多价HVT载体疫苗的制作方法

96/005291。然而，此类出版物中描述的大多数多基因构建体仅是建议性的，实际上仅一些具有多个插入物的重组载体被构建和分离。很少的载体在鸟类上进行过测试。总的来说，没有给出关于它们在复制时的稳定性或外源基因的表达水平的结果，更不用说在目标动物中诱导有效免疫保护的任何数据了。正是由于这些对插入物的遗传稳定性和持续表达的挑战，只有极少数的多价hvt载体构建体实际上使其成为许可和商业上可用的疫苗产品。目前有：nd-ibd(msd animal health；wo 2016/102647)、nd-ilt((msd animal health；wo 2013/057236)、ultifend
tm
ibd nd(ceva sant
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animale；wo 2013/144355)和hvt+ibd+nd(boehringer-ingelheim；wo 2018/112.051)。此外，wo 2019/072964描述了一种多价rhvt载体疫苗，其能够预防mdv、ndv、ibdv和iltv。
8.然而，由于有许多更突出的家禽疾病需要有效的疫苗接种，因此需要更多的多价载体疫苗。
9.wo 1999/018215描述了具有插入的ndv-f或hn基因和ibdv-vp2基因的多价hvt载体构建体。描述了几个可能的插入位点，其中在hvt的ul40和ul41基因之间。然而，实际制造的唯一重组hvt(rhvt)构建体在hvt基因ul44和ul45之间或ul45和ul46之间具有插入片段。没有提供关于所描述的任何载体的遗传稳定性的数据。
10.wo 2012/052384描述了表达aiv ha基因的rhvt，该基因由来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白b(gb)基因启动子驱动，来自独特的小(us)基因组区域中的基因座。
11.wo 2016/102647描述了一种多价rhvt，它从插入us基因组区域的单一表达盒表达ndv f基因和ibdv vp2基因。
12.本发明的一个目的是适应该领域的这种需要，并首次提供一种rhvt载体疫苗，该疫苗可通过一次疫苗接种使家禽针对4种禽病原体进行免疫：mdv、ndv、ibdv和aiv。


技术实现要素：

13.令人惊讶地发现，通过提供从其us基因组区域表达ndv f和ibdv vp2基因以及从其ul基因组区域表达aiv ha基因的rhvt，可以满足该目的，并且因此可以克服现有技术的一个或多个缺点。
14.发明人试图在已经包含两个异源基因(ndv f和ibdv vp2，两者均从病毒的us区(“rhvt-vp2-f”)表达)的现有rhvt中扩展异源基因插入的数量。选择的另外的异源基因是aiv ha基因。发明人测试了一系列构建体，其中ha基因被插入到hvt基因组的不同插入位点。不幸的是，他们发现测试的几个插入位点不允许产生稳定的多价重组病毒，因为它们不能产生稳定复制和表达三个插入的异源基因的hvt。例如，将ha基因插入rhvt-vp2-f的ul47和ul48基因之间或ul54和lorf4基因之间的ul基因组区域是不成功的。当在细胞培养中传代16次后进行测试时，这两种构建体都显示出几个斑块，这些斑块已经失去了一个或两个异源基因的表达。这很重要，因为不知道这些基因对hvt是必需的。。事实上，据报道ul47和ul48在hvt基因组的转座子基因敲除研究中是非必需的(hall et al.,2015,virology journal,vol.12,p.130)。
15.显然，亲本载体已经表达了另外两个异源基因的事实使事情复杂到了这样的程度，以至于可以基于现有技术中的观察没法预测关于hvt基因组中额外异源基因的允许插入位点是什么。
16.因此出乎意料的是，hvt ul基因组区域中的另外两个插入位点可用于插入额外的异源基因，即：hvt的ul40和ul41基因之间或hvt的ul44和ul45基因之间；在本文中分别称为“ul40-41”和“ul44-45”基因座。
17.发现所得的在ul40-41或ul44-45基因座中具有ha基因的多价rhvt载体在遗传上是稳定的，即使在体外细胞培养物中连续传代16次后也是如此。第16代病毒随后被用于鸡的疫苗接种，这占了体内进一步的几个复制周期。然后在疫苗接种后第11天和第32天从接种疫苗的鸡中重新分离病毒，并分析其维持插入的基因的表达。从这两个时间点，发现重新分离的病毒在遗传上是完全稳定的：在免疫荧光斑块测定中，研究的所有重新分离的病毒都证明了所有三种异源基因的表达：f、vp2和ha。对于任何一种异源插入物，没有观察到不发荧光的斑块。
18.接种疫苗的鸡对每种表达的抗原：f、vp2和ha均表现出极好的血清转化。针对这三种抗原中的每一种所达到的抗体水平都远高于已知的针对攻击的体内保护所需的水平。实施例中提供了细节。
19.因此，这些新的多价rhvt载体病毒是稳定的，可用作针对mdv、ndv、ibdv和aiv中的一种或多种或全部的疫苗。
20.从一次接种中获得针对4种主要家禽疾病的疫苗的可能性是非常有益的，因为它代表了目标动物的压力的重要减少，以及家禽养殖者的努力和成本的减少。
21.目前尚不清楚表达vp2和f基因的rhvt如何或为什么能够耐受ul40-41或ul44-45插入位点中的额外aiv ha基因，而在其他位点插入，起初看起来是合适的，并没有产生稳定和有效的载体构建体。
22.尽管本发明人不想受任何可能解释这些发现的理论或模型的束缚，但他们假设这种效应是由多价rhvt中各种表达模式的复杂相互作用引起的，而这是在体外和体内复制和表达所必需的。由于未知原因，在特定位点插入额外基因会导致多价rhvt，它在异源基因的表达强度和这对hvt本身的复制能力施加的菌株之间具有恰到好处的平衡，而其他构建体(出乎意料地)没有。
23.因此，在一个方面，本发明涉及一种重组火鸡疱疹病毒(rhvt)，其从第一和第二表达盒表达传染性法氏囊病病毒(ibdv)病毒蛋白2(vp2)基因和新城疫病毒(ndv)融合(f)蛋白基因，所述第一和第二表达盒插入到所述rhvt基因组的独特小(us)区，其特征在于所述rhvt还从第三表达盒表达禽流感病毒(aiv)血凝素(ha)基因，所述第三表达盒插入到所述rhvt基因组的独特长(ul)区中，其在ul40和ul41基因之间，或者在ul44和ul45基因之间。
[0024]“重组体”是核酸分子或微生物，其遗传物质已相对于其起始或天然条件进行了修饰，以产生其最初不具有的遗传构成。
[0025]“火鸡疱疹病毒(hvt)”也称为mdv3、meleagrid疱疹病毒1或火鸡疱疹病毒。hvt于1970年首次被描述(witter et al.,1970,am.j.vet.res.,vol.31,p.525)。众所周知的hvt毒株，如pb1或fc-126，长期以来一直被用作家禽的活疫苗，以对抗由mdv1或mdv2引起的马立克氏病。
[0026]
火鸡疱疹病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和禽流感病毒都是众所周知的兽医相关病毒。这同样适用于巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、猫疱疹病毒(fhv)和伪狂犬病病毒(prv)。这种病毒具有其分类群的特征，例如形态学、基因组和生化特征，以及诸
如生理学、免疫学或病理学行为等生物学特征。
[0027]
