结合BCMA的二聚体抗原受体(DAR)的制作方法

结合bcma的二聚体抗原受体(dar)
1.相关申请
2.本技术要求于2019年9月5日提交的美国临时专利申请第62/896,190号、于2019年9月6日提交的美国临时专利申请第62/896,990号、于2019年10月3日提交的美国临时专利申请第62/910,341号、于2019年12月3日提交的美国临时专利申请第62/943,069号和于2020年5月26日提交的美国临时专利申请第63/030,145号的优先权，这些美国临时专利申请中的每个的全部内容特此通过引用并入本文中。
3.序列表
4.本技术含有已经以ascii格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。创建于2020年7月24日的所述ascii副本命名为“2020-07-24_01223-0012-00pct_sequence_listing_st25.txt”，并且大小为167,936字节。
技术领域
5.本公开提供了与靶抗原特异性结合的二聚体抗原受体(dar)蛋白构建体、编码所述二聚体抗原受体的核酸、包含所述核酸的载体以及携带所述载体的宿主细胞。
6.

背景技术：
和

技术实现要素：

7.嵌合抗原受体(car)已经被开发以靶向具体地与癌症相关的抗原。第一代car被工程化以含有仅递送活化刺激(信号1)的信号传导结构域(tcrζ)(geiger等人,《免疫学杂志(j.immunol.)》162(10):5931-5939,1999；haynes等人,《免疫学杂志)》166(1):182-187,2001)(hombach等人.《癌症研究(cancer res.)》61(5):1976-1982,2001；hombach等人,《免疫学杂志》167(11):6123-6131,2001；maher等人,《自然生物技术(nat.biotechnol.)》20(1):70-75,2002)。用第一代car单独移植的t细胞由于次优活化而展现出有限的抗肿瘤功效(beecham等人,《免疫疗法杂志(j.immunother.)》23(6):631-642,2000)。第二代car，即免疫球蛋白-cd28-t细胞受体(igcd28tcr)，将共刺激cd28(信号2)并入到第一代受体中(gerstmayer等人,《免疫学杂志》158(10):4584-4590,1997；emtage等人,《临床癌症研究(clin.cancer res.)》14(24):8112-8122,2008；lo,ma等人,《临床癌症研究》16(10):2769-2780,2010)，这导致car-t细胞具有更强的抗肿瘤能力(finney等人,《免疫学杂志》161(6):2791-2797,1998；hombach等人,《癌症研究》61(5):1976-1982,2001,maher等人,《自然生物技术》20(1):70-75,2002)。通过用具有类似功能的分子(如fcrγ、4-1bb和ox40)替代tcrζ或cd28的信号结构域，已经开发了各种car变体(eshhar等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u s a)》90(2):720-724,1993)。已经开发了针对各种肿瘤抗原的tcr car-t细胞(ma等人,《癌症基因疗法(cancer gene ther.)》11(4):297-306,2004；ma等人,《前列腺》61(1):12-25,2004；lo等人,《临床癌症研究》16(10):2769-2780,2010；kong等人,《临床癌症研究》18(21):5949-5960,2012；ma等人,《前列腺》74(3):286-296,2014；katz等人,《临床癌症研究》21(14):3149-3159,2015；junghans等人,2016《前列腺》,76(14):1257-1270)。
8.通过输注用嵌合抗原受体(car)工程化的t细胞用于重定向杀瘤活性的过继免疫
疗法代表了一种用于治疗转移癌的潜在高特异性方式。靶向cd19(即在b细胞上表达的分子)的car-t细胞在治疗b细胞恶性肿瘤上已经获得成功并且已经获得fda批准，其中一些试验示出高达70％的应答率，包括持续的完全应答。然而，car-t细胞可能示出非特异性激活，这可能通过不恰当免疫活性导致潜在的严重不良事件。
9.因此，本领域中仍然需要利用具有加强特异性的car治疗的强大功效。
10.本文中公开了包含在分开的多肽链中的抗体重链结合区和抗体轻链结合区两者的抗原受体以及其在定向细胞疗法中的用途，以努力满足此需求和/或提供其它益处或者至少向公众提供有用的选择。在一些实施方式中，本公开提供了包含第一多肽链和第二多肽链的二聚体抗原受体(dar)以及表达此类dar的细胞，所述dar例如形成与跨膜区和细胞内区接合的fab片段。在一些实施方式中，例如与表达传统car的t细胞相比，表达dar的t细胞可以示出靶向特异性扩增和细胞毒性。权利要求书和说明书中详细阐述了根据本公开的实施方式。
附图说明
11.图1a是示出包含两个细胞内信号传导序列的示例性二聚体抗原受体的示意图。
12.图1b是示出包含三个细胞内信号传导序列的示例性二聚体抗原受体的示意图。
13.图2a是示出包含两个细胞内信号传导序列的示例性二聚体抗原受体的示意图。
14.图2b是示出包含三个细胞内信号传导序列的示例性二聚体抗原受体的示意图。
15.图3a是示出包含自切割序列和三个细胞内信号传导序列的示例性前体多肽分子的示意图。
16.图3b是示出包含自切割序列和两个细胞内信号传导序列的示例性前体多肽分子的示意图。
17.图4a是示出包含自切割序列和三个细胞内信号传导序列的示例性前体多肽分子的示意图。
18.图4b是示出包含自切割序列和两个细胞内信号传导序列的示例性前体多肽分子的示意图。
19.图5a示出了比较表达两个不同版本的bcma嵌合抗原受体(car)构建体的转基因t细胞(供体1)的流式细胞术研究的结果。在转染后13天收集数据。阴性对照是非转基因活化的t细胞(atc)。另一个阴性对照是trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)。实施例5中描述了转染效率和表达水平流式细胞术研究。
20.图5b示出了(在第11天)比较表达三个不同版本的bcma-2c5二聚体抗原受体(dar)构建体的转基因t细胞(供体1)的流式细胞术研究的结果。阴性对照是来自图5a的trac-阴性t细胞系。示出了表达以下不同dar构建体的转基因细胞的比较：dar v2c构建体；dar v3a构建体；以及dar v3b构建体。在转染后13天收集数据。实施例5中描述了转染效率和表达水平流式细胞术研究。
21.图6是示出表达bcma car或bcma dar的t细胞(供体1)对rpmi 8226靶细胞的细胞毒性百分比的图表。线a指示阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)；线b指示dar bcma-2c5 v2c构建体；线c指示car bb2121构建体；线d(虚线)指示dar bcma-2c5 v3a构建体；线e指示dar bcma-2c5 v3b构建体；并且线f指示car bcma-2c5构建体。实施例6
中描述了细胞毒性研究。
22.图7a是示出(靶标刺激后40小时)从阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)或表达以下的t细胞(供体1)中释放ifn-γ的水平的条形图：car bb2121构建体；car bcma-2c5构建体；dar bcma-2c5 v2c构建体；dar bcma-2c5 v3a构建体；或dar bcma-2c5 v3b构建体。每个数据集从左到右示出了u266细胞(bcma阳性细胞)、k562细胞(bcma阴性细胞)、仅介质或rpmi 8226细胞(bcma阳性细胞)。实施例7中描述了细胞因子释放研究。
23.图7b是示出(靶标刺激后40小时)从阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)或表达以下的t细胞(供体1)释放gm-csf的水平的条形图：car bb2121构建体；car bcma-2c5构建体；dar bcma-2c5 v2c构建体；dar bcma-2c5 v3a构建体；或dar bcma-2c5 v3b构建体。每个数据集从左到右示出了u266细胞(bcma阳性细胞)、k562细胞(bcma阴性细胞)、仅介质或rpmi 8226细胞(bcma阳性细胞)。实施例7中描述了细胞因子释放研究。
24.图8a示出了比较阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养流式细胞术研究。
25.图8b示出了比较表达car bcma bb2121构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养流式细胞术研究。
26.图8c示出了比较表达car bcma-2c5构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养流式细胞术研究。
27.图8d示出了比较表达dar bcma-2c5 v2c构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养流式细胞术研究。
28.图9是示出在使用来自图8a-d的数据扩增转基因t细胞中变化倍数的条形图，其中转基因t细胞表达：car bb2121构建体；car bcma-2c5构建体；或dar bcma-2c5 v2c构建体。将t细胞与k562、rpmi8226或u266细胞系共培养。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了变化倍数扩增研究。
29.图10a示出了比较阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果(与图8a中所呈现的数据相同)。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
30.图10b示出了比较表达car bcma bb2121构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果(与图10b中所呈现的数据相同)。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
31.图10c示出了比较表达dar bcma-2c5 v2a构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
32.图10d示出了比较表达dar bcma-2c5 v2c构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
33.图10e示出了比较表达dar bcma-2c5 v3a构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
34.图10f示出了比较表达dar bcma-2c5 v3b构建体的转基因t细胞(供体1)在与k562、rpmi8226、u266或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
35.图11是示出在使用来自图10a-e的数据扩增转基因t细胞中变化倍数的条形图，其中转基因t细胞表达：car bb2121构建体；dar bcma-2c5 v2c构建体；dar bcma-2c5 v3a构建体；或dar bcma-2c5 v3b构建体。将t细胞与k562、rpmi8226或u266细胞系共培养。在共培养3天时收集数据。实施例8中描述了扩增研究变化倍数。
36.图12是示出表达bcma car或bcma dar的t细胞(供体1)对rpmi 8226靶细胞的细胞毒性百分比的图表。线a指示阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)；线b指示dar bcma-2c5 v2c构建体；线c(虚线)指示car bb2121构建体；线d指示dar bcma-2c5 v3a构建体；线e指示dar bcma-2c5 v2b构建体；并且线f指示car bcma-2c5构建体。实施例6中描述了细胞毒性研究。
37.图13a示出了(在第13天)图5a中示出的相同的bcma-2c5二聚体抗原受体(dar)构建体的流式细胞术研究的结果，其比较了表达三个不同版本的bcma-2c5二聚体抗原受体(dar)构建体的t细胞(供体1)。阴性对照是来自图5a的trac-阴性t细胞系。示出了表达以下不同dar构建体的转基因细胞的比较：dar v2c构建体；dar v3a构建体；以及dar v3b构建体。在转染后13天收集数据。实施例5中描述了转染效率和表达水平流式细胞术研究。
38.图13b示出了用于使用图13a中描述的相同细胞检测抗bcma car t细胞和dar t细胞群体中中枢记忆t细胞分数的流式细胞术研究的结果。实施例9中描述了中枢记忆t细胞研究。
39.图13c示出了使用图13a中描述的相同细胞用于检测来自抗bcma car t细胞和dar t细胞的t细胞耗竭标志物pd1和tim3的流式细胞术研究的结果。实施例10中描述了t细胞耗竭研究。
40.图14示出了比较表达bcma嵌合抗原受体(car)构建体或两个不同版本的bcma二聚体抗原受体(dar)构建体的转基因t细胞(供体2)的流式细胞术研究的结果。在转染后11天和扩增15天后收集数据。阴性对照是非转基因活化的t细胞(atc)。另一个阴性对照是trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)。比较包括表达以下的转基因t细胞：car bcma-2c5构建体；dar bcma-2c5 v2a构建体；或dar bcma-2c5 v3a构建体。实施例5中描述了转染效率和表达水平流式细胞术研究。
41.图15是示出表达bcma-2c5 car或bcma-2c5 dar构建体的转基因t细胞(供体2)对rpmi 8226靶细胞的细胞毒性百分比的图表。线a指示阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)；线b指示表达car bcma-2c5构建体的t细胞；线c指示表达dar bcma-2c5 v3a构建体的t细胞；并且线d指示表达dar bcma-2c5 v2a构建体的t细胞。实施例6中描述了细胞毒性研究。
42.图16a示出了比较阴性对照trac-阴性t细胞系(t细胞受体α恒定区-阴性)在与k562、rpmi8226、raji或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养6
天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
43.图16b示出了比较非转基因活化的t细胞(atc)(供体2)在与k562、rpmi8226、raji或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养6天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
44.图16c示出了比较表达car bcma-2c5构建体的转基因t细胞(供体2)在与k562、rpmi8226、raji或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养6天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
45.图16d示出了比较表达dar bcma-2c5 v2a构建体(bbz)的转基因t细胞(供体2)在与k562、rpmi8226、raji或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养6天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
46.图16e示出了比较表达dar bcma-2c5 v3a构建体的转基因t细胞(供体2)在与k562、rpmi8226、raji或仅介质共培养时的扩增能力的流式细胞术研究的结果。在共培养6天时收集数据。实施例8中描述了共培养研究。
47.图17是示出表达具有来自bcma-2c5的抗原结合区的car构建体或不同的dar构建体的转基因t细胞(供体2)的扩增的变化倍数的条形图。比较包括表达以下的t细胞：car bcma-2c5构建体；dar bcma-2c5 v2a构建体；以及dar bcma-2c5 v3a构建体。在共培养6天时收集数据。实施例8中描述了扩增研究变化倍数。
48.图18a示出了异种移植小鼠模型中表达bcma dar的t细胞的杀瘤活性的生物发光成像(直到处理后第12周)。向携带生物发光肿瘤的小鼠施用pbs缓冲液、trac-阴性t细胞或表达包括dar v2c、dar v3b或dar v3a的bcma-2c5 dar构建体的转基因t细胞。实施例11中描述了异种移植小鼠研究。
49.图18b是示出从图18a中所描述的经处理的小鼠中测量的总流量(光子/秒)的图表。线a指示dar bcma-2c5 v3a；线b指示dar bcma-2c5 v3b；线c指示dar bcma-2c5 v2c；线d指示dar bcma-2c5 trac-阴性t细胞；并且线e指示经pbs处理的小鼠。参见实施例11。
50.图18c是列出从图18a中描述的小鼠获得的肿瘤生长抑制指数的表格。表格列出了直到处理后第8周获得的数据。参见实施例11。
51.图18d是示出在来自图18a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd45阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第12周获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示dar bcma-2c5 v2c；线c指示trac-阴性t细胞；线d指示dar bcma-2c5 v3b；并且线e指示dar bcma-2c5 v3a。参见实施例11。
52.图18e是示出在来自图18a中描述的小鼠的血液样品中检测到的dar阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第12周获得的数据。线a指示trac-阴性t细胞；线b指示经pbs处理的小鼠；线c指示dar bcma-2c5 v2c；线d指示dar bcma-2c5 v3b；并且线e指示dar bcma-2c5 v3a。参见实施例11。
53.图18f是示出在来自图18a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd3阴性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第12周获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示dar bcma-2c5 v2c；线c指示trac-阴性t细胞；线d指示dar bcma-2c5 v3b；并且线e指示dar bcma-2c5 v3a。参见实施例11。
54.图18g是示出了在来自图18a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd3阳性细胞的
数量的图表。图表示出了直到处理后第12周获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示dar bcma-2c5 v2c；线c指示trac-阴性t细胞；线d指示dar bcma-2c5 v3a；并且线e指示dar bcma-2c5 v3b。参见实施例11。
55.图18h是示出图18a中描述的小鼠的存活率的图表。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示trac-阴性t细胞；线c指示dar bcma-2c5 v2c；线d指示dar bcma-2c5 v3b；并且线e指示dar bcma-2c5 v3a。参见实施例11。
56.图19a示出了异种移植小鼠模型中表达bcma dar的t细胞的杀瘤活性的生物发光成像(直到处理后第12周)。向携带生物发光rpmi8226肿瘤的小鼠施用pbs缓冲液、trac-阴性t细胞或表达dar bcma-2c5 v3a构建体的转基因t细胞的三个不同剂量之一。实施例12中描述了异种移植小鼠研究。
57.图19b是示出从图19a中所描述的经处理的小鼠中测量的总流量(光子/秒)的图表。图表示出了直到处理后第76天获得的数据。线a指示施用dar bcma-2c5 v3a的6
×
106个细胞的小鼠；线b指示施用dar bcma-2c5 v3a的1.2
×
106个细胞的小鼠；线c指示施用dar bcma-2c5 v3a的2.4
×
105个细胞的小鼠；线d指示施用trac-阴性t细胞的小鼠；并且线e指示施用pbs的小鼠。参见实施例12。
58.图19c是列出从图19a中描述的小鼠获得的肿瘤生长抑制指数的表格。表格列出了直到处理后第7周获得的数据。参见实施例12。
59.图19d是示出在来自图19a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd45阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示trac-阴性t细胞；线c指示施用2.4
×
105dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线d指示施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；并且线e指示施用6
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠。参见实施例12。
60.图19e是示出在来自图19a中描述的小鼠的血液样品中检测到的dar阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示trac-阴性t细胞；线c指示施用2.4
×
105dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线d指示施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；并且线e指示施用6
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠。参见实施例12。
61.图19f是示出在来自图19a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd3阴性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示trac-阴性t细胞；线c指示施用2.4
×
105dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线d指示施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；并且线e指示施用6
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠。参见实施例12。
62.图19g是示出在来自图19a中描述的小鼠的血液样品中检测到的cd3阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示经pbs处理的小鼠；线b指示施用2.4
×
105dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线c指示施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线d指示施用trac-阴性t细胞的小鼠；并且线e指示施用6
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠。参见实施例12。
63.图19h是示出图19a中描述的小鼠的存活率的图表。线a指示施用pbs的小鼠；线b指示施用trac-阴性t细胞的小鼠；线c指示施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；线d指示
施用1.2
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠；并且线e指示施用6
×
106dar bcma-2c5 v3a的小鼠。参见实施例12。
64.图20a示出了异种移植小鼠模型中表达bcma dar的t细胞的杀瘤活性的生物发光成像，其中图19a中描述的小鼠用rpmi8226生物发光肿瘤重新激发但不施用另外的dar t细胞。生物发光数据示出了直到重新激发后7周。实施例13中描述了异种移植小鼠研究。
65.图20b是示出在来自图20a中描述的肿瘤重新激发的小鼠的血液样品中检测到的cd45阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示用rpmi肿瘤细胞重新激发的小鼠；并且线b指示用pbs重新激发的小鼠。
66.图20c是示出在来自图20a中描述的肿瘤重新激发的小鼠的血液样品中检测到的dar阳性细胞的数量的图表。图表示出了直到处理后第65天获得的数据。线a指示用rpmi肿瘤细胞重新激发的小鼠；并且线b指示用pbs重新激发的小鼠。
67.图21示出了野生型人bcma抗原、突变1人bcma抗原、突变2人bcma抗原、人april抗原和人baff抗原的氨基酸序列。
68.图22示出了抗bcma-2c5重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。
69.图23示出了抗bcma重链可变区和抗bcma-2e1、抗bc4c9和抗bc5c4的轻链可变区的氨基酸序列。
70.图24示出了抗bcma重链可变区和抗bcma-bc6g8、抗2d11和抗2g2的轻链可变区的氨基酸序列。
71.图25示出了抗bcma重链可变区和抗bcma-2d8和抗2e8的轻链可变区的氨基酸序列。
72.图26示出了抗bcma重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和抗bcma-bb2121的轻链恒定区的氨基酸序列。
