定。用聚维酮对两侧膝关节部位进行消毒并触诊膝盖骨来确认位置后，以沿着经过膝关节的上方、下方、膝盖骨的内侧的切开线接近旁正中(paramedianapproach)到达膝关节内侧的方式向外侧掀开膝盖骨并弯曲膝关节来确认关节内部。确认没有特异病变后，制作内侧半月板受损的内侧半月板损伤(dmm，destabilizationofthemedialmeniscus)模型。如上所述，在诱发损伤4周和8周后，通过观察损伤部位来确认是否诱发骨关节炎。随后，利用注射器向上述动物模型的关节腔分别注入20μl的单独包含透明质酸钠或以与上述实施例6相同浓度混合制备的透明质酸钠和普朗尼克f127混合物。确认大鼠从麻醉中醒来后，允许大鼠能够自由活动，术后持续3天给药镇痛剂和抗生素。在给药经过8周后，从各个大鼠获取曾受损并接收治疗的关节部位的切片并进行番红o(safranineo)染色，随后，利用oarsi评分系统的定量化来分析骨关节炎的损伤程度。[0107]其结果如图7所示，经确认，相比于仅单独包含透明质酸钠制备的对照组水凝胶，在注入本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶的组中，在给药8周后的关节软骨的病变得到治疗并朝向骨关节炎的发展得到抑制。尤其，在给药以5w/v％的透明质酸钠及10w/v％的普朗尼克或8w/v％的透明质酸钠及10w/v％的普朗尼克浓度混合制备的水凝胶组合物的情况下，因骨关节炎引起的损伤程度最小。由此，通过这种结果确认到，当向大鼠骨关节炎模型注入本发明的透明质酸钠和普朗尼克f127混合水凝胶时，不仅可治疗关节软骨的病变，而且，可抑制朝向骨关节炎的发展。[0108]综上，本发明属于生物相容性非常优秀的水凝胶组合物，由透明质酸及普朗尼克以最佳浓度混合制备而成，因此，在未使用交联剂制备的情况下，改善不同温度条件下的弹性及粘度来增加注射剂相容性并增加生物体内的滞留时间。尤其，本发明的水凝胶组合物具有治疗关节病变或抑制朝向骨关节炎发展的效果，因此，可有效用作用于预防或治疗关节内病变的组合物及粘性补充剂。当前第1页12当前第1页12