可获取有关这些病毒的一般信息，例如来自参考手册，例如fields virology(lww publ.,isbn:9781451105636)。可获取由这些病毒引起的疾病的信息，例如来自手册，例如：“默克兽医手册”(2010,10th ed.,2010,c.m.kahn edt.,isbn:091191093x)，以及：“家禽疾病”(2008,12th ed.,y.saif ed.,iowa state univ.press,isbn-10:0813807182)。用于本发明的这些病毒的样品可以从多种来源获得，例如作为从人类、野外或农场中的非人类动物、或来自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学的现场分离物。使用常规的血清学或分子生物学工具可以很容易地识别病毒。从所有这些病毒中，许多遗传信息都可以在公共序列数据库中以数字方式获得，例如ncbl的genbank和embl的ebi。
[0028]
如本领域已知的，特定分类群中微生物的分类基于其特征的组合。因此，本发明还包括病毒物种中的变体，其以任何方式从其亚分类，例如亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚群等。
[0029]
此外，对于本发明领域的技术人员来说显而易见的是，虽然用于本发明的特定病毒目前可能被分配给该物种，但这是一种分类学分类，随着新的见解可能导致重新分类为一个新的或不同的分类群。然而，由于这不会改变病毒本身或其抗原库，而只会改变它的学名或分类，因此这种重新分类的病毒仍然在本发明的范围内。
[0030]“vp2蛋白基因”是众所周知的，它编码ibdv的衣壳蛋白。vp2蛋白基因可以来自经典型ibdv或变体型ibdv，或者可以是嵌合的。
[0031]
类似地，“f蛋白基因”在本领域是众所周知的，它编码ndv的免疫优势融合糖蛋白。对于本发明，f蛋白基因可以从慢毒型(lentogenic)、中型型(mesogenic)或速速型(velogenic)ndv获得，或者可以是嵌合的。
[0032]
术语“表达”是指众所周知的基因表达原理，其中遗传信息通过转录和翻译为蛋白质的生产提供密码。
[0033]
术语“基因”用于表示能够编码蛋白质的一段核酸。对于本发明，这对应于“开放阅读框”(orf)，即起始密码子和终止密码子之间的一段dna，不包括基因的启动子。本发明的基因可以编码完整的蛋白质，或者可以编码蛋白质的一部分，例如仅编码蛋白质的成熟形式，即没有“前导序列”、“锚定序列”或“信号序列”。基因甚至可以编码蛋白质的特定部分，例如包含免疫保护表位的部分。
[0034]
在这方面，本发明的“蛋白质”是氨基酸的分子链。蛋白质可以是天然的或成熟的蛋白质、前蛋白质或前蛋白质、或蛋白质的功能片段。因此，肽、寡肽和多肽包括在蛋白质的定义内，只要它们仍然包含相关的免疫表位和/或功能区。
[0035]
对于本发明，如果该基因不存在于用于产生rhvt载体的亲本hvt中，则该基因对于携带它的rhvt载体是“异源的”。
[0036]“表达盒”是包含至少一个异源基因和驱动该基因转录的启动子的核酸片段。转录的终止可以由盒的基因组插入位点提供的序列提供，或者表达盒本身可以包含终止信号，例如转录终止子。
[0037]
在这样的盒中，启动子和终止子都需要靠近它们调节表达的基因；这被称为“可操作地连接”，即它们之间不存在重要的其他序列，这些序列会干预转录的有效开始或终止。
[0038]
虽然表达盒可以以dna或rna形式存在，但由于其预期用于hvt载体，因此本发明的
表达盒用作dna。如对技术人员显而易见的，表达盒是自包含的表达模块，因此其在载体病毒基因组中的方向通常不是关键的。
[0039]
任选地，表达盒可以包含另外的dna元件，例如帮助构建和克隆，如限制酶识别位点或pcr引物。
[0040]
一个表达盒作为一个整体被插入到载体基因组中的一个基因座中。不同的技术可用于控制该插入的位点和方向。例如，通过使用来自载体基因组的适当侧翼部分，通过同源重组过程整合盒，例如通过使用如us 5,961,982中所述的重叠粘粒。或者，可以通过使用如下所述的crispr/cas9技术来完成整合。
[0041]
对于本发明，载体基因组中的“插入”或“插入的”表达盒是指整合到载体的基因组核酸中，使得插入的元件与载体的天然基因一起被转录和翻译。对载体基因组的影响取决于插入的方式：载体基因组的大小可能变大、相同或变小，取决于基因组的最终结果是分别增加、替换还是删除遗传物质。本领域技术人员完全能够选择和实施某种类型的插入，并在需要时进行调整。
[0042]
表达盒的构建及其插入hvt载体可以通过众所周知的分子生物学技术完成，包括克隆、转染、重组、选择和扩增。sambrook&russell等标准教科书对这些技术和其他技术进行了详细解释：“分子克隆：实验室手册”(2001，cold spring harbour laboratory press；isbn：0879695773)；ausubel等人，在：current protocols in molecular biology(j.wiley and sons inc,ny,2003,isbn:047150338x)；和c.dieffenbach&g.dveksler：“pcr引物：实验室手册”(cshl press，isbn 0879696540)；和“pcr方案”，作者：j.bartlett和d.stirling(humana press，isbn：0896036421)。
[0043]
对于本发明，关于表达盒的术语“第一”、“第二”和“第三”仅用于方便参考，并不表示任何顺序或偏好。
[0044]
众所周知，hvt基因组的“独特的小(us)区域”是基因组的下游部分，介于“内部重复短”和“末端重复短”之间。hvt us大小约为8.6kb(参见：kingham et al.,2001,j.of gen.virol.,vol.82,p.1123
–
1135)。
[0045]
众所周知的hvt菌株fc-126的完全注释的基因组序列例如可作为genbank登录号：af291866获得，其中核苷酸5910-117777是ul区域，核苷酸136990-145606是us区域。
[0046]“血凝素(ha)蛋白基因”编码aiv主要抗原。ha蛋白可以是任何一种已知的血清型变体，目前是：h1-h18，或者可以是嵌合体。高致病性aiv具有h5或h7血清型的ha。
[0047]
hvt基因组的“独特长(ul)”区域是基因组的上游部分，在hvt中大小约为110kb。
[0048]
标记“ul40”在本发明领域中是众所周知的，指的是位于ul基因组区域中的特定基因，参见例如genbank登录号：af291866。对于“ul41”、“ul44”、“ul45”的表示也同样(比照)。
[0049]
术语“之间”用于表示插入的表达盒位于hvt基因组上的插入位点(即基因座)中，该位点位于所示基因的编码序列之外，因此不在ul40、41、44或45的开放阅读框中。这样的区域也称为基因间区域。
[0050]
本发明的实施方式和其他方面的细节将在下面描述。
[0051]
优选地，表达ibdv vp2基因的盒具有特定元件。
[0052]
在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于ibdv vp2基因从第一表达盒表达，所述第一表达盒在5'至3'方向并且以此顺序包含：
[0053]
a.鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mcmv-ie1)启动子，