73.图27示出了car gs连接子、car bb2121连接子、cd8铰链区、cd28铰链区、cd8和cd28铰链区、cd28跨膜区、cd8跨膜区、4-1bb跨膜区和cd3ζ跨膜区的氨基酸序列。
74.图28示出了4-1bb、cd28、ox40、cd3ζ(itam 1、2和3)、cd3ζitam 1、cd3ζitam 2和cd3ζitam 3的细胞内区域的氨基酸序列。
75.图29示出了car细胞内结构域28z和v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b和v4的dar细胞内结构域的氨基酸序列。
76.图30示出了v3c、v2c-alt和v3b-alt的dar细胞内结构域的氨基酸序列。
77.图31示出了重链和轻链前导序列的氨基酸序列以及包括t2a、p2a、e2a和f2a的四个不同自切割序列。
78.图32示出了car 28z bcma-2c5和bcma-bb2121的氨基酸序列。
79.图33示出了dar v1 bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
80.图34示出了dar v2a bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
81.图35示出了dar v2b bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
82.图36示出了dar v2c bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
83.图37示出了dar v3a bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
84.图38示出了dar v3b bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
85.图39示出了dar v4 bcma-2c5的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
86.图40示出了dar v2a bcma-bb2121的前体、第一多肽和第二多肽的氨基酸序列。
具体实施方式
87.定义：
88.除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，适合于本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学、转基因细胞产生、蛋白质化学和核酸化学以及杂交的术语是本领域众所周知和常用的。除非另外说明，否则通常根据本领域众所周知的常规程序以及如本文中引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的执行本文提供的方法和技术。参见例如sambrook等人《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,第2版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.)(1989)以及ausubel等人,《分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》,格林出版协会(greene publishing associates)(1992)。许多基础文本都描述了标准抗体产生过程，包括borrebaeck(编辑)《抗体工程化(antibody engineering)》,第2版,纽约弗里曼公司(freeman and company,ny),1995；mccafferty等人《抗体工程化实用方法(antibody engineering,a practical approach)》英国牛津牛津出版社(oxford press,oxford,england)irl,1996；以及paul(1995)《抗体工程化方案(antibody engineering protocols)》新泽西托托瓦哈门那出版社(humana press,totowa,n.j.),1995；paul(编辑),《基础免疫学(fundamental immunology)》,纽约瑞文出版社(raven press,n.y),1993；coligan(1991)《当代免疫学实验指南(current protocols in immunology)》纽约威利/格林(wiley/greene,ny)；harlow和lane(1989)《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,纽约冷泉港实验室出版社；stites等人(编辑)《基础和临床免疫学(basic and clinical immunology)》(第4版)加利福尼亚州洛思阿图斯朗格医学出版物(lange medical publications,los altos,calif.)以及其中引用的参考文献；《编码单克隆抗体：原理与实践(coding monoclonal antibodies:principles and practice)》(第2版)纽约纽约学术出版社(academic press,new york,n.y.),1986以及kohler和milstein《自然(nature)》256:495-497,1975。本文中所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。酶促反应和丰富/纯化技术也是众所周知的，并且如本领域通常实现的或如本文所描述的根据制造商的说明书执行。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的术语和实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者的治疗。
89.本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过参考本说明书整体来理解。
90.除非本文中上下文另外要求，否则单数术语应包括复数含义，并且复数术语应包括单数含义。除非明确地并且肯定地限于一个指示物，否则单数形式“一个/一种(a或an)”和“所述”和任何词的单数用途包括多个指示物。
91.应理解，替代方案(例如“或”)在本文中的使用用于意指替代方案中的任一个或两个或其任何组合。
92.在本文中使用的术语“和/或”将被视为意指在有或没有另一者的情况下明确公开了指定特征或组分中的每个特征或组分。例如，本文中在如“a和/或b”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)以及“b”(单独)。同样，在如“a、b和/或c”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
93.如本文所使用的，术语“包含”“包括”“具有”和“含有”以及其语法变体旨在是非限制的，使得列表中的一个项或多个项不排除可以被替代或添加到所列项的其它项。应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述方面时，还提供了关于“由
……
组成”和/或“主要由
……
组成”描述的其它类似方面。
94.如本文所使用的，术语“约”是指如由本领域普通技术人员所确定的在具体值或组合物的可接受的误差范围内的值或组合物，这将部分地取决于如何测量或确定值或组合物，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“大约”可以意指在一个或大于一个标准偏差内。可替代地，根据测量系统的限制，“约”或“大约”可以意指高达10％(即，
±
10％)或更多的范围。例如，约5mg可以包括在4.5mg与5.5mg之间的任何数字。另外地，特别地参考生物系统或过程，此术语可以意指高达数量级或高达值的5倍。当在本公开中提供了具体值或组合物时，除非另外陈述，否则“约”或“大约”的含义应被假定在所述具体值或组合物的可接受误差范围之内。
95.术语“肽”、“多肽”、“多肽链”和“蛋白质”以及本文中使用的其它相关术语可互换使用并且指代氨基酸的聚合物，并且不限于任何特定长度。多肽可以包含天然和非天然氨基酸。多肽包括重组或化学合成形式。多肽还包括前体多肽和成熟分子。前体多肽包括尚未经受切割的多肽，例如通过分泌信号肽进行的切割或通过某些氨基酸残基处的非酶促切割。多肽包括已经经受切割的成熟分子。这些术语涵盖蛋白质序列的天然蛋白、重组蛋白和人工蛋白、蛋白质片段和多肽类似物(如突变蛋白、变体、嵌合蛋白和融合蛋白)以及翻译后或以其它方式共价或非共价修饰的蛋白质。两个或更多个多肽(例如，2-6个或更多个多肽链)可以通过共价和/或非共价缔合彼此缔合以形成多肽复合物。多肽链的缔合还可以包括肽折叠。因此，多肽复合物可以是二聚体、三聚体、四聚体或高阶复合物，这取决于形成复合物的多肽链的数量。在本文中描述了包含两个多肽链的二聚体抗原受体(dar)。
96.术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及本文中使用的其它相关术语可互换使用并且指代核苷酸的聚合物，并且不限于任何特定长度。核酸包括重组和化学合成形式。核酸包括dna分子(cdna或基因组dna)、rna分子(例如，mrna)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的dna或rna的类似物以及其混合物。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施方式中，本公开的核酸分子包含编码二聚体抗原受体(dar)构建体、或其片段或scfv、衍生物、突变蛋白或其变体的连续开放阅读框。在一个实施方式中，核酸包含一种类型的多核苷酸或者两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。在本文中描述了编码二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的核酸。关于涉及第一核酸(例如，编码第一多肽)和第二核酸(例如，编码第二多肽)的实施方式，第一核酸和第二核酸可以作为分开的分子提供或在相同的连续分子内提供(例如，质粒或含有第一编码序列和第二编码序列的其它构建体)。
97.术语“回收(recover、recovery或recovering)”以及其它相关术语是指从宿主细
胞培养基或从宿主细胞裂解物或从宿主细胞膜中获得蛋白质(例如，dar或前体或其抗原结合部分)。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为融合到介导来自宿主细胞(例如，来自哺乳动物宿主细胞)的表达蛋白分泌的分泌信号肽(前导肽序列)序列的重组蛋白。所分泌的蛋白可以从宿主细胞介质中回收。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为缺乏可以从宿主细胞裂解物中回收的分泌信号肽序列的重组蛋白。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为可以使用去污剂从宿主细胞膜中回收以释放所表达的蛋白的膜结合蛋白。在一个实施方式中，不考虑用于回收蛋白质的方法，蛋白质可以经受从所回收的蛋白质中去除细胞碎片的程序。例如，所回收的蛋白质可以经受色谱法、凝胶电泳和/或透析。在一个实施方式中，所述色谱法包含任何一个程序或两个或更多个程序的任何组合，包括亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和/或二氧化硅色谱法。在一个实施方式中，亲和色谱包含蛋白质a或g(来自金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁组分)。
98.术语“分离的”是指基本上不含其它细胞材料的蛋白质(例如，dar或前体或其抗原结合部分)或多核苷酸。使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术，通过分离可以使蛋白质基本上不含天然相关的组分(或与用于产生dar的细胞表达系统或化学合成方法相关的组分)。在一些实施方式中，术语分离的还指代基本上不含相同物种的其它分子的蛋白质或多核苷酸，例如分别具有不同氨基酸或核苷酸序列的其它蛋白质或多核苷酸。所需分子的纯度或同质性可以使用本领域众所周知的技术测定，包括如凝胶电泳等低分辨率方法和如hplc或质谱分析等高分辨率方法。在一个实施方式中，本公开的二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的分离的前体多肽以及第一多肽链和第二多肽链是分离的。
99.包括本文中所描述的二聚体抗原受体(dar)的抗体可以从如含有具有各种抗原特异性的免疫球蛋白的血清或血浆等来源中获得。如果此类抗体经受亲和纯化，那么它们可以针对特定抗原特异性而被富集。此类富集抗体制剂通常由少于约10％的对于特定抗原具有特异性结合活性的抗体构成。使这些制剂经受若干轮亲和纯化可以增加对于抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以此方式制备的抗体通常被称为“单特异性的”。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的对于具体抗原具有特异性结合活性的抗体构成。可以使用如下所述的重组核酸技术产生抗体。
100.术语“前导序列”或“前导肽”或“肽信号序列”或“信号肽”或“分泌信号肽”是指位于多肽的n末端处的肽序列。前导序列将多肽链引导到细胞分泌通路，并且可以引导多肽整合和锚定到细胞膜的脂质双层中。典型地，前导序列的长度为约10-50个氨基酸。前导序列可以引导前体多肽从细胞溶质运输到内质网。在一个实施方式中，前导序列包括包含cd8α、cd28或cd16前导序列的信号序列。在一个实施方式中，信号序列包括哺乳动物序列，包括例如小鼠或人igγ分泌信号肽。在一个实施方式中，前导序列包含小鼠igγ前导肽序列mewswvflfflsvttgvhs(seq id no:90)。
101.本文中使用的“抗原结合蛋白”以及相关术语是指包含与抗原结合的部分的蛋白质，以及任选地使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分。抗原结合蛋白的实例包括二聚体抗原受体(dar)、抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包含例如具有移植的cdr或cdr衍生
物的替代性蛋白质支架或人工支架。此类支架包括但不限于包含引入突变例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的抗体源性支架以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成支架。参见例如korndorfer等人,2003,《蛋白质：结构、功能和生物信息学(proteins:structure,function,and bioinformatics)》,第53卷,第1期:121-129；roque等人,2004,《生物技术进展(biotechnol.prog.)》20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“pam”)以及基于利用纤维蛋白连接素组分作为支架的抗体模拟物的支架。本文中描述了包含二聚体抗原受体(dar)的抗原结合蛋白。
102.抗原结合蛋白可以具有例如免疫球蛋白的结构。在一个实施方式中，“免疫球蛋白”是指由两对相同的多肽链构成的四聚体分子，每对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“j”区接合，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“d”区。通常参见《基础免疫学》第7章(paul,w.编辑,第2版纽约瑞文出版社(1989))(其出于所有目的以全文引用的方式并入)。重链和/或轻链可以或可以不包括用于分泌的前导序列。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个抗原结合位点。在一个实施方式中，抗原结合蛋白可以是具有不同于四聚体免疫球蛋白但仍结合靶抗原或结合两个或更多个靶抗原的结构的合成分子。例如，合成抗原结合蛋白可以包含抗体片段、1-6个或更多个多肽链、多肽的非对称组合件或其它合成分子。本文中描述了具有免疫球蛋白样特性的与靶抗原(例如，bcma抗原)特异性结合的二聚体抗原受体(dar)结构的抗原结合蛋白。
103.免疫球蛋白链的可变区展示出由三个高变区接合的相对保守的构架区(fr)(也称为互补性决定区或cdr)的相同一般结构。从n端到c端，轻链和重链两者都包含区段fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。
104.一个或多个cdr可以共价或非共价并入到分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入cdr作为更大多肽链的部分，可以共价地将cdr连接到另一条多肽链，或者可以非共价并入cdr。cdr使抗原结合蛋白与所关注的特定抗原特异性结合。
105.将氨基酸分配给每个结构域将根据以下定义进行：kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》,第5版,美国卫生和人类服务部(us dept.of health and human services),公共卫生署(phs),美国国立卫生研究院(nih),nih公开第91-3242,1991(“kabat编号”)。免疫球蛋白链中氨基酸的其它编号系统包括：imgt.rtm.(国际免疫遗传学信息系统(international immunogenetics information system)；lefranc等人,《发展竞争免疫学(dev.comp.immunol.)》29:185-203；2005)以及aho(honegger和pluckthun,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》309(3):657-670；2001)；chothia(al-lazikani等人,1997《分子生物学杂志》273:927-948)；contact(maccallum等人,1996《分子生物学杂志》262:732-745以及aho(honegger和pluckthun 2001《分子生物学杂志》309:657-670)。
106.本文中使用的“抗体(antibody/antibodies)”以及相关术语是指与抗原特异性结合的完整免疫球蛋白或其抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组dna技术或通过完整
抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括fab、fab'、f(ab')2、fv、结构域抗体(dab)和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及含有足以赋予与多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。
107.抗体包括重组产生的抗体和抗原结合部分。抗体包括非人、嵌合、人源化和全人抗体。抗体包括单特异、多特异性(例如，双特异性、三特异性以及高阶特异性)。抗体包括四聚体抗体、轻链单体、重链单体、轻链二聚体、重链二聚体。抗体包括f(ab')2片段、fab'片段和fab片段。抗体包括单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、单链可变片段(scfv)、驼峰化(camelized)抗体、亲和体、二硫键连接的fv(sdfv)、抗独特型抗体(抗id)、微型抗体。抗体包括单克隆和多克隆群体。本文中描述了包含二聚体抗原受体(dar)的抗体样分子。
[0108]“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”以及本文中使用的其它相关术语是指含有与抗原相互作用并且有利于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于与其抗原特异性结合的抗体，所述术语将包括其cdr结构域中的至少一个结构域的至少部分。本文中描述了具有形成抗原结合结构域的抗体重链可变区和抗体轻链可变区的二聚体抗原受体(dar)。
[0109]
如本文中在抗体或抗原结合蛋白或抗体片段的上下文中使用的术语“特异性结合(specific binding、specifically binds或specifically binding)”以及其它相关术语是指相对于其它分子或部分与抗原非共价或共价优选地结合(例如，抗体相对于其它可用抗原与特定抗原特异性结合)。在一个实施方式中，如果抗体以10-5
m或更少、或10-6
m或更少、或10-7
m或更少、或10-8
m或更少、或10-9
m或更少、或10-10
m或更少、或10-11
m或更小的解离常数kd与抗原结合，那么所述抗体与靶抗原特异性结合。在一个实施方式中，本文中描述了与其靶抗原(例如，bcma抗原)特异性结合的二聚体抗原受体(dar)。
[0110]
在一个实施方式中，抗体或抗原结合蛋白或抗体片段的结合特异性可以通过elisa、放射免疫测定(ria)、电化学发光测定(ecl)、免疫放射测定(irma)或酶免疫测定(eia)测量。
[0111]
在一个实施方式中，解离常数(kd)可以使用biacore表面等离子体共振(spr)测定来测量。表面等离子体共振是指允许通过例如使用biacore系统(新泽西皮斯卡塔韦通用医疗集团biacore生命科学事业部(biacore life sciences division of ge healthcare,piscataway,nj)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。
[0112]
如本文中所使用的“表位”以及相关术语是指通过抗原结合蛋白(例如，通过抗体或其抗原结合部分)结合的抗原的一部分。表位可以包含通过抗原结合蛋白结合的两个或更多个抗原的一部分。表位可以包含一个抗原或两个或更多个抗原的非连续部分(例如，在抗原的初级序列中不连续但在抗原的三级和四级结构的结构中彼此足够接近以通过抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。通常，抗体的可变区，具体地是cdr与表位相互作用。在一个实施方式中，本文中描述了结合bcma抗原的表位的二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分。
[0113]
本文中使用的“抗体片段”、“抗体部分”、“抗体的抗原结合片段”或“抗体的抗原结合部分”以及其它相关术语是指除了完整抗体之外包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；fd；以
及fv片段和dab；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；含有足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少一部分的多肽。抗体的抗原结合部分可以通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括fab、fab'、f(ab')2、fv、结构域抗体(dab)和互补决定区(cdr)片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及含有足以赋予抗体片段抗原结合特性的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。在一个实施方式中，本文中描述了包含与铰链、跨膜区和细胞内区接合的fab片段的二聚体抗原受体。
[0114]
术语“fab”、“fab片段”以及其它相关术语是指包含可变轻链区(v
l
)、恒定轻链区(c
l
)、可变重链区(vh)和第一恒定区(c
h1
)的单价片段。fab能够结合抗原。f(ab')2片段是包含在铰链区由二硫桥键连接的两个fab片段的二价片段。f(ab')2具有抗原结合能力。fd片段包含vh和c
h1
区。fv片段包含v
l
和vh区。fv可以结合抗原。dab片段具有vh结构域、v
l
结构域或vh或vl结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634和6,696,245；美国公开申请第2002/02512号、第2004/0202995号、第2004/0038291号、第2004/0009507号、第2003/0039958号；以及ward等人,《自然》341:544-546,1989)。在一个实施方式中，本文中描述了包含与铰链、跨膜区和细胞内区接合的fab片段的二聚体抗原受体。
[0115]
单链抗体(scfv)是v
l
和vh区通过连接子(例如，氨基酸残基的合成序列)接合以形成连续蛋白质链的抗体。在一个实施方式中，连接子足够长以允许蛋白质链自身折叠并且形成单价抗原结合位点(参见例如bird等人,1988,《科学(science)》242:423-26以及huston等人,1988,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》85:5879-83)。
[0116]
双功能抗体是包含两个多肽链的二价抗体，其中每个多肽链包含由太短以致于不能在同一链上的两个结构域之间配对的连接子连接的vh和v
l
结构域，因此使得每个结构域与另一个多肽链上的互补结构域配对(参见例如holliger等人,1993《美国国家科学院院刊》90:6444-48以及poljak等人,1994,《结构(structure)》2:1121-23)。如果双功能抗体的两个多肽链相同，那么因其配对产生的双功能抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双功能抗体。类似地，三功能抗体和四功能抗体是分别包含三个和四个多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗体可以相同或不同。双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体构建体可以使用来自本文中描述的任何二聚体抗原受体(dar)的抗原结合部分制备。
[0117]
术语“人抗体”是指具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，所有可变结构域和恒定结构域源自人免疫球蛋白序列(例如，全人抗体)。这些抗体可以通过各种方式制备，所述方式的实例如下描述，包括通过重组方法或通过用小鼠的所关注抗原进行免疫，所述抗原被基因修饰以表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。本文中描述了包含全人抗体重链可变区和全人抗体轻链可变区的二聚体抗原受体(dar)。
[0118]“人源化抗体”是指具有通过一种或多种氨基酸取代、缺失和/或添加而与源自非人物种的抗体的序列不同的序列的抗体，使得与非人物种抗体相比，在将人源化抗体施用于人类受试者时，所述人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。在一个实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸发生突变以产生人源化抗体。在另一个实施方式中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域与非人物种的一个或多个可变结构域融合。在另一个实施方式中，非人抗体的一个
或多个cdr序列中的一个或多个氨基酸残基被改成降低在将非人抗体施用于人类受试者时所述非人类抗体的可能的免疫原性，其中经改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或者对氨基酸序列作出的改变是保守性改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中找到。
[0119]
本文中使用的术语“嵌合抗体”以及相关术语是指含有来自第一抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施方式中，一个或多个cdr源自人抗体。在另一个实施方式中，所有cdr源自人抗体。在另一个实施方式中，来自多于一个人抗体的cdr在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人抗体的轻链的cdr1、来自第二人抗体的轻链的cdr2和cdr3以及来自第三抗体的重链的cdr。在另一个实例中，cdr源自不同物种，如人和小鼠、或人和兔、或人和山羊。本领域的技术人员应理解，其它组合是可能的。
[0120]
此外，框架区可以源自相同抗体之一、源自如人抗体等一个或多个不同抗体或源自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体，而所述链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体。还包括展示出所需的生物活性(即，特异性结合靶抗原的能力)的此类抗体的片段。本文中描述了可以由任何二聚体抗原受体(dar)抗原结合部分的部分制备的嵌合抗体。
[0121]
如本文中所使用的，术语“变体”多肽和多肽的“变体”是指包含具有相对于参考多肽序列插入、缺失和/或取代到氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。多肽变体包括融合蛋白。以相同方式，变体多核苷酸包含具有相对于另一多核苷酸序列插入、缺失和/或取代到核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的核苷酸序列。多核苷酸变体包括融合多核苷酸。
[0122]
如本文中所使用的，术语多肽的“衍生物”是已经例如通过与如聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白)等另一个化学部分缀合、磷酸化和糖基化而被化学修饰的多肽(例如，抗体)。除非另有指示，否则术语“抗体”包括除了包含全长重链和全长轻链的抗体以外的其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实例如下描述。
[0123]
术语“铰链”是指通常在蛋白质的两个结构域之间发现并且可以允许结构域中的一个或两个结构域相对于彼此整体构建和移动的灵活性的氨基酸区段。在结构上，铰链区包含约10个到约100个氨基酸，例如约15个到约75个氨基酸、约20个到约50个氨基酸或约30个到约60个氨基酸。在一个实施方式中，铰链区的长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。铰链区可以源自天然存在的蛋白质的铰链区(如cd8铰链区或其片段、cd8α铰链区或其片段)、抗体(例如，igg、iga、igm、ige或igd抗体)的铰链区或接合抗体的恒定结构域ch1和ch2的铰链区。铰链区可以源自抗体并且可以或可以不包含抗体的一个或多个恒定区，或者铰链区包含抗体的铰链区和抗体的ch3恒定区，或者铰链区包含抗体的铰链区和抗体的ch2和ch3恒定区，或者铰链区是非天然存在的肽，或者铰链区位于scfv的c末端与跨膜结构域的n末端之间。在一个实施方式中，铰链区包含含有来自igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋
白分子的上部铰链序列、核心铰链序列或下部铰链序列中的任何一个区或两个或更多个区的任何组合。在一个实施方式中，铰链区包含igg1上部铰链序列epkscdktht(seq id no:91)。在一个实施方式中，铰链区包含igg1核心铰链序列cpxc，其中x是p、r或s(seq id no:92)。在一个实施方式中，铰链区包含下部铰链/ch2序列papellggp(seq id no:93)。在一个实施方式中，铰链与具有氨基酸序列svflfppkpkdt(seq id no:94)的fc区(ch2)接合。在一个实施方式中，铰链区包括上部铰链、核心铰链或下部铰链的氨基酸序列并且包含epkscdkthtcppcpap ellggp(seq id no:95)。在一个实施方式中，铰链区包含可以形成至少一个、两个、三个或更多个链间二硫键的一个、两个、三个或更多个半胱氨酸。
[0124]
如本文所使用的术语“fc”或“fc区”是指在铰链区中开始或在铰链区之后开始并且在重链的c末端结束的抗体重链恒定区的部分。fc区包含ch2和ch3区的至少一部分，并且可以或可以不包括铰链区的一部分。fc区可以结合fc细胞表面受体以及免疫补体系统的一些蛋白质。fc区展示出效应子功能，包括包含补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性吞噬作用(adp)、调理作用和/或细胞结合中的任何一种活性或两种或更多种活性的任何组合。在一个实施方式中，fc区可以包括增加或减少这些功能中的任何一个功能或任何组合的突变。fc区可以结合包括fcγri(例如，cd64)、fcγrii(例如，cd32)和/或fcγriii(例如，cd16a)的fc受体。fc区可以结合补体组分c1q。在一个实施方式中，fc结构域包含减少效应子功能的lala-pg突变(例如，相当于l234a、l235a、p329g)。在一个实施方式中，fc结构域介导蛋白质复合物的血清半衰期，并且fc结构域中的突变可以增加或减少蛋白质复合物的血清半衰期。在一个实施方式中，fc结构域影响蛋白质复合物的热稳定性，并且fc结构域中的突变可以增加或减少蛋白质复合物的热稳定性。
[0125]
如本文所使用的关于多肽的术语“标记的”或相关术语是指其与用于检测的可检测标记或部分的接合。示例性可检测标记或部分包括放射性的、色度的、抗原的、酶促的标记/部分、可检测的珠粒(如磁性或电子致密(例如，金)珠粒)、生物素、链霉亲和素或蛋白质a。可以使用各种标记，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、辅酶因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。本文中所描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分可以是未标记的或者可以与可检测标记或可检测部分接合。
[0126]
本文中使用的“同一性百分比”或“同源性百分比”以及相关术语是指两个多肽之间或两个多核苷酸序列之间相似性的定量测量。两个多肽序列之间的同一性百分比是在两个多肽序列之间共享的比对位置处的相同氨基酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化两个多肽序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。以类似方式，两个多核苷酸序列之间的同一性百分比是在两个多核苷酸序列之间共享的比对位置处的相同核苷酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化两个多核苷酸序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。序列比较和两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现。例如，两个多肽或两个多核苷酸序列的“同一性百分比”或“同源性百分比”可以通过使用gap计算机程序(gcg wisconsin package，10.3版本(加利福尼亚州圣地亚哥accelrys公司(accelrys,san diego,calif.))使用其默认参数比较序列来确定。关于测试序列的如“包含与y具有至少x％同一性的序列”的表达意指当如上描述与序列y比对时，测试序列包含与y的残基至少x％相同的残基。
[0127]
在一个实施方式中，测试构建体(例如，dar)的氨基酸序列可以与构成本文中所描
述的给定二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的多肽的任何氨基酸序列类似但不一定相同。测试构建体与多肽之间的相似性可以为与构成本文中所描述的二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的任何多肽至少95％、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同。在一个实施方式中，相似多肽可以含有重链和/或轻链内的氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸取代包含一个或多个保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度，以校正取代的保守性质。用于作出此调节的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如pearson(1994)《分子生物学方法(methods mol.biol.)》24:307-331，所述文献以全文引用的方式并入本文中。具有类似化学特性的侧链的氨基酸基团的实例包含：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
[0128]
术语“嵌合抗原受体”或“car”是指包含融合到细胞内信号传导结构域的细胞外抗原结合蛋白的单链融合蛋白。car细胞外结合结构域是通过融合如人单克隆抗体等单克隆抗体的可变重区和轻区而得到的单链可变片段(scfv或sfv)。在一个实施方式中，car包含：(i)包含重链可变(vh)结构域和轻链可变(vl)结构域的抗原结合蛋白，其中vh和vl结构域通过肽连接子接合在一起；(ii)铰链结构域；(iii)跨膜结构域；以及(iv)包含细胞内信号传导序列的细胞内结构域。所公开的构建体是与car不同的dar，由于dar不使用单链抗体靶向而是使用分开的重链可变结构域区和轻链可变结构域区。
[0129]
本文中使用的术语“载体”以及相关术语是指可以可操作地与外部遗传物质(例如，核酸转基因)连接的核酸分子(例如，dna或rna)。载体可以用作媒剂以将外部遗传物质引入到细胞(例如，宿主细胞)中。载体可以包括至少一个限制性核酸内切酶识别序列以将转基因插入到载体中。载体可以包括至少一个基因序列，其赋予抗生素耐药性或可选择的特性以帮助选择携带载体-转基因构建体的宿主细胞。载体可以是单链或双链的核酸分子。载体可以是线性或环形核酸分子。用于使用锌指核酸酶、talen或crispr/cas的基因编辑方法的供体核酸可以是一种载体。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指线性或环形双链染色体外dna分子，所述分子可以与转基因连接并且能够在宿主细胞中复制并且转录和/或翻译所述转基因。病毒载体通常含有可以与转基因连接的病毒rna或dna主链序列。病毒主链序列可以被修饰以停止传染但保留病毒主链和共连接转基因插入到宿主细胞基因组中。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、杆状病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体和爱泼斯坦
·
巴尔病毒(epstein barr viral)载体。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到所述宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。
[0130]“表达载体”是一种可以含有如诱导型和/或组成型启动子和增强子等一个或多个
调控序列的载体。表达载体可以包括核糖体结合位点和/或聚腺苷酸化位点。表达载体可以包括一个或多个复制起点序列。调控序列引导与转化到宿主细胞中的表达载体连接的转基因的转录或转录和翻译。调控序列可以控制转基因的表达水平、定时和/或位置。调控序列可以例如直接或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用向转基因施加其效应。调控序列可以是载体的一部分。例如goeddel,1990,《基因表达技术：酶学方法(gene expression technology:methods in enzymology)》185,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社以及baron等人,1995,《核酸研究(nucleic acids res.)》23:3605-3606中描述了调控序列的另外的实例。表达载体可以包含编码本文中所描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的至少一部分的核酸。
[0131]
当在转基因与载体之间存在连接以允许载体内包含的转基因序列起作用或表达时，转基因“可操作地连接”到载体中。在一个实施方式中，当调控序列影响转基因的表达(例如，表达水平、定时和/或位置)时，转基因“可操作地连接”到调控序列。
[0132]
本文所使用的术语“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”或其它相关术语是指将外源核酸(例如，转基因)转移或引入到宿主细胞中的过程。“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”宿主细胞是已经用外源核酸(转基因)引入的细胞。宿主细胞包括原代受试者细胞和其后代。编码本文中所描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的至少一部分的外源核酸可以被引入到宿主细胞中。包含本文中所描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的至少一部分的表达载体可以被引入到宿主细胞中，并且宿主细胞可以表达包含本文中所描述的二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的至少一部分的多肽。
[0133]
如本文所使用的术语“宿主细胞”或“或宿主细胞群体”或相关术语是指其中已经引入外部(外源或转基因)核酸的细胞(或其群体)。外部核酸可以包括可操作地连接到转基因的表达载体，并且宿主细胞可以用于表达由外部核酸(转基因)编码的核酸和/或多肽。宿主细胞(或其群体)可以是经培养的细胞或者可以从受试者中提取。在不考虑通路的数量的情况下，宿主细胞(或其群体)包括原代受试者细胞和其后代。宿主细胞(或其群体)包括永生化细胞系。与亲本细胞相比，后代细胞可以或可以不携带相同遗传物质。宿主细胞涵盖后代细胞。在一个实施方式中，宿主细胞描述了已经以任何方式被修饰、转染、转导、转化和/或操纵以表达如本文所公开的抗体的任何细胞(包括其后代)。在一个实例中，宿主细胞(或其群体)可以用本文中描述的可操作地连接到编码所需抗体或其抗原结合部分的核酸的表达载体引入。宿主细胞以及其群体可以携带稳定地整合到宿主的基因组中的表达载体，或者可以携带染色体外表达载体。在一个实施方式中，宿主细胞以及其群体可以携带若干次细胞分裂后存在或短暂存在并且在若干次细胞分裂之后丢失的染色体外载体。
[0134]
转基因宿主细胞可以使用包括包含锌指核酸酶、talens、大范围核酸酶的非病毒方法或通过使用crispr/cas的基因编辑来制备。转基因可以使用锌指核酸酶引入到宿主细胞基因组中。锌指核酸酶包括一对嵌合蛋白，每个嵌合蛋白含有融合到来自工程化的锌指基序的dna结合结构域的限制性核酸内切酶(例如，foki)的非特异性核酸内切酶结构域。dna结合结构域可以被工程化以结合宿主基因组中的特异性序列，并且核酸内切酶结构域进行双链切割。供体dna携带转基因，例如编码本文中描述的car或dar构建体的核酸以及与宿主细胞基因组中预期插入位点的任一侧上的区同源的侧翼序列中的任何一个。宿主细胞
的dna修复机制使得能够通过同源dna修复精准插入转基因。已经使用锌指核酸酶(美国专利第9,597,357号、第9,616,090号、第9,816,074和第8,945,868号)制备转基因哺乳动物宿主细胞。可以使用talen(转录激活剂样效应子核酸酶)制备转基因宿主细胞，所述talen类似于锌指核酸酶，因为这两种方法包括融合到可以精准递送转基因插入的dna结合结构域的非特异性核酸内切酶结构域。类似于锌指核酸酶，talen也将双链切割引入到宿主dna中。转基因宿主细胞可以使用大范围核酸酶制备，所述大范围核酸酶用作识别长度为约12-40个碱基对的双链dna上的识别位点的位点特异性、稀有切割的核酸内切酶。大范围核酸酶包括最常见于真核单细胞生物体的线粒体和叶绿体的来自laglidadg家族的那些核酸酶。例如美国专利第9,889,160号中描述了用于修饰基因组的大范围核酸酶系统的实例。转基因宿主细胞可以使用crispr(成簇的规律间隔的短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeat)来制备。crispr使用偶联到向导rna的cas核酸内切酶进行靶特异性供体dna整合。向导rna包括含有靶dna中的grna结合区上游的原型间隔相邻基序(pam)的保守多核苷酸并且与宿主细胞靶位点杂交，在所述宿主细胞靶位点中，cas核酸内切酶切割双链靶dna。向导rna可以被设计成与特异性靶位点杂交。类似于锌指核酸酶和talen，crispr/cas系统可以用于引入具有与插入位点同源的侧翼序列的供体dna的位点特异性插入。例如美国专利第8,697,359号、第10,000,772号、第9,790,490号以及美国专利申请公开第us 2018/0346927号中描述了用于修饰基因组的crispr/cas系统的实例。在一个实施方式中，转基因宿主细胞可以使用锌指核酸酶、talen或crispr/cas系统来制备，并且宿主靶位点可以是trac基因(t细胞受体α恒定区)。供体dna可以包括例如编码本文中所描述的car或dar构建体的任何核酸。电穿孔、核转染或脂质转染可以用于与锌指核酸酶、talen或crispr/cas系统将供体dna共递送到宿主细胞中。
[0135]
转基因宿主细胞可以通过用携带编码car或dar构建体的核酸的逆转录病毒载体转导宿主细胞(例如，t细胞)来制备。转导可以基本上如ma等人,2004《前列腺》61:12-25；以及ma等人,《前列腺》74(3):286-296,2014(所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中)所描述的进行。逆转录病毒载体可以使用fugene试剂(威斯康星州麦迪逊市普洛麦格公司(promega,madison,wi))转导到phoenix-eco细胞系(atcc)中以产生亲嗜性逆转录病毒，然后采集瞬时病毒上清液(亲嗜性病毒)可以用于转导具有gal-v包膜的pg13包装细胞以产生逆转录病毒，从而感染人细胞。来自pg13细胞的病毒上清液可以用于在cd3或cd3/cd28活化之后两到三天转导经活化的t细胞(或pbmc)。可以通过用100ng/ml小鼠抗人cd3抗体okt3(新泽西州拉里坦奥思生物技术公司(orth biotech,rartian,nj))或抗cd3、抗cd28 transact(德国美天旎生物技术公司(miltenyi biotech,german))作为制造商手册以及补充有5％fbs的含300-1000u/ml il2的aim-v生长培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆吉博科公司-赛默飞世尔科技公司(gibco-thermo fisher scientific,waltham,ma))活化正常健康供体外周血单个核细胞(pbmc)两天来制备经活化的人t细胞。大约5
×
106个经活化的人t细胞可以在10ug/ml纤维连接蛋白(美国宝生物工程有限公司(takara bio usa))中转导，与3ml病毒上清液预涂覆6孔板并在大约32℃下以1000g离心约1小时。转导后，可以在补充有5％fbs和300-1000u/ml il2的aim-v生长培养基中扩增经转导的t细胞。
[0136]
宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(e.coli)，或其可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、哺乳动物
细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤细胞。在一个实施方式中，宿主细胞可以用可操作地连接到编码所需抗体的核酸的表达载体引入，由此产生经转染的/经转化的宿主细胞，所述宿主细胞在适合于通过经转染的/经转化的宿主细胞表达抗体的条件下培养，并且任选地从经转染的/经转化的宿主细胞中回收抗体(例如，从宿主细胞裂解物中回收或从培养基中回收)。在一个实施方式中，宿主细胞包含包括cho、bhk、ns0、sp2/0和yb2/0的非人细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包含包括hek293、ht-1080、huh-7和per.c6的人细胞。宿主细胞的实例包括猴肾细胞(atcc crl 1651)的cos-7系(参见gluzman等人,1981,《细胞(cell)》23:175)、l细胞、c127细胞、3t3细胞(atcc ccl 163)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物，如在无血清培养基中生长的veggie cho以及相关细胞系(参见rasmussen等人,1998,《细胞技术学(cytotechnology)》28:31)或缺乏dhfr的cho菌株dx-b 11(参见urlaub等人,1980,《美国国家科学院院刊》77:4216-20)、hela细胞、bhk(atcc crl 10)细胞系、源自非洲绿猴肾细胞系cv1的cv1/ebna细胞系(atcc ccl 70)(参见mcmahan等人,1991,《欧洲分子生物学学会杂志(embo j.)》10:2821)、人胚肾细胞(如293、293ebna或msr 293)、人表皮a431细胞、人colo 205细胞、其它经转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织的体外培养物的细胞株、原代外植体、hl-60、u937、hak或jurkat细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包括如y0、ns0或sp20等淋巴样细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用多肽编码核酸转化或转染的经培养的细胞，所述核酸然后可以在宿主细胞中表达。短语“转基因宿主细胞”或“重组宿主细胞”可以用于指示已经用表达或不表达的外源核酸引入(例如，转导、转化或转染)的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含核酸但不在所需水平下表达所述核酸直到调控序列被引入到宿主细胞中，使得调控序列与核酸可操作地连接的细胞。应当理解，术语宿主细胞不仅指具体受试者细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包含在如本文中所使用的术语的范围内。本文中描述了携带可操作地连接到编码包含二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的一个或多个多肽的至少一个核酸的载体(例如，表达载体)的宿主细胞或宿主细胞群体。
[0137]
宿主细胞或宿主细胞群体包含t淋巴细胞(例如，t细胞、调控t细胞、γ-δt细胞以及细胞毒性t细胞)、nk(天然杀伤)细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、b淋巴细胞、单核细胞。在一个实施方式中，nk细胞包含脐带血源性nk细胞或胎盘源性nk细胞。
[0138]
本公开的多肽(例如，二聚体抗原受体(dar))可以使用本领域已知的任何方法产生。在一个实例中，多肽通过将编码多肽的核酸序列(例如，dna)插入到重组表达载体中而通过重组核酸方法产生，所述重组表达载体引入到宿主细胞中并且由宿主细胞在促进表达的条件下表达。
[0139]