[0054]
b.ibdv vp2基因，和
[0055]
c.转录终止子，
[0056]
并且由此所述表达盒的启动子和终止子可操作地连接到vp2基因。
[0057]
如本文所用，术语“包含/包括(comprising)”(以及如“包含(comprises)”、“包含(comprise)”和“包含(comprised)”的变体)意在指代被使用该术语的正文部分、段落、权利要求等所涵盖或包括在本发明中的任何可能组合的所有元素，即使这些元素或组合没有明确记载；并且不排除任何此类元素或组合。
[0058]
因此，任何这样的文本部分、段落、权利要求等也可以因此涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含”(或其变体)被诸如“由
……
组成”、“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”等术语代替。
[0059]
术语“5’至3’方向”，也称为：“下游方向”，在本领域广为人知。与术语“以此顺序”一起，它用于指示随后汇总的元素彼此之间需要具有的相对方向，以便与宿主细胞的基因表达机制一起发挥作用，在其中可以复制和表达根据本发明的包含表达盒的rhvt。如本领域技术人员将意识到的，该方向涉及来自作为“编码链”的hvt双链dna基因组的dna链，并且它涉及处于“+”或“有义”方向的编码mrna分子。
[0060]
尽管如此，在不影响上述部分的情况下：在hvt ds dna基因组的互补链“模板”链上，所列元素的相对顺序是相同的，但在该dna链上，这些元素的方向是3'到5'。
[0061]
众所周知，本发明的“启动子”是指导下游编码区转录的遗传信息功能区。因此启动子位于基因的上游。
[0062]
启动子的命名通常基于其控制表达的基因。例如，如本文所用的术语“mcmv-ie1基因启动子”是指本质上驱动来自mcmv的ie1基因表达的启动子，因此位于mcmv基因组中该基因的紧邻上游。因为ie1基因是这样一个被充分记录和清楚识别的基因，并且因为几个mcmv的基因组已经被测序，所以这种启动子可以很容易地通过常规技术识别。例如，在基本方案中，可以通过粗略地亚克隆两个连续基因之间的区域来简单地获得启动子，例如从上游基因的多聚腺苷酸信号到下游基因的转录起始信号。然后可以通过标准测试来识别启动子，例如通过使用含有可疑启动子的核酸区域的逐渐变小的部分来表达标记基因。
[0063]
通常启动子含有许多可识别的调节区域，例如增强子区域，它参与结合影响转录时间、持续时间、条件和水平的调节因子。虽然增强子区域通常位于启动子的上游，但启动子也可能受到更靠近起始密码子的下游区域的影响，这些区域参与转录因子的结合并指导rna聚合酶本身。这样的区域通常包含许多保守的启动子序列元件，例如tata盒、caat盒和gc盒。
[0064]
包含增强子和下游区域的启动子称为“完整”启动子；仅包含下游区域的启动子称为“核心”启动子。
[0065]“转录终止子”是参与终止编码区转录成rna的调控dna元件。通常，这样的元素对具有二级结构的部分进行编码，例如一个发夹，可以导致rna聚合酶复合物停止转录。因此，转录终止子总是位于要翻译的区域的终止密码子的下游，即“3’非翻译区域”。终止子还可以包含多聚腺苷酸化(polya)信号。这会诱导大多数真核mrna发生的多聚腺苷酸化，这与mrna分子的运输和稳定性有关。
[0066]
mcmv-ie1-基因在本领域是众所周知的，并且可以容易地从各种商业来源获得，例如从用于克隆和表达的商业质粒的供应商处获得。ie1基因也被称为cmv的“主要ie基因”。
[0067]
mcmv-ie1蛋白也称为pp89。mcmv ie1基因启动子在1985年被描述(k.et al.,1985,pnas,vol.82,p.8325)。wo 87/03.905和ep 728.842中描述了该启动子在异源表达中的用途。完整的mcmv ie基因座的核苷酸序列可从genbank的acc.nr.l06816.1(从2004年3月开始)。mcmv本身可在atcc的acc.nr.vr-1399下获取。
[0068]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第一表达盒中，mcmv-ie1基因启动子是完整启动子，包含核心启动子区域以及mcmv-ie1基因的增强子区域。完整mcmv-ie1基因启动子大小约为1.4kb。
[0069]
本发明的术语“约”是指在指示值附近
±
25％，优选地，“约”是指在指示值附近
±
20、15、12、10、8、6、5、4、3、2％，或甚至“约”是指按优先顺序在指示值附近
±
1％。
[0070]
在一个实施方式中，本发明的mcmv-ie1基因启动子是约1.4kb的dna分子，包含与seq id no：1的核苷酸1-1391的全长区域具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是核苷酸序列同一性至少为96、97、98或甚至99％，按该优先顺序。
[0071]
在一个实施方式中，mcmv-ie1基因启动子是seq id no:1的核苷酸1-1391的区域。
[0072]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第一表达盒中，用于本发明的ibdv vp2基因编码来自ibdv的经典类型的vp2蛋白。这样的基因是众所周知的并且它们的序列信息在现有技术中是容易获得的，参见例如genbank acc.nr：d00869(品系f52/70)、d00499(stc)或af499929(d78)。或者，该基因可以从自然分离的经典ibdv的基因组中获得，使用常规技术操作birnavirus。使用血清学或分子生物学可以很容易地识别经典型ibdv。
[0073]
由于ibdv vp2基因的同源物或变体可以具有相同的功效和稳定性，因此在一个实施方式中，本发明的ibdv vp2蛋白基因与seq id no：1的全长核苷酸1423-2781的区域具有至少90％的核苷酸序列同一性。优选的是核苷酸序列同一性至少为92、94、95、96、97、98或甚至99％，以该优先顺序。
[0074]
在一个实施方式中，本发明的ibdv vp2蛋白基因来源于经典的ibdv株faragher 52/70。
[0075]
在一个实施方式中，本发明的ibdv vp2蛋白基因是seq id no:1的核苷酸1423-2781的区域。
[0076]
对于本发明的表达盒，选择特定类型的转录终止子并不重要，只要提供rna转录的有效终止即可。
[0077]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，本发明的第一、第二和/或第三表达盒包含转录终止子，该转录终止子包含终止子区域和polya区域。
[0078]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第一表达盒中，转录终止子来自猿猴病毒40(sv40)，优选来自sv40晚期基因。
[0079]
自1980年代后期以来，该终止子及其在异源表达中的用途可通过商业“pcmvβ”克隆质粒(clontech)获得。
[0080]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第一表达盒中，转录终止子源自sv40晚期基因，大小约为0.2kb，并且包含与seq id no：1的核苷酸2812-3021的区域的全长具有至少95％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷
酸序列同一性，以该优先顺序。
[0081]
在一个实施方式中，来自sv40晚期基因的转录终止子是seq id no:1的核苷酸2812-3021的区域。
[0082]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，对于第一表达盒，适用的一个或多个或所有条件选自由以下组成的组：
[0083]-mcmv-ie1基因启动子是完整启动子；
[0084]-ibdv vp2基因编码来自经典型ibdv的vp2蛋白；和
[0085]-第一转录终止子包含终止子区域和polya区域；优选地，转录终止子来源于sv40。
[0086]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，第一表达盒是seq id no：1的核苷酸1-3021的区域。
[0087]
优选地，表达ndv f基因的盒具有特定元件。
[0088]
在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于ndv f基因从第二表达盒表达，该表达盒在5'至3'方向并且以此顺序包含：
[0089]
a.人类巨细胞病毒立即早期1基因(hcmv-ie1)启动子，
[0090]
b.ndv f蛋白基因，和
[0091]
c.转录终止子，
[0092]
并且由此所述表达盒的启动子和终止子可操作地连接到f基因。
[0093]
完整版本的hcmv-ie1基因启动子大小约为1.5kb，由增强子、核心启动子和内含子组成，启动子活性由此进入内含子区域，参见koedood et al.(1995,j.of virol.,vol.69,p.2194-2207)。
[0094]
通过使用常规分子生物学工具和方法，亚克隆ie1基因之前的基因组区域，可以从hcmv病毒(广泛可用)的基因组中获得hcmv-ie1基因启动子。或者，启动子可以来自例如商业表达质粒，例如由cox等人描述的pi17。(2002,scand.j.immunol.,vol.55,p.14-23)，或来自可商购的哺乳动物表达载体，例如pcmv(clontech)，或pcmv-mcs系列(stratagene；genbank
tm
acc.nr.af369966)。hcmv的基因组序列例如可从genbank登录号x17403获得。
[0095]
从hcmv-ie1基因启动子，许多高度相似的版本是已知的，例如来自基因银行。这样的同源物和变体在本发明的范围内。
[0096]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第二表达盒中，hcmv-ie1基因启动子是核心启动子。核心启动子的大小通常小于1kb；优选地约0.4kb的大小。
[0097]
在一个实施方式中，本发明的hcmv-ie1基因核心启动子是约0.4kb的dna分子，其包含与seq id no:1的全长核苷酸3160-3520序列具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是核苷酸序列同一性至少为96、97、98或甚至99％，按照此优先顺序。
[0098]
在一个实施方式中，hcmv-ie1基因核心启动子是seq id no:1的核苷酸3160-3520的区域。
[0099]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第二个表达盒中，ndv f蛋白基因来自慢毒类型的ndv。
[0100]
优选地，来自慢毒ndv毒株的ndv f蛋白基因来自ndv毒株克隆30。
[0101]
ndv克隆30是众所周知的慢毒型ndv，多年来一直用作活疫苗，例如作为nd clone 30(msd animal health)。
[0102]
在一个实施方式中，本发明的ndv f蛋白基因与seq id no：1的核苷酸3545-5206的全长区域具有至少90％的核苷酸序列同一性。优选地，核苷酸序列同一性为至少92、94,95,96,97,98,甚至99％,按优先顺序排列。
[0103]
在一个实施方式中，本发明的ndv f蛋白基因是seq id no：1的核苷酸3545-5206的区域。
[0104]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第二表达盒中，转录终止子来源于hcmv-ie1基因。优选地，该转录终止子的大小约为0.3kb。
[0105]
在一个实施方式中，转录终止子源自hcmv-ie1基因，大小约为0.3kb，并且包含与seq id no：1的的全长核苷酸5218-5498序列具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是核苷酸序列同一性至少为96、97、98或甚至99％，按照该优先顺序。
[0106]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，源自hcmv-ie1基因的转录终止子是seq id no：1的核苷酸5218-5498的区域。
[0107]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，对于第二表达盒，适用的一个或多个或所有条件选自由以下组成的组：
[0108]-hcmv-ie1基因启动子是核心启动子；
[0109]-ndv f基因来自慢毒ndv毒株，优选来自ndv毒株克隆30；和
[0110]-转录终止子来源于hcmv-ie1基因。
[0111]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，第二表达盒是seq id no:1的核苷酸3160-5498的区域。
[0112]
因为表达盒是自包含的表达模块，如上所述，因此本发明的第一和第二表达盒可以以不同的基因座和不同的方向插入根据本发明的rhvt的us基因组区域。这些基因座可以彼此相同或不同。
[0113]
在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于第一和第二表达盒插入到所述rhvt基因组us区域的相同基因座或不同基因座中。
[0114]
hvt us基因组区域的几个基因座已被证明允许插入一个或多个异源基因，参见例如ep 431.668和wo 2016/102647。例如：us2、us10、us10和sorf3之间的区域、us2和sorf3之间的区域。
[0115]
因此在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于第一和第二表达盒均插入到us2基因，或均插入到us10基因，或一个插入到us2基因，另一个插入到us10基因。
[0116]
这种插入的结果是，us2和us10基因的正常编码功能受到干扰，甚至在产生的rhvt中完全消失。
[0117]
为了便于组装根据本发明的rhvt，本发明的第一和第二表达盒可以组合成一个单一表达盒。这可以方便地插入到hvt us基因组区域的基因座中。
[0118]
因此，在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于第一和第二表达盒组合成单一表达盒。
[0119]