例如sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第1-3卷,冷泉港实验室出版社,第2版,1989或f.ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》(纽约格林出版社和威利国际科学出版社(green publishing and wiley-interscience:new york),1987)以及定期更新(所述文献以全文引用的方式并入本文中)中描述了用于重组核酸操纵的通用技术。编码多肽的核酸(例如，dna)可操作地连接到携带源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的一个或多个合适的转录或翻译调控元件的表达载体。此
类调控元件包括转录启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体可以包括赋予宿主细胞中复制能力的起源或复制。表达载体可以包括赋予选择性以促进转基因宿主细胞(例如，转化株)的识别的基因。
[0140]
重组dna还可以编码可以用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签、flag标签、myc标签、ha标签或gst标签。可以在《克隆载体：实验室手册(cloning vectors:a laboratory manual)》(纽约爱思唯尔出版社(elsevier,n.y.),1985)中找到与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适合的克隆和表达载体。
[0141]
表达载体构建体可以使用适合于宿主细胞的方法引入到宿主细胞中。用于将核酸引入到宿主细胞中的各种方法是本领域已知的，包括但不限于电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其它物质转染；病毒转染；非病毒转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，其中载体是感染原)。合适的宿主细胞包括原核生物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或细菌细胞。
[0142]
合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌(bacillus spp.)酵母，例如来自酵母菌(saccharomyces species)，如酿酒酵母(s.cerevisiae)，也可以用于产生多肽。不同哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中产生外源蛋白的杆状病毒系统由luckow和summers(《生物/技术(bio/technology)》,6:47,1988)综述。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3、中国仓鼠卵巢(cho)、人胚肾细胞、hela、293、293t和bhk细胞系。经纯化的多肽通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备。然后从培养基或细胞提取物中纯化所述蛋白质。包含二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分的任何多肽链可以通过转基因宿主细胞表达。
[0143]
本文中公开的抗体和抗原结合蛋白也可以使用细胞翻译系统产生。出于此目的，编码多肽的核酸必须被修饰以允许体外转录以产生mrna并且允许对被使用的具体无细胞系统中的mrna进行无细胞翻译(真核的，如无哺乳动物细胞或酵母细胞的翻译系统；或原核的，如无细菌细胞的翻译系统)。
[0144]
编码本文中所公开的各种多肽中的任何一种的核酸可以被化学合成。可以选择密码子使用以改善细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经开发了针对大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的专门密码子使用模式。参见例如：mayfield等人,《美国国家科学院院刊》2003 100(2):438-42；sinclair等人《蛋白质表达与纯化(protein expr.purif.)》2002(1):96-105；connell n d.《生物技术新见(curr.opin.biotechnol.)》2001 12(5):446-9；makrides等人《微生物学评论(microbiol.rev.)》1996 60(3):512-38；以及sharp等人《酵母(yeast.)》1991 7(7):657-78。
[0145]
本文中描述的抗体和抗原结合蛋白还可以通过化学合成(例如，通过《固相肽合成(solid phase peptide synthesis)》,第2版,1984,伊利诺州罗克福德皮尔斯化学公司(pierce chemical co.,rockford,ill.)中描述的方法)产生。对蛋白质的修饰还可以通过化学合成来产生。
[0146]
本文中描述的抗体和抗原结合蛋白可以通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性实例包括提取、再结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布或这些的任何组合。纯化后，多肽可以交换到不同缓冲液中和/或通过本领域已知的各种方法中的任何一种方法浓缩，包括但不限于过滤和透析。
[0147]
在一个实施方式中，可以对转基因dar t细胞的配制物进行针对表达二聚体抗原受体(dar)构建体的t细胞的富集。例如，抗bcma dar t细胞可以由pbmc制备以产生含有非转基因t细胞和转基因t细胞的混合物的t细胞群体。表达抗bcma dar构建体的转基因t细胞可以使用细胞分选(例如，荧光激活的细胞分选)、梯度纯化或适于优选地诱导转基因t细胞而非转基因t细胞增殖的培养方法被富集，来减少非转基因t细胞的百分比或数量。在一个实施方式中，富集步骤增加了转基因dar t细胞相较于非转基因t细胞富集的数量约2-5倍、或约5-10倍、或约10-15倍、或约15-20倍、或约20-50倍或更高倍的水平。
[0148]
在某些实施方式中，本文中描述的抗体和抗原结合蛋白(例如，dar)可以进一步包含翻译后修饰。示例性翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、adp-核糖基化、泛素化、糖基化、去岩藻糖基化、羰基化、苏素化、生物素酰化或多肽侧链或疏水基团的添加。因此，经修饰的多肽可以含有非氨基酸要素，如脂质、多糖或单糖以及磷酸盐。在一个实施方式中，糖基化可以是将一个或多个唾液酸部分缀合到多肽的唾液酸化。唾液酸部分改善溶解度和血清半衰期，同时还减低蛋白质的可能免疫原性。参见raju等人《生物化学(biochemistry.)》2001 31；40(30):8868-76。
[0149]
本公开提供了包含本文中所描述的与药学上可接受的赋形剂混合的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分或转基因宿主细胞(例如，表达dar)的治疗组合物。赋形剂涵盖载体、稳定剂和赋形剂。药学上可接受的赋形剂的赋形剂包括例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂以及抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。另外的实例包括缓冲剂、稳定剂、防腐剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和等张化剂。当治疗组合物包含细胞时，药学上可接受的赋形剂将被选择以便不干涉细胞的活力或活性。
[0150]
治疗组合物以及制备它们的方法是本领域众所周知的，并且在例如《雷明顿：药学技术与实践(“remington:the science and practice of pharmacy”)》(第20版,a.r.gennaro a r.编辑,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版公司(lippincott williams&wilkins,philadelphia,pa.))中找到。治疗组合物可以被调配用于肠胃外施用，可能并且可以例如含有赋形剂、无菌水、生理盐水、如聚乙二醇等聚亚烷基二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制本文中描述的抗体(或其抗原结合蛋白)的释放。纳米微粒调配物(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可以用于控制抗体(或其抗原结合蛋白)的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包含乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。调配物中抗体(或其抗原结合蛋白)的浓度将根据许多因素变化，包括待施用药物的剂量和施用途径。
[0151]
本文中描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分可以作为药学上可接
受的盐，如通常用于制药业的无毒酸加成盐或金属络合物施用。酸加成盐的实例包括：有机酸，如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲基磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如单宁酸、羧甲基纤维素等；以及无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。在一个实例中，dar(或其抗原结合部分)在存在乙酸钠的情况下调配以增加热稳定性。
[0152]
如本文所使用的，术语“受试者”是指人和非人动物，包括脊椎动物、哺乳动物和非哺乳动物。在一个实施方式中，受试者可以是人、非人灵长类动物、猿、类人猿、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫科动物、山羊、狼、蛙科动物或鱼。
[0153]
术语“施用(administering或administered)”以及语法变体是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入到受试者。本文所公开的调配物的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的，短语“肠胃外施用”意指除了肠内施用和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一个实施方式中，调配物通过非肠胃途径(例如，口服)施用。其它非肠胃途径包括局部、表皮或粘膜途径施用，例如，鼻内、阴道、直肠、舌下或局部施用。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内进行施用。本文中描述的任何二聚体抗原受体(dar)或其抗原结合部分可以使用本领域已知的方法和递送途径施用于受试者。
[0154]
术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”或相关术语可以互换使用，并且是指本文中描述的任何二聚体抗原受体(dar)在施用于受试者时足以影响与肿瘤或癌症抗原表达相关的疾病或病症的可测量的改善或预防的量。本文中提供的dar的治疗有效量当单独使用或组合使用时将根据抗体以及组合(例如，抑制细胞生长)的相对活性并且根据被治疗的受试者和疾病病状、受试者的体重和年龄以及性别、受试者的疾病病状的严重程度、施用方式等而变化，这些可以由本领域普通技术人员容易地确定。
[0155]
在一个实施方式中，治疗有效量将取决于被治疗的受试者和被治疗的病症的某些方面，并且可以由本领域技术人员使用已知技术查明。通常，dar t细胞可以以下施用于受试者：约10
3-104个细胞/kg、或约10
4-105个细胞/kg、或约10
5-106个细胞/kg、或约10
6-107个细胞/kg、或约10
7-108个细胞/kg、或约10
8-109个细胞/kg或约10
9-10
12
个细胞/kg。dar t细胞可以仅一次施用、或每天施用(例如，每天一次、两次、三次或四次施用)或更不频繁地施用(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度施用)。另外，如本领域已知的，可能需要为施用的年龄以及体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用以及疾病的严重程度调整。
[0156]
在一个实施方式中，治疗有效量包含施用于受试者的约10
3-10
12
个转基因宿主细胞的剂量。在一个实施方式中，转基因宿主细胞携带表达包含本文中描述的任何dar的多肽链的一个或多个表达载体。治疗有效量可以通过考虑接受治疗有效量的受试者和待治疗的疾病/病症来确定，其可以由本领域技术人员使用已知技术查明。治疗有效量可以考虑关于受试者的因素，如年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用以及疾病的严重程度。治疗有效量可以考虑转基因宿主细胞的纯度，所述纯度可以为约65％-98％或
更高水平的纯度。转基因宿主细胞的治疗有效量可以在一定时间段内至少一次或两次、三次、4次、5次或更多次施用于受试者。时间段可以是每天、每周、每月或每年。施用于受试者的转基因细胞的治疗有效量可以每次相同或者可以在每个施用事件时增加或减少。转基因细胞的治疗有效量可以施用于受试者，直到肿瘤大小或癌细胞的数量与施用转基因宿主细胞之前的肿瘤大小或癌细胞数量相比降低5％-90％或更多。
[0157]
本公开提供了用于治疗患有与一个或多个肿瘤相关抗原的表达或过表达相关的疾病/病症的受试者的方法。疾病包含表达肿瘤相关抗原(例如，bcma抗原)的癌症或肿瘤细胞。在一个实施方式中，癌症或肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤、脑癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、食管癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、喉下部癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。
[0158]
在一个实施方式中，癌症包含血液癌症，包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和b细胞淋巴瘤。血液癌症包括多发性骨髓瘤(mm)、包括伯基特淋巴瘤(burkitt's lymphoma，bl)的非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma，nhl)、b慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、全身性红斑狼疮(sle)、b和t急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(cml)、毛细胞白血病(hcl)、滤泡性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、套细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、浆细胞骨髓瘤、前体b细胞淋巴细胞白血病/淋巴瘤、浆细胞瘤、巨细胞性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链或本斯-琼斯骨髓瘤(bence-jones myeloma)、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴组织增殖性病症、免疫调节病症、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(chagas'disease)、格雷夫氏病(grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、干燥综合征(sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、anca相关血管炎、古德帕斯丘氏病(goodpasture's disease)、川崎病(kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血、以及急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性以及显著性未确定的单克隆丙种球蛋白病。
[0159]
二聚体抗原受体(dar)
[0160]
本公开提供了包含与跨膜区和细胞内区接合的fab片段的二聚体抗原受体(dar)。在一个实施方式中，dar构建体包括fab片段与跨膜区之间的任选的铰链区。在一些实施方式中，当前公开的dar结构提供了未预期的且令人惊讶的结果，例如基于比较具有fab格式抗体的dar结构与具有同一抗体的scfv格式的car结构。此外，dar和car格式可以直接进行比较，因为铰链区、跨膜区和两个细胞内区可以是相同的。然而，dar格式相对于对应的car格式，在与表达靶抗原、抗原诱导的细胞因子释放和/或抗原诱导的细胞毒性的细胞结合(例如，特异性结合)方面可以提供更优的结果。
[0161]
本公开提供了二聚体抗原受体(dar)构建体，所述dar构建体包含一条多肽链上的重链结合区以及分开的另一条多肽链上的轻链结合区。构成二聚体抗原受体的两条多肽链可以二聚化以形成相较于scfv更接近地模拟fab结构的蛋白质复合物。所述二聚体抗原受体具有抗体样特性，因为所述二聚体抗原受体与靶抗原特异性结合。在二聚体抗原受体
(dar)构建体中，一条多肽链上的重链可变区和恒定区可能缺乏中间连接子序列，并且分开的另一条多肽链上的轻链可变区和恒定区也可能缺乏中间连接子序列。相较于含有可变重链区与可变轻链区之间的中间连接子序列的scfv，dar多肽链上中间连接子序列的缺乏可能降低免疫原性。所述二聚体抗原受体具有抗体样特性，因为所述二聚体抗原受体与靶抗原特异性结合。所述二聚体抗原受体可以用于定向细胞疗法。
[0162]
本公开提供了转基因t细胞，所述转基因t细胞被工程化以表达具有抗原结合细胞外部分、任选的铰链部分、跨膜部分以及具有共刺激和/或细胞内信号传导区的细胞内部分的抗bcma二聚体抗原受体(dar)构建体。细胞外部分表现出结合导致t细胞活化和患病细胞杀伤同时使正常细胞免受伤害的bcma表达性患病造血细胞的高亲和力和亲合力。抗bcma dar构建体的细胞内部分包含共刺激和/或信号传导区，所述共刺激和/或信号传导区在抗原结合时介导可能导致记忆t细胞形成、增强t细胞扩增(例如，记忆t细胞扩增)和/或减少t细胞耗竭的t细胞活化。假定记忆t细胞的形成对于预防患有涉及bcma过表达的疾病的受试者的疾病复发是重要的。本文中描述的是在细胞内共刺激和信号传导区的类型和数量上不同的dar构建体的多种构型，从而提供设计dar构建体以产生强劲且快速的效应子应答(例如，包含细胞内cd28共刺激区的dar构建体)和/或产生更持久的记忆t细胞群体(例如，包含细胞内4-1bb共刺激区的dar构建体)的灵活性。
[0163]
在一个实施方式中，表达抗bcma dar的转基因t细胞群体包含cd4+和cd8+t细胞的混合物，所述t细胞是原初t细胞(tn)或在分化成记忆t细胞的不同阶段的经受抗原的t细胞(tm)。记忆t细胞群体(tm)是含有中枢记忆(t
cm
)和效应子记忆(t
em
)t细胞的子集群体的异质t细胞群体，所述t细胞在其细胞受体表达模式上有所不同，并且可以展示出不同程度的抗肿瘤效力、体外增殖能力和体内持久性。通常，人原初t细胞(tn)的细胞受体表达模式包括cd62l+、ccr7+、cd45ra+、cd45ro-和cd27+。中枢记忆t细胞(t
cm
)为cd62l+、ccr7+、cd45ra+、cd45ro+和cd27+。效应子记忆t细胞(t
em
)为cd62l-、ccr7-、cd45ra-、cd45ro-和cd27-。相反，效应子t细胞(te)为cd62l-、ccr7-、cd45ro-和cd27-。假定经受抗原的记忆t细胞从干细胞样记忆t细胞(t
scm
)分化为中枢记忆t细胞(t
cm
)、效应子记忆t细胞(t
em
)与末期分化效应子t细胞。中枢记忆t细胞(t
cm
)归类为早期分化祖细胞，可以自我更新(再生)并且可以维持长期干细胞样t细胞记忆特性。效应子记忆t细胞(t
em
)似乎比中枢记忆t细胞(t
cm
)更多分化，所述中枢记忆t细胞可以分化为细胞毒性的、产生炎性细胞因子并且几乎没有增殖能力的末期分化效应子t细胞(te)。响应于抗原刺激，cd8+中枢记忆(t
cm
)和效应子记忆(t
em
)t细胞可以分化为表达升高水平的穿孔素和颗粒酶(例如，颗粒酶a和/或b)并且短暂存活的细胞溶解效应子t细胞(te)。因此，产生含有相较于细胞溶解效应子t细胞(te)展示出抗肿瘤效力、增加的体外增殖能力和体内持久性的升高水平的中枢记忆(t
cm
)和效应子记忆(t
em
)t细胞的抗bcma dar t细胞群体是有利的。
[0164]
在一个实施方式中，本文中描述的转基因dar t细胞包含cd8+和cd4+记忆t细胞，所述记忆t细胞展现出中枢记忆t细胞(t
cm
)和效应子记忆t细胞(t
em
)的独特细胞受体表达模式，并且具有使它们适合于体内过继性转移的特性，因为所述记忆t细胞展现出抗肿瘤效力、体外增殖能力和体内持久性。
[0165]
在一个实施方式中，转基因抗bcma dar t细胞可以被施用于患有过表达bcma抗原的肿瘤或癌症的受试者以减少肿瘤负荷。在一个实施方式中，转基因dar t细胞可以以单剂
量或多剂量施用于受试者。抗bcma dar t细胞可以在受试者中(例如，体内)扩增，这可以或可以不与具有记忆t细胞特性的dar t细胞的存在相关。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞可以在单剂量后在被治疗的受试者中体内扩增。扩增可以在治疗后数天、数周或数个月检测到。抗bcma dar t细胞可以在治疗后数天、数周或数个月在受试者体内持续存在。
[0166]
在一个实施方式中，受试者中转基因抗bcma dar t细胞的功能持久性赋予长期肿瘤免疫力持续数天、数周或数个月。持久性水平可以通过在动物模型中进行肿瘤重新激发实验来评估。例如，单剂量的抗bcma dar t细胞可以施用于具有原发性肿瘤负荷的至少一个动物受试者。在减少原发性肿瘤负荷后，用继发性肿瘤细胞重新激发受试者，并且监测继发性肿瘤负荷。继发性肿瘤生长(肿瘤复发)的延迟或肿瘤消除表明单剂量的抗bcma dar t细胞在体内持续存在，并且可以表明长期体内扩增。延迟可以在数天、数周或数个月检测到。接受抗bcma dar t细胞以进行肿瘤治疗的人受试者还可以受益于长期肿瘤免疫力持续数天、数周或数个月。
[0167]
在一个实施方式中，与表达抗bcma car(嵌合抗原受体)的转基因t细胞相比，表达抗bcma dar的转基因t细胞群体展现出降低水平的t细胞耗竭。在一个实施方式中，与car t细胞群体相比，dar t细胞群体中dar t细胞降低的百分比展示出t细胞耗竭。t细胞耗竭是指由持久抗原刺激而引起的功能紊乱状态。在cd8+和cd4+dar t细胞两者中，耗竭以抑制性受体的共表达为特征，包括pd-1、ctla4、lag3、tim3、2b4/cd244/cd244/slamf4、cd160和/或tigit中的两种或更多种的任何组合。dar t细胞中的t细胞耗竭也以il-2产生丧失、增殖能力和细胞溶解活性的严重下降或丧失为特征。在cd8+t细胞中，耗竭可能导致t细胞死亡。t细胞耗竭假定为代表末期t细胞分化。据信t细胞耗竭是car t细胞疗法失败的原因。
[0168]
在一个实施方式中，展示出t细胞耗竭受体标志物(例如，pd-1、ctla4、lag3、tim3、2b4/cd244/cd244/slamf4、cd160和/或tigit中的两种或更多种的任何组合)的dar t细胞数量相较于展示出相同t细胞耗竭受体的car t细胞有所减少，其中减少为约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或更多倍降低水平或低于约2倍降低水平。
[0169]
在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞可以由多克隆t细胞群体(例如，pbmc)制备，而不预富集原初或记忆t细胞群体(例如，中枢记忆或效应子记忆t细胞)。预富集程序可以包括细胞培养方法、细胞分选(例如，荧光激活的细胞分选)或梯度纯化。
[0170]
转基因抗bcma dar t细胞可以被制备并且然后被储存以供体内测定的未来使用或施用于受试者。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞可以在低温保存条件下储存数小时、数天或数月。在一个实施方式中，冷藏保存的抗bcma dar t细胞可以被解冻，并且经解冻的dar t细胞相较于未冷藏保存和解冻的新鲜制备的抗bcma dar t细胞保留类似水平的活力和功能。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞被冷藏保存约1到24小时。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞被冷藏保存约1到30天。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞被冷藏保存约1到2个月、或约2到3个月、或约3到4个月、或约4到5个月、或约5到6个月或超过6个月。在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞可以在温度范围为约-80到-100℃或约-100到-150℃下冷藏保存。在一个实施方式中，经冷藏保存的抗bcma dar t细胞可以被解冻并且保持活力，其中经解冻细胞的约55-65％可存活，或经解冻细胞的约65-75％、或约75-85％、或约85-95％或约95-99％可存活。
[0171]
在一个实施方式中，抗bcma dar t细胞可以在包括70％aim-v介质、20％fbs和
1bb/cd137、cd28、cd34、cd4、fcεriγ、cd16、ox40/cd134、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrζ、cd32、cd64、cd64、cd45、cd5、cd9、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd137、cd154、lfa-1t细胞共受体、cd2 t细胞共受体/黏附分子、cd40、cd40l/cd154、vegfr2、fas和fgfr2b。
[0178]
在一个实施方式中，信号传导区选自由来自以下的信号传导区组成的组：cd3-ζ链、4-1bb、cd28、cd27、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴卵母细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、gitr(tnfrsf18)、dr3(tnfrsf25)、tnfr2、cd226以及其组合。
[0179]
在一个实施方式中，二聚体抗原受体的总体设计包括第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链包含连接到二聚化区、连接到铰链区、连接到跨膜区并且连接到一个或多个细胞内序列区的抗原结合区，并且其中第二多肽链包含抗原结合结构域和二聚化结构域。在一个实施方式中，第一多肽链和第二多肽链中的一者或两者上的抗原结合结构域选自下组：重链可变区、轻链可变区、细胞因子受体的细胞外区、单结构域抗体以及其组合。在一个实施方式中，第一多肽链和第二多肽链中的一者或两者上的二聚化结构域选自下组：κ轻链恒定区、λ轻链恒定区、亮氨酸拉链、myc-max组分以及其组合。在图1a-b和2a-b中，“s-s”代表导致第一多肽链和第二多肽链二聚化的任何化学键或缔合，所述化学键或缔合包括二硫键、亮氨酸拉链或myc-max组分。
[0180]
本公开提供了二聚体抗原受体(dar)构建体，其中第一多肽链携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，并且第二多肽链携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)(例如，图1a和b)。在一个实施方式中，所述二聚体抗原受体(dar)构建体包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)任选的铰链区；(iv)跨膜区(tm)；以及(v)细胞内区；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。
[0181]
本公开提供了二聚体抗原受体(dar)构建体，其中第一多肽链携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)，并且第二多肽链携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)(例如，图2a和b)。在一个实施方式中，二聚体抗原受体(dar)构建体包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)；(ii)抗体轻链恒定区(cl)；(iii)任选的铰链区；(iv)跨膜区(tm)；以及(v)细胞内区；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；以及(ii)抗体重链恒定区(ch)。
[0182]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，抗体重链恒定区(ch)和抗体轻链恒定区(cl)可以二聚化以形成二聚化结构域。在一个实施方式中，抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区通过一个或两个二硫键二聚化。
[0183]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，抗体重链可变区(vh)和抗体轻链可变区(vl)彼此缔合以形成抗原结合结构域。例如，当抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区二聚化时，抗体重链可变区和抗体轻链可变区彼此缔合。
[0184]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，由抗体重链可变区和抗体轻链可变区形成的抗原结合结构域结合靶抗原。
[0185]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，抗体重链可变区和抗体轻链可变区是完全人抗体区、人源化抗体区或嵌合抗体区。
[0186]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，铰链区的长度为约10到约100个氨基酸。在一个实施方式中，铰链区包含来自抗体(例如，igg、iga、igm、ige或igd)的铰链区或其片段。在一个实施方式中，铰链区包含cd8(例如，cd8α)和/或cd28铰链区或其片段。在一个实施方式中，铰链区包含cppc或sppc氨基酸序列。在一个实施方式中，铰链区包含cd8和cd28铰链序列两者(例如，长铰链区)、仅cd8序列(短铰链)或仅cd28铰链序列(例如，短铰链区)。在一个实施方式中，图1a或b或图2a或b中示出的任何二聚体抗原受体缺乏铰链区。
[0187]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，第一多肽链和第二多肽链的跨膜区可以独立地源自cd8α、cd8β、4-1bb/cd137、cd28、cd34、cd4、fcεriγ、cd16、ox40/cd134、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrζ、cd32、cd64、cd64、cd45、cd5、cd9、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd137、cd154、lfa-1t细胞共受体、cd2 t细胞共受体/黏附分子、cd40、cd40l/cd154、vegfr2、fas和fgfr2b。
[0188]
在一个实施方式中，对于图1a和b以及图2a和b中示出的二聚体抗原受体，第一多肽的细胞内区包含呈任何顺序以及来自以下的2到5个细胞内序列的细胞内共刺激和/或信号传导序列：4-1bb、cd3ζ、cd28、cd27、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、gitr(tnfrsf18)、dr3(tnfrsf25)、tnfr2、cd226以及其组合。在一个实施方式中，细胞内区包含cd28、4-1bb和/或cd3-ζ细胞内序列中的任何一个或两个或更多个的任何组合。在一个实施方式中，细胞内区包含cd28共刺激和cd3-ζ细胞内信号传导序列或4-1bb共刺激和cd3-ζ细胞内信号传导序列。在一个实施方式中，细胞内信号传导区的cd3-ζ部分包含itam(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)基序1、2和3(例如，长cd3-ζ)。在一个实施方式中，细胞内信号传导区的cd3-ζ部分包含itam基序中的仅一个，如仅itam1、2或3(例如，短cd3-ζ)。
[0189]
在一个实施方式中，二聚体抗原受体的第一多肽链(图1a和1b)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗体重链可变区。在一个实施方式中，抗体重链恒定区包含源自人抗体恒定区(例如，人ch1结构域)的序列。在一个实施方式中，抗体重链恒定区可以源自igm、iga、igg、ige或igd抗体。在一个实施方式中，抗体重链恒定区包含与seq id no:7或29的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体重链恒定区包含seq id no:7或29的氨基酸序列。在一个实施方式中，铰链区包含含有seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链、或含有seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链或含有seq id no:36的cd28和cd8铰链序列的铰链区(例如，长铰链)。在一个实施方式中，第一多肽缺乏铰链区。在一个实施方式中，跨膜区包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列。在一个实施方式中，细胞内区包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的氨基酸序列：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)在一个实施方式中，第一多肽链包含含有seq id no:54或56的氨基
酸序列的前导序列，或者第一多肽缺乏前导序列。
[0190]
在一个实施方式中，二聚体抗原受体的第二多肽链(图1a和1b)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗体轻链可变区。在一个实施方式中，抗体轻链恒定区包含来自人轻链恒定区的序列。在一个实施方式中，抗体轻链恒定区包含来自κ或λ轻链恒定区的序列。在一个实施方式中，抗体轻链恒定区包含与seq id no:11或31的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗体轻链恒定区包含seq id no:11或31的氨基酸序列。在一个实施方式中，第二多肽链包含含有seq id no:55或56的氨基酸序列的前导序列，或者第二多肽缺乏前导序列。
[0191]
在一个实施方式中，二聚体抗原受体的第一多肽链(图2a和2b)包含含有seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列的抗体轻链可变区。在一个实施方式中，抗体轻链恒定区包含seq id no:11或31的氨基酸序列。在一个实施方式中，铰链区包含含有seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链、或含有seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链或含有seq id no:36的cd28和cd8铰链序列的铰链区(例如，长铰链)。在一个实施方式中，第一多肽缺乏铰链区。在一个实施方式中，跨膜区包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列。在一个实施方式中，细胞内区包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的氨基酸序列：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)在一个实施方式中，第一多肽链包含含有seq id no:55或56的氨基酸序列的前导序列，或者第一多肽缺乏前导序列。
[0192]
在一个实施方式中，二聚体抗原受体的第二多肽链(图2a和2b)包含含有seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28的氨基酸序列的抗体重链可变区。在一个实施方式中，抗体重链恒定区包含seq id no:7或29的氨基酸序列。在一个实施方式中，第二多肽链包含含有seq id no:54或56的氨基酸序列的前导序列，或者第二多肽缺乏前导序列。
[0193]
本公开提供了版本1(例如，v1)二聚体抗原受体(dar)构建体，所述dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1)，其中(a)所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd8和cd28铰链序列(例如，seq id no:36)的长铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)包含cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)的细胞内区；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。在一个实施方式中，抗体重链可变区(vh)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区，并且抗体轻链可变区(vl)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0194]
本公开提供了版本2(例如，v2)二聚体抗原受体(dar)构建体，所述dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1和2)，其中(a)所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28铰链序列(例如，seq id no:35)的短铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)细胞内区，所述细胞内区包含：(1)4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)以及具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)；或(2)cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)；或(3)4-1bb(例如，seq id no:41)信号传导序列和cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列以及具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。
[0195]
在一个实施方式中，版本2a(v2a)dar构建体包含具有4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)的细胞内区。
[0196]
在一个实施方式中，版本2b(v2b)dar构建体包含具有cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)的细胞内区。
[0197]
在一个实施方式中，版本2c(v2c)dar构建体包含具有4-1bb(例如，seq id no:41)信号传导序列和cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列以及具有itam基序1、2和3的cd3-ζ(例如，seq id no:44)的细胞内区。
[0198]
在一个实施方式中，dar v2a和v2b是第二代dar构建体，而dar v2c是第三代dar构建体。
[0199]
在一个实施方式中，在dar v2a、v2b和v2c构建体中，抗体重链可变区(vh)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区，并且抗体轻链可变区(vl)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0200]
本公开提供了版本3a、3b和3c(例如，v3a、v3b和v3c)二聚体抗原受体(dar)构建体，所述dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1)，其中(a)所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28铰链序列(例如：seq id no:35)的短铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)包含4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和仅具有itam基序3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:47)的细胞内区；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。
[0201]
在一个实施方式中，版本3a(v3a)dar构建体包含具有4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0202]
在一个实施方式中，版本3b(v3b)dar构建体包含具有cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列和具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0203]
在一个实施方式中，版本3c(v3c)dar构建体包含具有4-1bb(例如，seq id no:41)信号传导序列和cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列以及具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0204]
在一个实施方式中，dar v3a和v3b是第二代dar构建体，而dar v3c是第三代dar构建体。
[0205]
在一个实施方式中，在dar v3a、v3b和v3c构建体中，抗体重链可变区(vh)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区，并且抗体轻链可变区(vl)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。在一个实施方式中，dar版本3b(例如，v3b)是包括cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)的第三代dar构建体。
[0206]
本公开提供了版本4(例如，v4)二聚体抗原受体(dar)构建体，所述dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(iv)包含4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和仅具有itam基序3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:47)的细胞内区；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。dar v4构建体缺乏铰链序列。在一个实施方式中，在dar v4构建体中，抗体重链可变区(vh)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区，并且抗体轻链可变区(vl)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0207]
前体多肽
[0208]
本公开提供了前体多肽。在一个实施方式中，前体多肽可以被处理以成为缔合/组装以形成二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽链和第二多肽链。在本文中描述的包含自切割序列的任何前体多肽实施方式中，自切割序列可以是t2a、p2a、e2a或f2a序列。在一些实施方式中，所述自切割序列并非t2a序列，例如，所述自切割序列是p2a、e2a或f2a序列。
[0209]
本公开提供了前体多肽，所述前体多肽包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导序列；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)任选的铰链区；(v)跨膜区；(vi)细胞内区；(vii)自切割序列；(viii)轻链前导序列；(ix)抗体轻链可变区；以及(x)抗体轻链恒定区(图3a和b)。在非限制性实例中，细胞内区包含4-1bb、cd3ζ和/或cd28中的至少两种的任何组合(图3a和b)。本领域技术人员将理解，其它细胞内共刺激和/或信号传导序列的组合是可能的。自切割序列是促进产生两个分开的多肽的核糖体跳跃和蛋白质翻译重新开始的氨基酸序列。在一个实施方式中，前体多肽群体包括已经在自切割序列处切割或未切割的多肽的混合物和/或已经在重链和/或轻链前导序列处切割或未切割的多肽的混合物。
[0210]
本公开提供了前体多肽，所述前体多肽包含从氨基末端排序到羧基末端的多个
区：(i)轻链前导序列；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)任选的铰链区；(v)跨膜区；(vi)细胞内区；(vii)自切割序列；(viii)重链前导序列；(ix)抗体重链可变区；以及(x)抗体重链恒定区(图4a和b)。在非限制性实例中，细胞内区包含4-1bb、cd3ζ和/或cd28中的至少两种的任何组合(图4a和b)。本领域技术人员将理解，其它细胞内共刺激和/或信号传导序列的组合是可能的。自切割序列是促进产生两个分开的多肽的核糖体跳跃和蛋白质翻译重新开始的氨基酸序列。在一个实施方式中，前体多肽群体包括已经在自切割序列处切割或未切割的多肽的混合物和/或已经在重链和/或轻链前导序列处切割或未切割的多肽的混合物。
[0211]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，重链前导序列和轻链前导序列包含将多肽链(例如，第一多肽链和第二多肽链)靶向到细胞分泌通路并且将允许多肽整合和锚定到细胞膜的脂质双层中的肽信号序列。重链前导序列和轻链前导序列可以引导前体多肽从细胞溶质运输到宿主细胞的内质网。重链前导序列和轻链前导序列可以引导前体多肽从内质网运输到细胞膜的脂质双层。重链前导序列和轻链前导序列包括包含cd8α、cd28或cd16前导序列的信号序列。
[0212]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，前体多肽的n末端包括第一肽信号序列(例如，重链前导序列或轻链前导序列)。
[0213]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，前体多肽可以包括位于切割序列之后的第二肽信号序列(例如，重链前导序列或轻链前导序列)。
[0214]
在一个实施方式中，前体多肽可以在切割序列处进行切割，由此产生第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链各自具有在其n末端处的肽信号序列。
[0215]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，前体多肽的处理包括将前体切割成第一多肽链和第二多肽链、分泌前体和/或将前体锚定在细胞膜中。
[0216]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，在前体多肽链被切割以产生第一多肽链和第二多肽链后，(多肽链中的一条多肽链的)抗体重链恒定区(ch)和(另一条多肽链的)抗体轻链恒定区(cl)可以二聚化以形成二聚化结构域。在一个实施方式中，抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区通过一个或两个二硫键二聚化(例如，参见图1a和b以及2a和b)。
[0217]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，在前体多肽链被切割以产生第一多肽链和第二多肽链后，(多肽链中的一条多肽链的)抗体重链可变区(vh)和(另一条多肽链的)抗体轻链可变区(vl)彼此缔合以形成抗原结合结构域。例如，当抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区二聚化时，抗体重链可变区和抗体轻链可变区彼此缔合(例如，参见图1a和b以及2a和b)。
[0218]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，由抗体重链可变区和抗体轻链可变区形成的抗原结合结构域结合靶抗原。
[0219]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，抗体重链可变区和抗体轻链可变区包括完全人、人源化或嵌合的抗体区。
[0220]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，铰链区的长度为约10到约100个氨基酸。在一个实施方式中，铰链区包含来自抗体(例如，igg、iga、igm、ige或igd)的铰链区或其片段。在一个实施方式中，铰链区包含cd8(例如，cd8α)或cd28铰链
区或其片段。在一个实施方式中，铰链区包含cppc或sppc氨基酸序列。在一个实施方式中，铰链区包含cd8和cd28铰链序列两者(例如，长铰链区)、仅cd8序列(短铰链)或仅cd28铰链序列(例如，短铰链区)。在一个实施方式中，前体多肽缺乏铰链区。
[0221]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，前体多肽链的跨膜区可以源自cd8α、cd8β、4-1bb/cd137、cd28、cd34、cd4、fcεriγ、cd16、ox40/cd134、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrζ、cd32、cd64、cd64、cd45、cd5、cd9、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd137、cd154、lfa-1t细胞共受体、cd2 t细胞共受体/黏附分子、cd40、cd40l/cd154、vegfr2、fas和fgfr2b。
[0222]