因为本发明的第一和第二盒包含它们自己的启动子和终止子元件，因此当在本发明的组合的单一表达盒中时，它们可以以不同的方式相对于彼此定向。具体来说，这些方向可以是：“头对头”、“尾对尾”，以及“尾对头”的2个方向；在本发明领域中都是众所周知的。
[0120]
在根据本发明的rhvt的一个优选实施方式中，具有第一和第二表达盒组合成单一
表达盒，第一和第二表达盒是尾对头定向的，由此vp2基因位于f基因的上游。
[0121]
在一个更优选的实施方式中，组合的单一表达盒是如wo2016/102647中公开的表达盒。
[0122]
甚至更优选地，组合的单一表达盒是如在wo 2016/102647中描述为hvp360的rhvt构建体中使用的盒，其可作为nd-ibd(msd animal health)商购获得。
[0123]
因此，在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，组合的单一表达盒在5'至3'方向上并以此顺序包含：
[0124]
a.mcmv-ie1启动子，
[0125]
b.ibdv vp2基因，
[0126]
c.转录终止子，
[0127]
d.hcmv-ie1启动子，
[0128]
e.ndv f蛋白基因，和
[0129]
f.转录终止子，
[0130]
并且由此启动子和终止子可操作地连接至其相应的基因。
[0131]
在本发明的组合的单一表达盒中，在vp2和f基因之间的转录终止子元件c，通过防止可能的rna转录通读，提供了它们表达的有效分离。
[0132]
为组合的单一表达盒指示的两个终止子可以相同，也可以不同。
[0133]
用“启动子和终止子可操作地连接至其相应的基因”表示启动子a和终止子c可操作地连接至基因b上；并且同样：启动子d和终止子f可操作地连接至基因e上。
[0134]
用于本发明的组合的单一表达盒的一个实施例在seq id no:1中给出，其元件被描述在表1中。
[0135]
表1：seq id no:1的元件
[0136][0137]
在一个实施方式中，用于本发明的单一组合的表达盒的大小约为5.5kb。
[0138]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，用于本发明的组合的单一表达盒是约5.5kb的dna分子，包含与seq id no：1的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是核苷酸序列同一性至少为96、97、98或甚至99％，按该优先顺序。
[0139]
在一个实施方式中，本发明的组合的单一表达盒是seq id no:1。
[0140]
正如本领域技术人员从用于本发明的组合的单一表达盒的组成明显看出的那样，在一个较大的盒中具有两个异源基因，其被设计并旨在插入到载体病毒基因组中的单个位置中。
[0141]
在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于本发明所定义的组合的单一表达盒被插入到所述rhvt基因组的us区，在us2基因中或在us10基因中。
[0142]
通过使用hvt基因组的us2基因作为组合的单一表达盒的遗传插入基因座，可以制备用于本发明的稳定和有效的rhvt载体。
[0143]
在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于如为本发明所定义的组合的单一表达盒被插入到us2基因中。
[0144]
为了便于本发明表达盒的方便构建、操作和使用，其本身可以包含在dna分子中，如允许克隆或转染的载体，例如如质粒、粘粒、杆粒等，参见wo 93/25.665和ep 996.738。常见的克隆质粒的例子有，例如pbr322或puc系列的质粒。这些是可广泛商购的。
[0145]
包含表达盒的质粒通常称为“转移载体”、“穿梭载体”或“供体质粒”。在这种情况下，质粒包含一个表达盒，其侧翼序列区域来自载体基因组的目标插入基因座，以指导插入。
[0146]
通常，用于转染的转移载体本身并不整合到载体的基因组中，它仅促进其携带的表达盒的整合，例如通过允许插入通过同源重组发生。
[0147]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，第三表达盒中的aiv ha基因由来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白b(gb)基因的启动子驱动。
[0148]
因此，在一个实施方式中，根据本发明的rhvt的特征在于aiv ha基因从第三表达盒中表达，所述第三表达盒在5'至3'方向上并且以此顺序包含：
[0149]
a.来自哺乳动物疱疹病毒的糖蛋白b(gb)基因启动子，
[0150]
b.aiv ha蛋白基因，和
[0151]
c.转录终止子，
[0152]
并且由此所述表达盒的启动子和终止子可操作地连接至ha基因。
[0153]“来自哺乳动物疱疹病毒的gb基因启动子”是指驱动疱疹病毒gb基因表达的启动子，并且在哺乳动物疱疹病毒基因组中位于该gb基因的最近上游。正常疱疹病毒复制中的gb蛋白参与细胞进入和细胞传播。因为gb基因是这样一个被充分记录和清楚识别的基因，并且因为许多疱疹病毒科的基因组已经被测序(全部或部分)，技术人员可以通过常规技术容易地鉴定和获得这样的启动子。其实施例在wo 2012/052384中公开。
[0154]
疱疹病毒gb蛋白的综述被perreira提出(1994,infect.agents dis.,vol.3,p.9-28)。hsv1 gb基因的启动子被pederson等人详细研究(1992,j.of virol.,vol.66,p.6226-6232)。
[0155]
本发明的“哺乳动物疱疹病毒”涉及通常在哺乳动物物种中感染和复制的疱疹病毒。优选地，这些病毒来自alphaherpesvirinae的分类亚科。例如：人疱疹病毒1(herpes simplex virus1)、牛疱疹病毒1、猫疱疹病毒1、马疱疹病毒1(ehv)或伪狂犬病病毒(prv，又名：suid herpesvirus1)。来自此类哺乳动物疱疹病毒的gb基因启动子有利地用于本发明。
[0156]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第三个表达盒中，来自用于本发明的哺乳动物疱疹病毒的gb基因启动子来自prv，或来自ehv。更优选gb基因启动子来自prv。
[0157]
prv也称为：suid alphaherpesvirus 1，gb基因也称为gii、gp14或ul27。prv gb(gii)基因及其启动子的首次公开是在1990年，在ep 353809中。在wo 2012/052384中描述了使用prv gb启动子驱动hvt载体中的异源基因。
[0158]
此类启动子可以方便地从现有技术中获得，例如从genbank获得，例如：
[0159]-prv，来自genbank acc.nr：bk001744，区域20139-19596(prv gb基因是ul 27或gii)，或
[0160]-ehv，来自genbank acc.nr::ay665713，区域60709-61570(ehv1 gb基因是orf 33)。
[0161]
此外，genbank登录号no.pfam00606方便地代表疱疹病毒gb蛋白簇。
[0162]
为了进一步提高本发明的哺乳动物疱疹病毒的gb基因启动子的功效，同时保持其稳定性，对启动子进行了改造。适应是启动子序列的延伸，因此它现在没有在gb基因起始密码子的a+1之前结束，而是在a+1的下游延伸到通常翻译成蛋白质的gb基因的编码区。
[0163]