在一个实施方式中，对于图3a和b以及图4a和b中示出的前体多肽，第一多肽的细胞内区包含呈任何顺序以及包括以下的二到五个细胞内序列的任何组合的细胞内信号传导和/或共刺激序列：4-1bb、cd3ζ、cd28、cd27、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、gitr(tnfrsf18)、dr3(tnfrsf25)、tnfr2和/或cd226。在一个实施方式中，细胞内区包含来自cd28、4-1bb和/或cd3-ζ中的任何一个或两个或更多个的任何组合的序列。在一个实施方式中，细胞内区包含cd28和cd3-ζ细胞内序列或4-1bb和cd3-ζ细胞内序列。在一个实施方式中，细胞内区的cd3-ζ部分包含itam(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)基序1、2和3(例如，长cd3-ζ)。在一个实施方式中，细胞内区的cd3-ζ部分包含itam基序中的仅一个，如仅基序1、2或3(例如，短cd3-ζ)。
[0223]
本公开提供了前体多肽，所述前体多肽包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；(iii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切割序列；(viii)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ix)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；以及(x)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，全长前体多肽包含seq id no:63、66、69、72、75、78、81或84中的任何一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，前体多肽可以通过在自切割序列处切割进行处理以释放第一多肽链和第二多肽链并且分泌前体和/或将前体锚定在细胞膜中。第一多肽链和第二多肽链可以通过抗体重链恒定区与抗体轻链恒定区之间的至少一个二硫键二聚化，并且抗体重链可变区和抗体轻链可变区可以形成结合bcma抗原的抗原结合结构域。在一个实施方式中，前体多肽缺乏铰链区。
[0224]
本公开提供了前体多肽，所述前体多肽包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、
10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切割序列；(viii)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ix)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；以及(x)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区。在一个实施方式中，前体多肽可以通过在自切割序列处切割进行处理以释放第一多肽链和第二多肽链并且分泌前体和/或将前体锚定在细胞膜中。第一多肽链和第二多肽链可以通过抗体重链恒定区与抗体轻链恒定区之间的至少一个二硫键二聚化，并且抗体重链可变区和抗体轻链可变区可以形成结合bcma抗原的抗原结合结构域。在一个实施方式中，前体多肽缺乏铰链区。
[0225]
编码二聚体抗原受体的核酸以及相关分子
[0226]
本公开提供了编码本文中描述的第一多肽链、第二多肽链、第一多肽链和第二多肽链、二聚体抗原受体或前体多肽中的任何一种的核酸。在本文中描述的编码包含自切割序列的前体多肽的任何核酸实施方式中，自切割序列可以是t2a、p2a、e2a或f2a序列。在一些实施方式中，所述自切割序列并非t2a序列，例如，所述自切割序列是p2a、e2a或f2a序列。
[0227]
本公开提供了编码包含以下的前体多肽的核酸：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；(vii)自切割序列区；(viii)轻链前导区；(ix)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；以及(x)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图3a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0228]
本公开提供了编码包含以下的前体多肽的核酸：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；(iii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切
割序列；(viii)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ix)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；以及(1x)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图3a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0229]
本公开提供了编码包含以下的前体多肽的核酸：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；(vii)自切割序列；(viii)重链前导区；(ix)抗体重链可变区；以及(x)抗体重链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图4a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0230]
本公开提供了编码包含以下的前体多肽的核酸：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切割序列；(viii)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ix)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；以及(x)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图4a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0231]
本公开提供了编码第一多肽链的第一核酸，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区的第一多肽。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏铰链区的第一多肽。在一个实施方式中，第一核酸编码图1a或b中例示的第一多肽链。
[0232]
本公开提供了编码第二多肽链的第二核酸，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽。在一个实施方式中，第二核酸编码图1a或b中例示的第二多肽链。
[0233]
在一个实施方式中，核酸编码第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二
多肽链包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导序列；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；以及(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，单个核酸编码缺乏重链前导区的第一多肽和/或单个核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽。在一个实施方式中，单个核酸编码缺乏铰链区的第一多肽。在一个实施方式中，单个核酸编码图1a或b中例示的第一多肽链和第二多肽链。
[0234]
本公开提供了编码第一多肽链的第一核酸，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏轻链前导区的第一多肽。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏铰链区的第一多肽。在一个实施方式中，第一核酸编码图2a或b中例示的第一多肽链。
[0235]
本公开提供了编码第二多肽链的第二核酸，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏重链前导区的第二多肽。在一个实施方式中，第二核酸编码图2a或b中例示的第二多肽链。
[0236]
在一个实施方式中，核酸编码第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导序列；(ii)抗体轻链可变区(例如，κ或λ)；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；以及(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区；以及(ii)抗体重链恒定区。在一个实施方式中，单个核酸编码缺乏轻链前导区的第一多肽和/或单个核酸编码缺乏重链前导区的第二多肽。在一个实施例中，单个核酸编码缺乏铰链区的第一多肽。在一个实施方式中，单个核酸编码图2a或b中例示的第一多肽链和第二多肽链。
[0237]
本公开提供了编码第一多肽链的核酸，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；(ii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区；(iii)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(iv)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；以及(v)细胞内区，所述细胞内区包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的氨基酸序列：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)在一个实施方式中，核酸编码包含seq id no:64、67、70、73、76、79、82或85中的任何一个的氨基酸序列的第一多肽链，其中第一多肽链包括或缺乏前导序列(例如，seq id no:54或55)。在一个实施方式中，核酸编码缺乏铰链区的第一多肽链。
[0238]
本公开提供了编码第二多肽链的核酸，所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的
氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；以及(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码包含seq id no:65、68、71、74、77、80、83或86中的任何一个的氨基酸序列的第二多肽链，其中第二多肽链包括或缺乏前导序列(例如，seq id no:55或56)。
[0239]
本公开提供了编码版本1(例如，v1)二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸，所述v1 dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1a)，其中(a)第一核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第一多肽链：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd8和cd28铰链序列(例如：seq id no:36)的长铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)包含cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)的细胞内区；(b)第二核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第二多肽链：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。在一个实施方式中，抗体重链可变区(vh)包含具有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区序列。在一个实施方式中，抗体轻链可变区(vl)包含具有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0240]
本公开提供了编码版本2(例如，v2)二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸，所述v2 dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1a或b)，其中(a)第一核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第一多肽链：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28铰链序列(例如，seq id no:37)的短铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)包含以下的细胞内区：(1)4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)；或(2)cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)；或(3)4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)以及具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)；(b)第二核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第二多肽链：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。
[0241]
在一个实施方式中，核酸编码版本2a(v2a)dar构建体，所述v2a dar构建体包含具有4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)的细胞内区。
[0242]
在一个实施方式中，核酸编码版本2b(v2b)dar构建体，所述v2b dar构建体包含具有cd28共刺激序列(例如，seq id no:42)和具有itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)的细胞内区。
[0243]
在一个实施方式中，核酸编码版本2c(v2c)dar构建体，所述v2c dar构建体包含具有4-1bb共刺激区(例如，seq id no:41)和cd28共刺激区(例如，seq id no:42)以及具有
itam基序1、2和3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:44)的细胞内区。在一个实施方式中，dar v2a和v2b是第二代dar构建体，而dar v2c是第三代dar构建体。在一个实施方式中，抗体重链可变区(vh)包含具有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区序列。在一个实施方式中，抗体轻链可变区(vl)包含具有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0244]
本公开提供了编码版本3a(例如，v3a)二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸，所述v3a dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如，图1a)，其中(a)第一核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第一多肽链：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28铰链序列(例如，seq id no:35)的短铰链区；(iv)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(v)细胞内区，所述细胞内区包含：(1)4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)以及具有itam基序3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:47)；或(2)cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列和具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)；或(3)4-1bb(例如，seq id no:41)信号传导序列和cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列以及具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)；(b)第二核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第二多肽链：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。在一个实施方式中，抗体重链可变区(vh)包含具有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区序列。在一个实施方式中，抗体轻链可变区(vl)包含具有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0245]
在一个实施方式中，核酸编码版本3a(v3a)dar构建体，所述v3a dar构建体包含具有4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)以及具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0246]
在一个实施方式中，核酸编码版本3b(v3b)dar构建体，所述v3b dar构建体包含具有cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列和具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0247]
在一个实施方式中，核酸编码版本3c(v3c)dar构建体，所述v3c dar构建体包含具有4-1bb(例如，seq id no:41)信号传导序列和cd28(例如，seq id no:42)信号传导序列以及具有itam基序3的cd3-ζ(例如，seq id no:47)的细胞内区。
[0248]
在一个实施方式中，dar v3a和v3b是第二代dar构建体，而dar v3c是第三代dar构建体。
[0249]
在一个实施方式中，在dar v3a、v3b和v3c构建体中，抗体重链可变区(vh)包含含有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区，并且抗体轻链可变区(vh)包含含有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0250]
本公开提供了编码版本4(例如，v4)二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸，所述v4 dar构建体包含携带重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的第一多肽链以及携带轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的第二多肽链(例如图1a，而不具有铰链)，其中(a)第一核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第一多肽链：(i)抗体重链可变区(vh)；(ii)抗体重链恒定区(ch)；(iii)包含cd28跨膜序列(例如，seq id no:37)的跨膜区(tm)；以及(iv)包含4-1bb共刺激序列(例如，seq id no:41)和具有itam基序3的cd3-ζ信号传导序列(例如，seq id no:47)的细胞内区；(b)第二核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第二多肽链：(i)抗体轻链可变区(vl)(例如，κ或λ)；以及(ii)抗体轻链恒定区(cl)。dar v4构建体缺乏铰链序列。在一个实施方式中，抗体重链可变区(vh)包含具有与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma重链可变区序列。在一个实施方式中，抗体轻链可变区(vl)包含具有与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的抗bcma轻链可变区序列。
[0251]
载体
[0252]
本公开提供了可操作地连接到编码本文中描述的前体多肽、第一多肽链、第二多肽链或第一多肽链和第二多肽链中的任何一种的一个或多个核酸的载体。
[0253]
本公开提供了可操作地连接到编码前体多肽的核酸的载体，所述前体多肽包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；(vii)自切割序列区；(viii)轻链前导区；(ix)抗体轻链可变区；以及(x)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，前体多肽缺乏铰链区。在一个实施方式中，前体多肽缺乏重链前导区和/或轻链前导区。在一个实施方式中，图3a或b中例示了前体多肽。
[0254]
本公开提供了可操作地连接到编码前体多肽的核酸的载体，所述前体多肽包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；(iii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切割序列；(viii)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ix)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；以及(x)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图3a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0255]
本公开提供了可操作地连接到编码前体多肽的核酸的载体，所述前体多肽包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；(vii)自切割序列；(viii)重链前导区；(ix)抗体重链可变区；以及(x)抗体重链恒定区。在一个实施方式中，前体多肽缺乏铰链区。在一个实施方式中，前体多肽缺乏重链前导区和/或轻链前导区。在一个实施方式中，图4a或b中例示了前体多肽。
[0256]
本公开提供了编码包含以下的前体多肽的核酸：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:55或56的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；(vii)包含seq id no:57、58、59或60的氨基酸序列中的任何一个的自切割序列；(viii)包含seq id no:54或56的氨基酸序列的重链前导序列；(ix)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；以及(x)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区。在一个实施方式中，核酸编码图4a或b中例示的前体多肽。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。
[0257]
本公开提供了可操作地连接到编码第一多肽链的第一核酸的第一载体，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一载体可操作地连接到编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第一多肽链。
[0258]
在一个实施例中，第一载体可操作地连接到编码第一多肽链的第一核酸，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:54的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；(iii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)。在一个实施方式中，第一载体可
操作地连接到编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第一多肽链。
[0259]
本公开提供了可操作地连接到编码第二多肽链的第二核酸的第二载体，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二载体可操作地连接到编码缺乏轻链前导区的第二多肽链的第二核酸。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。
[0260]
在一个实施方式中，第二载体可操作地连接到编码第二多肽链的第二核酸，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:55的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；以及(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二载体可操作地连接到编码缺乏轻链前导区的第二多肽链的第二核酸。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。
[0261]
本公开提供了可操作地连接到编码第一多肽链的第一核酸的第一载体，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一载体可操作地连接到编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链。
[0262]
本公开提供了可操作地连接到编码第一多肽链的第一核酸的第一载体，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:55的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)。在一个实施方式中，第一载体可操作地连接到编码缺乏轻链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链。
[0263]
本公开提供了可操作地连接到编码第二多肽链的第二核酸的第二载体，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二载体可操作地连接到编码缺乏重链前导区的第二多肽链的第二核酸。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第二多肽链。
[0264]
本公开提供了可操作地连接到编码第二多肽链的第二核酸的第二载体，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)包含seq id no:54的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；以及(iii)包
id no:55的氨基酸序列的轻链前导序列；(ii)包含与seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体轻链可变区；(iii)包含seq id no:11或31的氨基酸序列的bcma抗体轻链恒定区；(iv)包含seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地包含seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链；(v)包含seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的氨基酸序列的跨膜区；(vi)包含选自下组的任何一个或两个或更多个细胞内序列的任何组合的细胞内区：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)；并且(b)第二核酸编码包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区的第二多肽：(i)包含seq id no:54的氨基酸序列的重链前导序列；(ii)包含与seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的bcma抗体重链可变区；以及(iii)包含seq id no:7或29的氨基酸序列的bcma抗体重链恒定区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏轻链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏重链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链和第二多肽链。
[0269]
宿主细胞
[0270]
本公开提供了宿主细胞或宿主细胞群体，所述宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码本文中描述的第一多肽链、第二多肽链、第一多肽链和第二多肽链、二聚体抗原受体或前体多肽中的任何一个的核酸转基因的一个或多个表达载体。
[0271]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体中引入一个或多个表达载体，其中载体可操作地连接到编码本文中描述的任何二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸转基因。宿主细胞或宿主细胞群体包含t淋巴细胞(例如，t细胞、调控t细胞、γ-δt细胞以及细胞毒性t细胞)、nk(天然杀伤)细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、b淋巴细胞、单核细胞。在一个实施方式中，nk细胞包含脐带血源性nk细胞或胎盘源性nk细胞。
[0272]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体是自体的并且源自接受表达二聚体抗原受体(dar)的宿主细胞的治疗的受试者(例如，受体受试者)。在一个实施方式中，可以从受体受试者获得血液(例如，全血)，可以从受体受试者的血液回收/富集所需细胞(例如，t细胞)，并且可以通过将可操作地连接到编码本文中描述的任何二聚体抗原受体的核酸的一个或多个表达载体引入到所需细胞中来制备自体转基因细胞。将表达二聚体抗原受体构建体的自体转基因t细胞施用于受体受试者可以极大减少受试者的移植物抗宿主疾病。
[0273]
在一个实施方式中，用于治疗受试者的宿主细胞或宿主细胞群体是同种异体的，并且源自不同受试者(例如，供体受试者)或源自多个供体受试者。在一个实施方式中，供体受试者将不会接受表达二聚体抗原受体(dar)的宿主细胞的治疗。在一个实施方式中，同种异体宿主细胞包括源自将不接受表达二聚体抗原受体(dar)的宿主细胞的治疗的同卵双生供体的同基因宿主细胞。可以以与自体细胞类似的方式从来自至少一个供体的血液(例如，全血)获得同种异体细胞。在一个实施方式中，可以从至少一个供体获得血液(例如，全血)，可以从供体(或供体的)的血液回收/富集所需细胞，并且可以通过将可操作地连接到编码本文中描述的任何二聚体抗原受体的核酸的一个或多个表达载体引入到供体(或供体的)
的所需细胞中来制备同种异体转基因细胞。将表达二聚体抗原受体构建体的同种异体转基因t细胞施用于受试者可能导致受试者的移植物抗宿主疾病。
[0274]
在一个实施方式中，从受试者的血液或从供体的血液中回收的所需细胞包括t淋巴细胞(例如，t细胞、调控t细胞、γ-δt细胞以及细胞毒性t细胞)、nk(天然杀伤)细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、b淋巴细胞、单核细胞。在一个实施方式中，nk细胞包含脐带血源性nk细胞或胎盘源性nk细胞。
[0275]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可以引导转基因瞬时引入到宿主细胞中或将转基因稳定插入到所述宿主细胞的基因组中的一个或多个表达载体，其中转基因包含编码本文中描述的任何二聚体抗原受体的核酸。表达载体可以引导转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。表达载体可以包括一个或多个调控序列，如诱导型和/或组成型启动子和增强子。表达载体可以包括核糖体结合位点和/或聚腺苷酸化位点。在一个实施方式中，可操作地连接到编码二聚体抗原受体(dar)构建体的核酸的表达载体可以引导二聚体抗原受体(dar)构建体产生，所述dar构建体可以展示于转基因宿主细胞的表面上，或者二聚体抗原受体可以分泌到细胞培养基中。在一个实施方式中，宿主细胞可以携带可操作地连接到编码任何二聚体抗原受体的核酸转基因的一个或多个表达载体，并且可以在合适的培养基中培养宿主细胞以短暂或稳定地表达二聚体抗原受体构建体。
[0276]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带包含源自病毒(例如，逆转录病毒、慢病毒或腺病毒)的核酸主链序列的一个或多个表达载体。在一个实施方式中，表达载体可以包括用于与crispr(成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统一起使用以将转基因插入或替代到宿主细胞的基因组中的用于同源定向修复的转基因和序列。在一个实施方式中，crispr系统中使用的转基因可以可操作地接合到启动子以介导二聚体抗原受体的组成型或诱导性转录。在一个实施方式中，crispr包括cas9或cpf1(cas12a)。在一个实施方式中，表达载体包含转座子中的与基于转座酶的系统一起使用的转基因。转座酶系统的实例包括可商购获得的系统，如piggybac、super piggybac和sleeping beauty(包括sb100x)。
[0277]
本公开提供了宿主细胞或宿主细胞群体，所述宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码前体多肽的核酸的表达载体，所述前体多肽包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内共刺激和/或信号传导序列的细胞内区；(vii)自切割序列区；(viii)轻链前导区；(ix)抗体轻链可变区；以及(x)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。在一个实施方式中，图3a和b中例示了前体多肽。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码具有seq id no:63、66、69、72、75、78、81或84的氨基酸序列的前体多肽中的任何一个的核酸的表达载体。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达前体多肽。
[0278]
本公开提供了宿主细胞或宿主细胞群体，所述宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码前体多肽的核酸的表达载体，所述前体多肽包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；(vi)具有两个到五个细胞内共刺激和/或信号传导序列的细胞内区；(vii)自切割序列；(viii)重链前导区；(ix)抗体重链可变区；以及(x)抗体重链恒定区。在一个实施方
式中，编码前体多肽的核酸缺乏铰链区。在一个实施方式中，编码前体多肽的核酸缺乏重链前导区和/或轻链前导区。在一个实施方式中，图4a和b中例示了前体多肽。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达前体多肽。
[0279]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链和第二多肽链的核酸的表达载体，所述表达载体包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导序列；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；以及(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区；以及(ii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达第一多肽链和第二多肽链。
[0280]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链和第二多肽链的核酸的表达载体，所述表达载体包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导序列；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；以及(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区；以及(ii)抗体重链恒定区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达第一多肽链和第二多肽链。
[0281]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链的核酸的第一表达载体并且携带可操作地连接到编码第二多肽链的核酸的第二表达载体，其中(a)第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导序列；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；并且其中(b)第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体轻链可变区；以及(ii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达第一多肽链和第二多肽链。
[0282]
在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链的核酸的第一表达载体并且携带可操作地连接到编码第二多肽链的核酸的第二表达载体，其中(a)第一多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导序列；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)具有两个到五个细胞内序列的细胞内区；并且其中(b)第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)抗体重链可变区；以及(ii)抗体重链恒定区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺
乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达第一多肽链和第二多肽链。
[0283]
本公开提供了第一宿主细胞或第一宿主细胞群体，所述第一宿主细胞或第一宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链的核酸的第一表达载体，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；(iii)抗体重链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第一宿主细胞或第一宿主细胞群体表达第一多肽链。
[0284]
本公开提供了第二宿主细胞或第二宿主细胞群体，所述第二宿主细胞或第二宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第二多肽链的核酸的第二表达载体，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，第二宿主细胞或第二宿主细胞群体表达第二多肽链。
[0285]
本公开提供了第一宿主细胞或第一宿主细胞群体，所述第一宿主细胞或第一宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第一多肽链的核酸的第一表达载体，所述第一多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)轻链前导区；(ii)抗体轻链可变区；(iii)抗体轻链恒定区；(iv)铰链区；(v)跨膜区；以及(vi)细胞内区。在一个实施方式中，第一核酸编码缺乏重链前导区和/或缺乏铰链区的第一多肽链。在一个实施方式中，图2a或b中例示了第一多肽链。在一个实施方式中，第一宿主细胞或第一宿主细胞群体表达第一多肽链。
[0286]
本公开提供了第二宿主细胞或第二宿主细胞群体，所述第二宿主细胞或第二宿主细胞群体携带可操作地连接到编码第二多肽链的核酸的第二表达载体，所述第二多肽链包含：从氨基末端排序到羧基末端的多个区：(i)重链前导区；(ii)抗体重链可变区；以及(iii)抗体轻链恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码缺乏轻链前导区的第二多肽链。在一个实施方式中，图1a或b中例示了第二多肽链。在一个实施方式中，第二宿主细胞或第二宿主细胞群体表达第二多肽链。
[0287]
本公开提供了宿主细胞或宿主细胞群体，所述宿主细胞或宿主细胞群体至少携带可操作地连接到编码二聚体抗原受体的一个或多个核酸的表达载体，其中核酸编码前体多肽或编码第一多肽链和/或第二多肽链。
[0288]
在一个实施方式中，bcma抗体重链可变区包含seq id no:6、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的任何一个的氨基酸序列。
[0289]
在一个实施方式中，bcma抗体重链恒定区包含seq id no:7或29的氨基酸序列。
[0290]
在一个实施方式中，铰链区包含含有seq id no:35的氨基酸序列的cd28铰链区以及任选地含有seq id no:34的氨基酸序列的cd8铰链区。
[0291]
在一个实施方式中，跨膜区包含含有seq id no:37(来自cd28)、seq id no:38(来自cd8)、seq id no:39(来自4-1bb)或seq id no:40(来自cd3ζ)的任何一个氨基酸序列的cd28跨膜区。
[0292]
在一个实施方式中，细胞内区以任何顺序包含选自下组的两个或五个细胞内序列的任何组合：seq id no:41(来自4-1bb)、seq id no:42(来自cd28)、seq id no:43(来自ox40)、seq id no:44(cd3ζitam 1、2和3)、seq id no:45(cd3ζitam 1)、seq id no:46(cd3ζitam 2)和/或seq id no:47(cd3ζitam 3)。
[0293]
在一个实施方式中，bcma抗体轻链可变区包含seq id no:8、9、10、13、15、17、19、21、23、25、27或30中的任何一个的氨基酸序列。
[0294]
在一个实施方式中，bcma抗体轻链恒定区包含seq id no:11或31的氨基酸序列。
[0295]
在一个实施方式中，重链前导序列包含seq id no:54或56的氨基酸序列。在一个实施方式中，轻链前导序列包含seq id no:55或56的氨基酸序列。
[0296]
在一个实施方式中，自切割序列包含seq id no:57、58、59或60中的任何一个的氨基酸序列。
[0297]
组合物和药物组合物
[0298]
本公开提供了包含转基因宿主细胞群体的组合物，所述转基因宿主细胞群体已经被工程化以表达二聚体抗原受体(dar)构建体中的任何一种，所述dar构建体包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个。在一个实施方式中，转基因宿主细胞群体的选择可以基于被治疗的疾病的类型和/或受试者所需的反应的类型。
[0299]
在一个实施方式中，组合物包括表达结合bcma抗原的二聚体抗原受体(dar)的多个转基因宿主细胞，所述dar包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个。在一个实施方式中，所述多个转基因宿主细胞携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体，所述表达载体可以被转基因宿主细胞表达并且处理以产生彼此缔合以形成二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽链和第二多肽链。在一个实施方式中，转基因宿主细胞群体与药学上可接受的赋形剂混合。
[0300]
本公开提供了包含表达不同二聚体抗原受体(dar)构建体的两个或更多个转基因宿主细胞群体的组合的组合物。在一个实施方式中，组合物包含第一转基因宿主细胞群体和第二转基因宿主细胞群体，其中第一群体和第二群体已经被工程化以表达不同二聚体抗原受体(dar)构建体。在一个实施方式中，第一转基因宿主细胞群体和第二转基因宿主细胞群体的选择可以基于被治疗的疾病的类型和/或受试者所需的反应的类型。
[0301]
在一个实施方式中，组合物包括包含表达结合bcma抗原的第一类型的二聚体抗原受体(dar)的多个第一转基因宿主细胞的第一群体，所述dar包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个。在一个实施方式中，所述多个第一转基因宿主细胞携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体，其中核酸可以通过转基因宿主细胞表达，并且经表达的多肽可以被转基因宿主细胞处理以产生彼此缔合以形成第一类型的二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽和第二多肽。在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体与药学上可接受的赋形剂混合。
[0302]
在一个实施方式中，组合物包括包含可以表达结合bcma抗原的第二类型的二聚体
抗原受体(dar)的多个第二转基因宿主细胞的第二群体，所述dar包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个，其中第二类型的二聚体抗原受体(dar)不同于第一类型的二聚体抗原受体(dar)。在一个实施方式中，所述多个第二转基因宿主细胞携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体，其中核酸可以通过转基因宿主细胞表达，并且经表达的多肽可以被转基因宿主细胞处理以产生彼此缔合以形成第二类型的二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽和第二多肽。在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第二群体与药学上可接受的赋形剂混合。
[0303]
在一个实施方式中，用于组合物的第一类型和第二类型的dar表达性转基因宿主细胞的选择可以基于dar t细胞的任何特性，包括例如细胞杀伤能力、开发记忆t细胞的能力、体外扩增能力、体内持久性能力、降低的t细胞耗竭特性和/或低温保存特性。
[0304]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体可以表达包含以下的v1、v2b或v3b二聚体抗原受体(dar)：(i)具有cd28细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v1、v2b或v3b表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第一群体)在施用于受试者时可以诱导强劲且快速的效应子应答，其中所述应答可以由所选择的dar t细胞的cd28细胞内区介导。
[0305]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第二群体可以表达包含以下的v2a、v3a或v4二聚体抗原受体(dar)：(i)具有4-1bb细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v2a、v3a或v4b表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第二群体)在施用于受试者时可以诱导持久的记忆t细胞群体的开发，其中dar t细胞的特性可以由所选择的dar t细胞的4-1bb细胞内区介导。
[0306]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体或第二群体可以表达包含以下的v2c或v3c二聚体抗原受体(dar)：(i)具有cd28和4-1bb细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v2c或v3c表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第一群体或第二群体)可以在受试者中诱导强劲且快速的效应子应答和持久的记忆t细胞群体的开发的组合，其中dar t细胞的特性可以由所选择的dar t细胞的cd28和4-1bb细胞内区介导。
[0307]
本公开提供了一种治疗组合物，所述治疗组合物包含两个或更多个转基因宿主细胞群体的混合物，所述转基因宿主细胞群体至少包含第一转基因宿主细胞群体和第二转基因宿主细胞群体，其中(i)第一群体包含携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体的第一多个转基因宿主细胞，所述表达载体可以被所述多个第一转基因宿主细胞表达并且处理以产生彼此缔合以形成第一二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽和第二多肽，并且(ii)第二群体包含携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体的第二多个转基因宿主细胞，所述表达载体可以被所述多个第二转基因宿主细胞表达并且处理以产生彼此缔合以形成不同于第一二聚体抗原受体(dar)的第二二聚体抗原受体
(dar)构建体的第一多肽和第二多肽。在一个实施方式中，第一多个宿主细胞表达包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4的第一二聚体抗原受体(dar)构建体。在一个实施方式中，第二多个宿主细胞表达包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4的第二二聚体抗原受体(dar)构建体，其中第二dar构建体不同于第一dar构建体。在一个实施方式中，治疗组合物包括第一量的转基因宿主细胞的第一群体以及第二量的转基因宿主细胞的第二群体，其中第一量和第二量相同或不同。在一个实施方式中，治疗组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
[0308]
治疗方法
[0309]