结果是扩展的启动子现在包含一个或多个atg密码子，即原始起始密码子和可能的其他蛋氨酸编码三联体。这样的atg密码子，在启动子中tata盒下游的这个位置，可以被rhvt的细胞转录机制解释为起始密码子，导致不希望的翻译过早启动。因此，现在包含在扩展启动子序列中的gb基因启动子的tata框下游的atg密码子通过突变进行修饰，以使这种atg无法作为潜在的起始密码子发挥作用。这允许本发明的gb启动子从天然gb基因起始密码子的下游掺入核苷酸并延伸到gb基因的翻译区，然而这些额外的核苷酸不能被翻译，而是充当延伸的前导序列。
[0164]
因此，构建了包含来自原始起始密码子下游的gb编码区的核苷酸的gb基因启动子序列。
[0165]
因此，在一个更优选的实施方式中，来自哺乳动物疱疹病毒的gb基因启动子包含来自所述gb基因翻译区的核苷酸序列，其中任何atg核苷酸序列被改变。
[0166]
本发明的扩展prvgb基因启动子中atg核苷酸序列的“改变”优选通过突变进行。atg核苷酸序列原则上可以改变为任何其他三联体，只要这不会降低复制的稳定性或载体构建体的表达。
[0167]
优选地，改变是通过单个核苷酸，优选地从atg到ttg。
[0168]
因此，为了提高其功效，用于本发明的prv gb基因启动子可以包含延伸到天然prv gb基因起始密码子下游的核苷酸序列。在这种情况下，为了防止错误开始，prv gb的那个区域中的任何atg密码子都发生了突变。优选地，prv gb基因启动子在a+1之后延伸129nt。
[0169]
包含在用于本发明的扩展的gb启动子中的atg下游的核苷酸数量是至少10个，优选地至少20、30、50、75或100个，按照优先顺序。在实践中，将被掺入本发明的延伸启动子中的a+1下游的核苷酸数量可以方便地视为从a+1到-但不包括-下一个下游atg密码子的序列。在这种情况下，只有一个atg序列(起始密码子的序列)需要通过突变来改变。
[0170]
本发明中使用的第三个表达盒的构建体包含一个prv gb基因启动子，该启动子在a+1之后延伸了129个核苷酸。扩展序列中包含的唯一atg序列来自原始起始密码子，通过突变将其变为ttg。该盒在体外显示出与未调整的prv gb基因启动子相似的功效和稳定性，但是在体内具有大大提高的功效。
[0171]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，本发明的prv gb基因启动子是约0.7kb的dna分子，其包含与seq id no：2的核苷酸20-701区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是核苷酸序列同一性至少为96、97、98或甚至99％，按该优先顺序。
[0172]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，prv gb基因启动子对应于seq id no：2的核苷酸20-701。
[0173]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，ha蛋白基因来自甲型禽流感病毒。
[0174]
目前与家禽健康最相关的aiv血清型是h5、h7和h9血清型：h5和h7，因为它们可能与高致病性致病型相关，甚至可能具有人畜共患能力；h9，因为这是全世界最流行的血清型，特别是在中东和亚洲地区。
[0175]
因此，在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，aiv ha蛋白基因编码选自h5、h7和h9的血清型的ha蛋白。
[0176]
可以很容易地确定ha蛋白是否属于特定血清型，例如使用可从国际aiv参考实验室获得的标准抗血清，其清单由who公布。
[0177]
在根据本发明的rhvt的一个优选实施方式中，aiv ha基因是如wo 2012/052384 seq id no：3和5中公开的血清型h5或h7的密码子优化的hp aiv ha基因。
[0178]
用于本发明的特定ha h9基因序列是合成序列，基于来自最近已发表的aiv分离株的ha h9序列的共识。
[0179]
此外，为了进一步提高根据本发明的rhvt载体在家禽疫苗中的功效，可以对包含在该载体中的ha基因进行密码子优化。密码子优化的过程在本领域中是众所周知的，并且涉及对核苷酸序列的适应以编码预期的氨基酸，但是通过使用用于表达该基因的(微生物)的密码子偏好的核苷酸序列。因此，突变基本上是沉默的。这提高了编码序列在与所表达基因的来源不同的环境中表达的水平。
[0180]
对于本发明，本发明中使用的aiv ha基因的编码序列根据hvt的密码子偏好被优化用于表达。
[0181]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，本发明的aiv ha基因是约1.7kb的dna分子，包含与seq id no：2的核苷酸713-2395的区域的全长具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按优先顺序排列。
[0182]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，aiv ha基因对应于seq id no:2的核苷酸713-2395。
[0183]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第三个表达盒中，转录终止子来自fhv1，优选来自fhv1 us9基因。fhv1 us基因例如在genbank登录号d42113中公开。
[0184]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在第三个表达盒中，转录终止子来源于fhv1 us9基因，大小约为0.05kb，并且包含与seq id no:2的核苷酸2404-2458区域的全长具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，以该优先顺序。
[0185]
在一个实施方式中，来自fhv1 us9基因的转录终止子是seq id no:2的核苷酸2404-2458的区域。
[0186]
在一个优选的实施方式中，第三表达盒是如wo 2012/052384中公开的盒。
[0187]
更优选地，第三表达盒是如在wo 2012/052384中描述为hvp310的rhvt构建体中使用的盒。
[0188]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，本发明的第三表达盒包含来自prv的延
伸的gb基因启动子和h9血清型的密码子优化的aiv ha基因。
[0189]
如上文针对第一和第二表达盒所述，在第三表达盒中，其启动子和终止子与aiv ha基因“可操作地连接”。
[0190]
表2:seq id no:2的元素
[0191][0192]
在自然界中，aiv ha蛋白以ha0(ha零)蛋白的形式表达，该蛋白在翻译后被aiv复制的组织中的蛋白酶切割。这也激活了aiv的传染性。由此产生的ha1和ha2蛋白相互作用形成异二聚体，其中ha1是“头部”部分，ha2是“茎”部分。
[0193]
在seq id no：2中，ha基因的ha1区由核苷酸713-1660形成，ha2区由核苷酸1661-2395形成。
[0194]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，aiv ha蛋白基因编码ha1或ha2亚基蛋白。
[0195]
由于据报道ha2能够诱导广泛的交叉保护性免疫反应(参见chiu et al.,2013,ann.ny acad.sci.,vol.1283,p.13-21)，因此在一个优选实施方式中，aiv ha蛋白基因编码ha2亚基蛋白。
[0196]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，本发明的aiv ha基因编码ha蛋白的ha2部分，并且是约0.75kb的dna分子，包含如下核苷酸序列：与seq id no:2的核苷酸1661-2395区域的全长具有至少90％的核苷酸序列同一性。更优选的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，以该优先顺序。
[0197]
在根据本发明的rhvt的一个实施方式中，在本发明的第三个表达盒中，aiv ha基因对应于seq id no：2的核苷酸1661-2395。
[0198]
根据本发明的rhvt优选基于亲本hvt，该亲本hvt是已建立的具有良好复制能力的hvt疫苗株，并且已知适用于在卵中接种幼鸟或鸟胚胎；例如hvt疫苗株pb1或fc-126。这些通常是可用的：来自atcc的fc-126：vr#584-c，而pb1可作为冷冻感染细胞中的活疫苗购买，例如来自msd animal health。
[0199]
第一、第二和第三表达盒和/或组合的单一表达盒的掺入，都如本文为本发明所定义的，不增加亲本hvt的毒力或致病性(相反)，并且预计不会恢复毒力，，因为hvt是自然致病的。
[0200]
因此，在一个实施方式中，用于产生根据本发明的rhvt的亲本hvt是hvt疫苗株；优选pb1-或fc-126株的hvt疫苗株。
[0201]
根据本发明的rhvt是活的重组载体微生物或“载体”病毒，其可以有利地用于家禽的疫苗接种。它结合了作为一种安全有效的马立克氏病(md)疫苗的特点，以及传染性法氏囊病(ibd)、新城疫(nd)和禽流感(ai)中的一种或多种或全部，并且在遗传上是稳定的。
[0202]
对于本发明而言，“遗传稳定”意味着根据本发明的rhvt的基因组成在随后的病毒复制轮次中不会改变。或者，不稳定的构建体会导致一个或多个插入的异源基因的表达缺
失。这种稳定性可以通过常规技术方便地监测，例如通过使根据本发明的rhvt在细胞培养物中进行随后的传代。在这些步骤中重新分离病毒，可以将其铺在细胞培养皿上，用琼脂覆盖，并孵育直到可见hvt特异性斑块；都使用常规技术。接下来，可以在免疫荧光测定(ifa)方案中使用合适的抗体制剂和足够的阳性和阴性对照对斑块进行染色以表达vp2、f或ha蛋白。然后可以记录不再显示荧光的任何斑块，由此优选监测特定rhvt样品的至少100个单独的斑块。
[0203]
令人惊讶地发现根据本发明的rhvt在所有测试的斑块中保持vp2、f和ha蛋白基因中的每一个的存在和表达，甚至在连续16次细胞培养传代之后，并通过数周的体内复制。细节在实施例中描述。
[0204]
这是对现有技术中描述的所谓多价hvt载体构建体的强烈且非常显著的改进。
[0205]
此外，考虑到所有vp2、f和ha已被用作有效hvt载体疫苗中的插入物，它们被稳定地维持和表达的事实也可靠地证明，根据本发明的rhvt将在家禽中诱导针对这些抗原以及针对mdv的保护性免疫反应，因此将是一种有效的四价载体疫苗。
[0206]
根据本发明的rhvt可以通过常用技术扩增，主要通过体外复制，例如在鸡细胞的培养物中，通常是原代鸡胚成纤维细胞(cef)。这些可以通过对鸡胚进行胰蛋白酶消化来制备，这在本领域都是众所周知的。cef被铺板成单层并被hvt感染。这个过程可以扩大到工业规模的生产。
[0207]
通常，rhvt是通过收获受感染的宿主细胞来收集的，这些宿主细胞中含有细胞相关形式的rhvt。这些细胞被吸收在适当的载体组合物中以在冷冻和储存期间提供稳定性。接下来，通常将受感染的细胞填充到玻璃安瓿中，将其密封、冷冻并储存在液氮中。用于接种时，将安瓿解冻，将受感染的细胞吸收到合适的稀释缓冲液中以进行使用中的稳定化。在一个优选的实施方式中，稀释缓冲液是如wo 2019/121888中公开的缓冲液。
[0208]
尽管hvt的细胞相关冷冻储存是优选的，但在使用液氮不可行的情况下，另一种方法是使用冷冻干燥：这利用了hvt的有利特性，即它可以通过细胞破碎从其宿主细胞中分离出来，例如法压或超声，使用整个培养物。这可以通过离心澄清，然后放入稳定剂中，并冷冻干燥以长期储存。
[0209]
因此，在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的rhvt的宿主细胞。
[0210]
本发明的“宿主细胞”是易受hvt感染和复制的细胞。这种细胞的例子是禽类细胞，特别是淋巴细胞或成纤维细胞。
[0211]
在一个实施方式中，根据本发明的宿主细胞是体外保存的原代禽类细胞；即直接来自非人类动物组织或器官的细胞，而不是来自永生化细胞系的细胞。通常，原代细胞只能执行少量且有限数量的细胞分裂。
[0212]
在一个实施方式中，本发明的原代禽类宿主细胞是体外保存的原代鸡胚成纤维细胞(cef)。
[0213]
在一个实施方式中，根据本发明的宿主细胞是体外保存的永生化禽类细胞。已经描述了几种永生化鸟类细胞系，例如在wo 97/044443和wo 98/006824中。
[0214]
在一个优选的实施方式中，根据本发明的永生化禽类宿主细胞是体外保存的永生化cef；优选如wo 2016/087560中公开的永生化cef。
[0215]
通过不同的克隆和转染方法，本发明的第一、第二、第三和/或组合的单一表达盒
可用于获得根据本发明的rhvt，其在其基因组中稳定地包含和表达如本文所述的表达盒。
[0216]
因此，本发明的另一方面涉及用于构建根据本发明的rhvt的方法，所述方法包括将本发明的第一、第二、第三和/或组合的单一表达盒插入如本发明所述的hvt基因组区域中。
[0217]
将根据本发明的表达盒插入hvt基因组以产生根据本发明的rhvt，可以以本领域已知的不同方式进行。一种方便的方法是使用转移载体和同源重组技术。
[0218]
或者，根据本发明的rhvt可以使用crispr/cas9技术产生；例如，如tang et al,2018所述(vaccine,vol.36,p.716-722)。
[0219]
特别是rhvt-vp2-f载体病毒可用作自2017年以来在商业疫苗innovax nd-ibd中可用的病毒。这可以通过使用crispr/cas9技术将如本文所述的第三表达盒插入如本文所述的rhvt基因组的ul40-41或ul44-45基因座中来进一步操作。实施例中描述了可用于将这些插入对准这些基因座的特定指导rna序列。
[0220]
如所述，根据本发明的rhvt的主要有利用途是用于家禽的疫苗中，提供针对md、ibd、nd和/或ai或相关疾病的征兆的安全、稳定和有效的疫苗接种，并且可以在家禽非常年轻的时候给予。
[0221]
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的rhvt，和/或根据本发明的宿主细胞，用于家禽疫苗。
[0222]
上文概述了根据本发明的rhvt“在疫苗中的用途”的不同方面和实施方式，并且包含在用于接种家禽的疫苗组合物中作为无细胞病毒或作为细胞相关病毒的用途。
[0223]
此外，在另一方面，本发明涉及用于家禽的疫苗，其包含根据本发明的rhvt，和/或根据本发明的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