本公开进一步提供了用于通过以下进行过继性细胞疗法的方法：向受试者施用有效量的转基因宿主细胞群体，所述转基因宿主细胞群体已经被工程化以表达抗bcma二聚体抗原受体(dar)构建体中的任何一种，所述dar构建体包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4 dar构建体中的任何一种。dar表达性转基因宿主细胞的选择可以基于被治疗的疾病的类型和受试者所需的反应的类型。
[0310]
本公开进一步提供了一种治疗患有与肿瘤抗原的有害表达(例如，升高表达)相关的疾病、病症或病状的受试者的方法。此类方法包括向受试者施用有效量的携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体的宿主细胞群体。在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体表达本文中描述的第一多肽链和第二多肽链中的任何一个或前体多肽链中的任何一个。
[0311]
本公开提供了用于通过以下进行过继性细胞疗法的方法：向受试者施用有效量的转基因宿主细胞的至少两个群体的组合，其中每个群体已经被工程化以表达不同二聚体抗原受体(dar)构建体。在一个实施方式中，用于进行过继性细胞疗法的方法包括向受试者施用有效量的转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的组合，其中第一群体和第二群体已经被工程化以表达不同二聚体抗原受体(dar)构建体。转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的选择可以基于被治疗的疾病的类型和/或受试者所需的反应的类型。
[0312]
在一个实施方式中，第一群体包括表达结合bcma抗原的第一类型的二聚体抗原受体(dar)的多个第一转基因宿主细胞，所述dar包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个。在一个实施方式中，所述多个第一转基因宿主细胞携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载体，其中核酸可以通过转基因宿主细胞表达，并且经表达的多肽被转基因宿主细胞处理以产生彼此缔合以形成第一类型的二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽和第二多肽。在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体与药学上可接受的赋形剂混合。
[0313]
在一个实施方式中，第二群体包括可以表达结合bcma抗原的第二类型的二聚体抗原受体(dar)的多个第二转基因宿主细胞，所述dar包括v1、v2a、v2b、v2c、v3a、v3b、v3c或v4二聚体抗原受体(dar)中的任何一个，其中第二类型的二聚体抗原受体(dar)不同于第一类型的二聚体抗原受体(dar)。在一个实施方式中，所述多个第二转基因宿主细胞携带可操作地连接到编码本文中所描述的第一多肽链或第二多肽链中的任何一个、或第一多肽链和第二多肽链中的任何一个、或前体多肽链中的任何一个的一个或多个核酸的至少一个表达载
体，其中核酸可以通过转基因宿主细胞表达，并且经表达的多肽被转基因宿主细胞处理以产生彼此缔合以形成第二类型的二聚体抗原受体(dar)构建体的第一多肽和第二多肽。在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第二群体与药学上可接受的赋形剂混合。
[0314]
在一个实施方式中，用于施用于受试者的第一类型和第二类型的dar表达性转基因宿主细胞的选择可以基于dar t细胞的任何特性，包括例如细胞杀伤能力、开发记忆t细胞的能力、体外扩增能力、体内持久性能力、降低的t细胞耗竭特性和/或低温保存特性。
[0315]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体可以表达包含以下的v1、v2b或v3b二聚体抗原受体(dar)：(i)具有cd28细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v1、v2b或v3b表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第一群体)可以在受试者中诱导强劲且快速的效应子应答，所述应答可以由所选择的dar t细胞的cd28细胞内区介导。
[0316]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第二群体可以表达包含以下的v2a、v3a或v4二聚体抗原受体(dar)：(i)具有4-1bb细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v2a、v3a或v4b表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第二群体)可以在受试者中诱导持久的记忆t细胞群体的开发，所述记忆t细胞群体的开发可以由所选择的dar t细胞的4-1bb细胞内区介导。
[0317]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体或第二群体可以表达包含以下的v2c或v3c二聚体抗原受体(dar)：(i)具有cd28和4-1bb细胞内序列的细胞内区；以及(ii)cd3ζitam 1、2和3或itam 3细胞内序列。在一个实施方式中，v2c或v3c表达性转基因宿主细胞(例如，转基因宿主细胞的第一群体或第二群体)可以在受试者中诱导强劲且快速的效应子应答和持久的记忆t细胞群体的开发的组合，所述组合可以由所选择的dar t细胞的cd28和4-1bb细胞内区介导。
[0318]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体和第二群体可以同时施用于受试者中(例如，同时或基本上同时)。
[0319]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体和第二群体可以按任一顺序循序施用于受试者。
[0320]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的相同剂量或不同剂量可以被施用于受试者。
[0321]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的单一剂量可以被施用于受试者。
[0322]
在一个实施方式中，转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的至少两个剂量可以被施用于受试者。
[0323]
在一个实施方式中，施用于受试者的转基因宿主细胞的第一群体和第二群体的剂量数量可以相同或不同。
[0324]
本公开提供了一种用于治疗患有与肿瘤抗原的有害表达相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，其中病症是癌症，包括但不限于血液乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、食管癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤。
[0325]
在一个实施方式中，癌症是选自下组的血液癌症：非霍奇金淋巴瘤(nhl)、伯基特
淋巴瘤(bl)、b细胞慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)、b细胞和t细胞急性淋巴细胞性白血病(all)、t细胞淋巴瘤(tcl)、急性骨髓性白血病(aml)、毛细胞白血病(hcl)、霍奇金淋巴瘤(hl)、慢性骨髓性白血病(cml)和多发性骨髓瘤(mm)。在一些实施方式中，癌症是bcma阳性癌症，如bcma阳性血液癌症，例如bcma阳性b细胞血液癌症(例如，淋巴瘤(如nhl)、白血病(如cll)或骨髓瘤)。
[0326]
实施例
[0327]
以下实施例旨在是说明性并且可以用于进一步理解本公开的实施方式并且不应被解释为以任何方式限制本发明教导的范围。
[0328]
实施例1：人pbmc细胞和原代t细胞的分离
[0329]
从来自血沉棕黄层(圣地亚哥血库(san diego blood bank))、新鲜血液或白细胞单采产物(干细胞技术公司(stemcell))的健康人供体中分离原代人t细胞。通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(pbmc)。
[0330]
供体1细胞的制备：根据制造商的说明书，通过使用easysep人t细胞分离试剂盒(来自干细胞技术公司，目录号17951)利用磁阴性选择或通过dynabeads人t扩增器cd3/cd28(来自赛默飞世尔科技公司，目录号11141d)利用阳性选择和活化从pbmc中分离t细胞。使用编码bcma car或dar的核酸引入供体1细胞以产生表达car或dar构建体的转基因t细胞。转基因细胞用于测定以产生图5a-11中呈现的数据。
[0331]
供体2细胞的制备：为了耗竭单核细胞，将pbmc平板接种于细胞培养物涂覆的烧瓶中一个到两个小时。根据制造商的说明书，从烧瓶中洗出不黏附的淋巴细胞并在新烧瓶中用t细胞transact(来自美天旎公司，目录号130-111-160)活化。使用编码bcma car或dar的核酸引入供体2细胞以产生表达car或dar构建体的转基因t细胞。转基因细胞用于测定以产生图12-15中呈现的数据。
[0332]
实施例2：原代t细胞培养
[0333]
以每毫升106个细胞的密度，在补充有5％cts免疫细胞sr(赛默飞世尔科技公司)和300u/ml il-2(阿地介白素(proleukin))的cts optmizer t细胞扩增sfm中，培养原代t细胞。经分离的t细胞被新鲜刺激或来自冷冻罐中。用t细胞transact(美天旎公司)每毫升3ul/106个细胞活化细胞两到三天。转染后，以300u/ml在具有il-2的介质中培养t细胞。
[0334]
实施例3：car和dar t细胞的制备
[0335]
用编码car构建体或前体dar的核酸引入经活化的t细胞(大约9
×
106个细胞)。下表1中列出了bcma car和bcma dar构建体的命名名称以及其相应的铰链区和细胞内区。
[0336]
表1：
[0337][0338]
转基因car和dar t细胞被新鲜使用或冷藏保存以供未来使用。对于冷藏保存的car和dar t细胞，将细胞重新悬浮于冷冻培养基(70％aim-v培养基，20％fbs和10％dmso)中，转移到无菌离心管中，并在4℃下以1300rpm离心5分钟。去除并丢弃上清液。通过向1
×
108个细胞中加入2ml冷冻介质来快速重新悬浮细胞团粒。将细胞在-80℃下冷冻过夜。将细胞转移到-150℃，通常在1-2个月内。
[0339]
为了解冻细胞，将细胞从-150℃冷冻库中取出并且保持在37℃的水浴中直到解冻为止。将经解冻的细胞转移到具有50ml dpbs的无菌离心管中，并以1300rpm离心5分钟。去除并丢弃上清液。添加新鲜dpbs以重新悬浮细胞。对细胞进行计数。按需调整细胞浓度并且通过30um细胞过滤器进行过滤。将细胞置于冰上直到使用为止。car和dar t细胞已经在-80℃下储存长达两个月，或在-150℃下储存长达四到六个月，并且仍然表现出优异的体外和体内肿瘤杀伤能力。
[0340]
实施例4：肿瘤细胞系
[0341]
从atcc获得多发性骨髓瘤细胞系rpmi 8226并且使用携带荧光素酶和gfp基因的慢病毒进行转导。选择具有荧光素酶和gfp表达的单细胞克隆(rpmi8226-fluc)。通过转导带有携带rpe基因的慢病毒的k562细胞来类似地制备k562/rpe细胞。在补充有10％胎牛血清(西格玛公司(sigma))的rpmi1640培养基(atcc)中培养两种细胞系。
[0342]
实施例5：dar表达性t细胞的转染效率和表达水平
[0343]
使用流式细胞术，比较来自转基因t细胞的抗bcma嵌合抗原受体(car)或抗bcma二聚体抗原受体(dar)的转染水平和表达水平。
[0344]
表达各种bcma(bb2121或2c5)car或dar构建体的转基因t细胞(供体1)的转染效率彼此相似(图5a和b，在第11天；图37，在第13天)。表达bcma-2c5 car(83
×
)的细胞的细胞扩增水平几乎是表达bcma-bb2121 car(42
×
)的细胞的细胞扩增水平的两倍。与表达bcma-2c5 dar v2c(57
×
)和v3a(56
×
)的细胞相比，表达bcma-2c5dar v3b(72
×
)的细胞的细胞扩增水平更高(图5b)。表达bcma bb2121 dar的转基因t细胞的转染效率低于10％(数据未示出)。
[0345]
表达bcma-2c5 car或dar构建体的转基因t细胞(供体2)的转染效率各不相同，其中与表达bcma-2c5 v2a(27％)或v3a(17％)的t细胞相比，表达bcma-2c5 car的t细胞表现出更高的效率(62％)。与表达bcma-2c5 dar v2c(15
×
)或v3a(49
×
)的细胞相比，表达
bcma-2c5 car(72
×
)的细胞的细胞扩增水平更高(图12)。
[0346]
实施例6：体外细胞毒性测定
[0347]
在制备car、dar和对照t细胞后两到三周，用il-2使细胞经受营养饥饿过夜。将细胞与bcma阳性rpmi-8226/gfp细胞或bcma阴性k562/rpe细胞的靶细胞混合物共培养。效应子与靶细胞的比率范围为0.16:1到5:1。在温育过夜后，对细胞进行流式细胞术以测量gfp细胞群体以确定抗bcma car或dar t细胞的特异性靶细胞杀伤。
[0348]
与bcma-2c5 dar v3b(e系)、dar v3a(d系)和dar v3a(b系)相比，表达bcma-2c5 car(f系)的转基因细胞(供体1)表现出更高水平的细胞杀伤。与bcma-2c5 dar v3a(b系)相比，表达bcma bb2121 car(c系)的转基因细胞表现出更高水平的细胞杀伤(图6)。
[0349]
与表达bcma-2c5 dar v3a(c系)或car(b系)的细胞相比，表达bcma-2c5 dar v2a(d系)的转基因细胞(供体2)表现出更高水平的细胞杀伤(图13)。还参见图40。
[0350]
实施例7：体外细胞因子分泌测定
[0351]
在制备car、dar和对照t细胞后两到三周，用il-2使细胞经受营养饥饿过夜。将细胞与bcma阴性k562、或bcma阳性u266或rpmi8226细胞共培养。效应子与靶标的比率为2:1。根据制造商的说明书，温育40小时后，离心细胞以收集上清液以便检测细胞因子ifn-γ(elisa max delux set，来自生物传奇公司(biolegend)，目录号430104)或gm-csf(来自英杰公司(invitrogen)/赛默飞世尔科技公司的人gm-csf未涂覆的elisa试剂盒，目录号88-8337)。
[0352]
图7a中的结果表明，与bcma-bb2121 car、bcma-2c5 car或bcma-2c5 dar v2c相比，表达bcma-2c5 dar v3a或v3b的t细胞(供体1)在与rpmi8226细胞共培养时分泌更高水平的ifn-γ。
[0353]
图7b中的结果表明，与bcma-bb2121 car、bcma-2c5 car或bcma-2c5 dar v2c相比，表达bcma-2c5 dar v3a或v3b的t细胞(供体1)在与rpmi8226细胞共培养时分泌更高水平的gm-csf。
[0354]
实施例8：经共培养的转基因细胞的体外扩增
[0355]
在制备car、dar和对照t细胞后两到三周，用il-2使细胞经受营养饥饿过夜。将细胞与bcma阴性k562、或bcma阳性u266或rpmi8226细胞共培养。使用流式细胞术测量细胞扩增的水平。
[0356]
阴性对照细胞示出很少或没有扩增(图8a和10a)。与和k562细胞共培养相比，表达bcma bb2121 car的转基因细胞(供体1)在与rpmi8226或u266细胞共培养时示出更高的扩增水平(图8b和10b)。表达bcma-2c5 car的转基因细胞在与rpmi8226、u266和k562细胞共培养时出乎意料地示出高水平的扩增(图8c)，这表明了非特异性反应。与和k562细胞共培养相比，表达bcma-2c5 dar v2c的转基因细胞在与rpmi8226或u266细胞共培养时示出更高的扩增水平(图8d)。
[0357]
图9的条形图中示出了图8a-d中共培养的转基因细胞的细胞扩增的变化倍数。与表达bcma-2c5 dar v2a的转基因细胞相比，表达bcma bb2121 car的转基因细胞(供体1)在与rpmi8226或u266细胞共培养时具有更高的细胞扩增变化倍数。表达bcma-2c5 car的转基因细胞在细胞扩增中具有非常低的变化倍数。
[0358]
与和k562细胞共培养相比，表达bcma-2c5 dar v2c的转基因细胞(供体1)在与
rpmi8226或u266细胞共培养时示出更高的扩增水平(图10c和44b)。与和k562细胞共培养相比，表达bcma-2c5 dar v2a(图44a)、或bcma-2c5 dar v3a(图10d)或bcma-2c5 dar v3b(图10e)的转基因细胞在与rpmi8226或u266细胞共培养时示出甚至更高的扩增水平。
[0359]
图11的条形图中示出了图10a-e中共培养的转基因细胞的细胞扩增的变化倍数。与表达bcma-2c5 dar v2c、v3a和v3b的转基因细胞相比，表达bcma bb2121 car的转基因细胞(供体1)在与rpmi8226细胞共培养时具有更高的细胞扩增变化倍数。与表达bcma bb2121 car、或bcma-2c5 dar v2c或dar v3b的转基因细胞相比，表达bcma-2c5 dar v3a的转基因细胞在与u266细胞共培养时具有更高的细胞扩增变化倍数。
[0360]
阴性对照细胞(tcr-阴性和atc)在与k562、rpmi8226或raji细胞共培养时示出很少或没有扩增(图14a和b)。表达bcma-2c5 car的转基因细胞(供体2)在与k562、rpmi8226或raji细胞共培养时出乎意料地示出高水平的扩增(图14c)，这表明了非特异性反应。与和k562或rpmi8226细胞共培养相比，表达bcma-2c5 dar v2a的转基因细胞在与raji细胞共培养时示出更高的扩增水平(图14d)。与和k562或rpmi8226细胞共培养相比，表达bcma-2c5 dar v3a的转基因细胞在与raji细胞共培养时示出更高的扩增水平(图14e)。
[0361]
图15的条形图中示出了图14a-e中共培养的转基因细胞的细胞扩增的变化倍数。与和k562或rpmi8226细胞共培养时表达bcma-2c5 dar v2a和v3a的转基因细胞相比，表达bcma-2c5 dar v2a和v3a的转基因细胞(供体2)在与raji细胞共培养时具有相似的更高细胞扩增变化倍数。
[0362]
实施例9：定向记忆t细胞和中枢记忆t细胞
[0363]
用dpbs 5％人血清白蛋白洗涤抗bcma-2c5 dar t细胞(来自供体2的细胞)，然后在4℃下用抗cd3-bv421抗体(sk7，生物传奇公司)和pe或apc缀合的bcma-fc蛋白(嵌合基因实验室(chimerigen laboratories))染色30-60分钟。使用ique筛选器plus(英特利赛特公司(intellicyte co))或attune nxt(afc2)(生命技术公司(life technologies))检测cd3和bcma。用于鉴定效应子记忆t细胞和t细胞的中枢记忆片段的标志物是cd45ro(生物传奇公司)和ccr7(生物传奇公司)。中枢记忆t细胞为cd45ro和ccr7双阳性群体，并且效应子记忆t细胞为cd45ro阳性ccr7阴性群体。图13b示出了结果。
[0364]
实施例10：检测t细胞耗竭标志物
[0365]
用dpbs 5％人血清白蛋白洗涤抗bcma 2c5 dar t细胞或对照t细胞，然后在4℃下用bv421缀合的抗pd1抗体(eh12.2h7或nat105，来自生物传奇公司)和apc/cy7缀合的tim3抗体(来自生物传奇公司的f38-2e2)染色30-60分钟。使用attune nxt(afc2)(生命技术公司)检测pd1和tim3细胞标志物。图13c中示出了结果。
[0366]
实施例11：比较表达三种不同dar构建体之一的转基因t细胞的小鼠模型中的体内肿瘤杀伤
[0367]
在rpmi8226异种移植小鼠模型中测试抗bcma dar t细胞的杀瘤活性。八周龄雌性nsg小鼠用于研究。通过具有荧光素酶和gfp基因的慢病毒载体转染从atcc获得的多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226。选择具有荧光素酶和gfp表达的单个克隆(rpmi8226-fluc)。将总计8
×
106个rpmi8226-fluc细胞悬浮于200μl pbs中，并且然后静脉内注射到每只小鼠的尾静脉中。基于ivis成像的生物发光排除具有非常小或非常大的肿瘤负荷的动物。在研究中选择的动物被随机分配到不同组中。
[0368]
在肿瘤接种后第22天，每只动物通过尾静脉在200μl pbs中施用单剂量的pbs、对照tcr-t细胞或工程化抗bcma dar t细胞(来自供体1的t细胞)。下表2中列出了所施用的剂量。
[0369]
表2：
[0370]
组：组大小：处理：剂量/途径：110pbs
‑‑‑
/静脉内210tcr-2.5
×
107个dar+细胞/静脉内310bcma-2c5 dar v2c2
×
106个dar+细胞/静脉内410bcma-2c5 dar v3b4
×
106个dar+细胞/静脉内510bcma-2c5 dar v3a4
×
106个dar+细胞/静脉内
[0371]
在肿瘤细胞接种后，通过每周在每只小鼠的背侧用ivis lumina iii体内成像系统(珀金埃尔默健康科学公司(perkin elmer health sciences，inc))测量总光子通量来监测肿瘤生长。在肿瘤接种后第1周，与用tcr-t细胞或pbs处理的小鼠相比，用表达bcma-2c5 dar v2c、v3b或v3a构建体的t细胞处理的小鼠表现出显著降低的肿瘤负荷(图18a)。图18b是示出与图18a所示的发光数据相对应的生物发光信号通量(求每组小鼠的平均值)的图表。图18c是列出与图18a所示的发光数据相对应的肿瘤生长抑制指数的表格。
[0372]
外周血液facs分析：
[0373]
在施用剂量后第1天从每只动物收集血液样品并且此后每周收集一次。从小鼠尾静脉获得40ul血液样品。对来自血液样品的细胞进行染色，并且通过流式细胞术分析cd45阳性细胞(图18d)、bcma dar阳性细胞(图18e)、cd3阴性细胞(图18f)和cd3阳性细胞(图18g)的百分比和总数。还确定了动物存活率(图18h)。
[0374]
实施例12：比较三种不同剂量的表达v3a dar构建体的转基因t细胞的小鼠模型中的体内肿瘤杀伤
[0375]
在rpmi8226异种移植小鼠模型中测试三种不同剂量的表达dar bcma-2c5 v3a构建体的抗bcma dar t细胞的杀瘤活性。使用八周龄雌性nsg小鼠用于研究。通过具有荧光素酶和gfp基因的慢病毒载体转染从atcc获得的多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226。选择具有荧光素酶和gfp表达的单个克隆(rpmi8226-fluc)。将总计8
×
106个rpmi8226-fluc细胞悬浮于200μl pbs中，并且然后静脉内注射到每只小鼠的尾静脉中。基于ivis成像的生物发光排除具有非常小或非常大的肿瘤负荷的动物。在研究中选择的动物被随机分配到不同组中。
[0376]
在肿瘤接种后第22天，每只动物通过尾静脉在200μl pbs中施用单剂量pbs、对照tcr-t细胞或三种剂量的表达dar bcma-2c5 v3a构建体的工程化抗bcma dar t细胞中的一种剂量。下表3中列出了所施用的剂量。
[0377]
表3：
[0378][0379]
在肿瘤细胞接种后，通过每周在每只小鼠的背侧用ivis lumina iii体内成像系统(珀金埃尔默健康科学公司)测量总光子通量来监测肿瘤生长。在肿瘤接种后第1周和第2周，与使用中等和较低剂量(1.2
×
106或2.4
×
105个)表达bcma-2c5 dar v3a构建体的t细胞处理的小鼠相比，用表达bcma-2c5 dar v3a构建体的最高剂量(6
×
106个)t细胞处理的小鼠表现出显著降低的肿瘤负荷(图19a)。图19b是示出与图19a所示的发光数据相对应的生物发光信号通量(求每组小鼠的平均值)的图表。图19c是列出与图19a所示的发光数据相对应的肿瘤生长抑制指数的表格。
[0380]
外周血液facs分析：
[0381]
在施用剂量后第1天从每只动物收集血液样品并且此后每周收集一次。从小鼠尾静脉获得40ul血液样品。对来自血液样品的细胞进行染色，并且通过流式细胞术分析cd45阳性细胞(图19d)、bcma dar阳性细胞(图19e)、cd3阴性细胞(图19f)和cd3阳性细胞(图19g)的百分比和总数。还确定了动物存活率(图19h)。
[0382]
实施例13：体内肿瘤重新激发研究
[0383]
用于上述实施例12中描述的剂量研究的小鼠用于肿瘤重新激发研究。在用dar t细胞(v3a)处理的每组小鼠中，一半施用200ul pbs，并且另一半通过施用200ul中1
×
107rpmi8226-fluc重新激发。在此重新激发研究中，没有一只小鼠接受第二剂量的dar t细胞(v3a)。
[0384]
通过每周在每只小鼠背侧用ivis lumina iii体内成像系统(珀金埃尔默健康科学公司)测量总光子通量7周来监测肿瘤生长和再生长。图20a的顶部示出了在肿瘤重新激发研究开始之前第12周小鼠的生物发光图像。对于每个剂量组，图20a中示出了经受pbs或肿瘤重新激发研究的小鼠的图像。在经受肿瘤重新激发的最高给药小鼠(6
×
106dar t细胞v3a)中未检测到肿瘤生长(图20a)。在经受肿瘤重新激发的四只中等给药的小鼠(1.2
×
106)中检测到肿瘤生长和再生长，并且一只小鼠没有表现出肿瘤生长(由实心黑色三角形表示)(图20a)。在经受肿瘤重新激发的四只最低给药的小鼠(2.4
×
105)中检测到肿瘤生长和再生长(这些小鼠中的三只小鼠死亡)，并且一只小鼠没有表现出肿瘤生长(由实心黑色三角形表示)(图20a)。
[0385]
外周血液facs分析：
[0386]
在施用剂量后第1天从每只动物收集血液样品并且此后每周收集一次。从小鼠尾静脉获得40ul血液样品。对来自血液样品的细胞进行染色，并且通过流式细胞术分析cd45阳性细胞(图20b)和bcma dar阳性细胞(图20c)的百分比和总数。