[0224]
众所周知，“疫苗”是在药学上可接受的载体中包含免疫活性化合物的组合物。“免疫活性化合物”或“抗原”是被接种靶标的免疫系统识别并诱导来自靶标的体液和/或细胞免疫系统的保护性免疫反应的分子。
[0225]
根据本发明的疫苗提供保护鸡对抗由mdv、ibdv、ndv和/或aiv引起的感染和/或疾病。这种效果是通过防止或减少一种或多种这些病毒在它们各自的靶器官中产生性的感染的建立或增殖而获得的。这可以通过例如减少病毒载量或缩短病毒复制的持续时间来实现。反过来，这会导致目标动物减少由病毒感染引起的损伤的数量、强度或严重程度以及相关的疾病临床症状。
[0226]
但是，根据某个家禽养殖场或某个地区流行的mdv、ibdv、ndv或aiv野毒病毒的毒力，可能需要添加一种或多种这些病毒的进一步疫苗成分，以确保对这些病毒最具致病性的变异进行有效的疫苗接种。这在本领域中都是众所周知的。
[0227]
确定根据本发明的用于家禽的疫苗的有效性完全在常规从业者的技能范围内，并且可以通过例如监测疫苗接种后的免疫反应或通过测试攻击感染后临床症状或死亡率的出现来完成，例如通过监测目标的疾病迹象、临床评分、血清学参数，或通过重新分离攻击病原体，并将这些结果与在模拟接种疫苗的动物中看到的疫苗攻击反应进行比较。评估四种病毒感染中的每一种的不同方法在本领域中是众所周知的。
[0228]
由疫苗或通过根据本发明的疫苗接种诱导的针对md、ibd、nd和ai的保护导致接种疫苗的目标改善健康和经济性能。例如，这可以通过提高存活率、生长速度、饲料转化率和
产蛋量以及降低医疗保健成本等参数进行评估。
[0229]
下面将概述根据本发明的疫苗的各种实施方式、偏好和实例。
具体实施方式
[0230]
本发明的术语“家禽”涉及与兽医实践相关的一种鸟类，并且易于接种hvt；首选的家禽种类是：鸡、火鸡和鹌鹑。鸡是最受欢迎的品种。
[0231]
对于本发明，家禽可以是任何类型、品种或品种，例如：蛋鸡、种鸡、肉鸡、组合品种或任何此类品种的亲本系。首选类型是：肉鸡、种鸡和蛋鸡。最优选的是肉鸡和蛋鸡。
[0232]“药学上可接受的载体”旨在帮助疫苗的稳定和给药，同时对目标无害且耐受性良好。这种载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如“缓冲剂”是缓冲剂，其可以包含其他添加剂，例如稳定剂或保守剂。详细信息和示例例如在著名的手册中有所描述，例如：“雷明顿：药学的科学与实践”(2000,lippincott,usa,isbn:683306472)，以及：“兽医疫苗学”(p.pastoret et al.ed.,1997,elsevier,amsterdam,isbn 0444819681)。
[0233]
对于本发明，当疫苗为细胞相关hvt形式时，药学上可接受的载体优选为培养基、约10％血清和约6％dmso的混合物。该载体还在冷冻和冷冻储存期间提供rhvt感染的宿主细胞的稳定性。血清可以是任何常规用于细胞培养的血清，例如胎儿或新生小牛血清。
[0234]
根据本发明的疫苗通过本文所述的方法从根据本发明的rhvt制备，本领域技术人员容易应用这些方法。例如，根据本发明的rhvt是通过插入如本发明所述的表达盒通过转染和重组来构建的。接下来选择所需的rhvt，并在工业上以更小或更大的体积扩增，优选在体外细胞培养物中，例如在cef中。从这样的培养物中收获包含病毒的悬浮液，作为完整的感染细胞或作为通过细胞破碎获得的无细胞制剂。将该悬浮液配制成疫苗并包装最终产品。然后将细胞相关疫苗储存在液氮中，并在-20或+4℃下冷冻干燥疫苗。
[0235]
适用于在众所周知的药品生产标准下生产疫苗的一般技术和注意事项在例如政府指令和法规(药典，9cfr)和众所周知的手册(“兽医疫苗学”和：“雷明顿”，两者同上)。通常这种疫苗是无菌制备的，并且是使用药学质量等级的赋形剂制备的。
[0236]
此类制剂将包括无菌微生物测试和无外源性试剂；并且可能包括体内或体外研究以确认有效性和安全性。疫苗完成质量、数量、无菌、安全性和有效性检测后，即可放行销售。所有这些对于技术人员来说都是众所周知的。
[0237]
在一个实施方式中，根据本发明的疫苗是细胞相关疫苗。
[0238]“细胞相关”是指根据本发明的rhvt包含在根据本发明的宿主细胞中。因此，根据本发明，这种类型的疫苗既包含宿主细胞又包含rhvt。
[0239]
根据本发明的疫苗的目标动物原则上可以是健康的或患病的，并且对于mdv、ibdv、ndv或aiv的存在或对于mdv、ibdv、ndv或aiv的抗体可以是阳性或阴性的。目标也可以是任何体重、性别或对疫苗敏感的年龄。然而，为健康、未感染的目标接种疫苗显然是有利的，并尽早接种疫苗以防止任何现场感染及其后果。
[0240]
因此，根据本发明的疫苗可以用作预防性治疗或治疗性治疗，或两者兼有，因为它干扰mdv、ibdv、ndv或aiv感染的建立和进展。
[0241]
在这方面，根据本发明的疫苗降低病毒载量的另一个有利效果是防止或减少传
播，从而防止或减少田间病毒垂直传播到后代，以及水平传播到群体或群体中，以及在一个地理区域内的传播。因此，根据本发明的疫苗的使用导致mdv、ibdv、ndv或aiv的流行率降低。
[0242]
因此，本发明的其他方面是：
[0243]-根据本发明的疫苗用于降低人群或地理区域中mdv、ibdv、ndv或aiv的流行率的用途，和
[0244]-根据本发明的疫苗用于降低人群或地理区域中mdv、ibdv、ndv或aiv的流行率。
[0245]
根据本发明的疫苗已经提供了多价免疫：通过表达异源插入物对抗ibd、nd和ai，此外还通过hvt载体本身对抗md。然而，与额外的免疫活性成分进行进一步组合可能是有利的。这可以用于增强已经提供的免疫保护，或将其扩展到其他病原体。
[0246]
因此，在一个实施方式中，根据本发明的疫苗包含至少一种额外的免疫活性成分。
[0247]
这种“额外的免疫活性成分”可以是抗原、免疫增强物质、细胞因子、另外的疫苗或其任何组合。这在成本、效率和动物福利方面提供了优势。或者，根据本发明的疫苗本身可以添加到疫苗中。
[0248]
在一个实施方式中，至少一种另外的免疫活性成分是免疫刺激性化合物；优选细胞因子或免疫刺激性寡脱氧核苷酸。
[0249]
免疫刺激性寡脱氧核苷酸优选是免疫刺激性非甲基化的含cpg的寡脱氧核苷酸(ino)。优选的ino是禽类toll样受体(tlr)21激动剂，例如wo 2012/089.800(x4家族)、wo 2012/160.183(x43家族)或wo 2012/160.184(x23家族)中所述。
[0250]
在一个实施方式中，至少一种额外的免疫活性成分是源自对家禽致病的微生物的抗原。该抗原可以以任何合适的方式“衍生”，例如作为来自对家禽致病的微生物的“活”减毒、灭活或亚单位抗原。
[0251]
源自对家禽致病的微生物的额外抗原优选源自一种或多种选自以下组的微生物：
[0252]-病毒：传染性支气管炎病毒、ndv、腺病毒、aiv、蛋滴综合症病毒、ibdv、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、mdv、禽白血病病毒、iltv、禽肺病毒和呼肠孤病毒；
[0253]-细菌：大肠杆菌、沙门氏菌、鼻气管鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌、多杀巴氏杆菌、猪丹毒丝菌、丹毒菌、支原体和梭菌；
[0254]-寄生虫：艾美球虫；和
[0255]-真菌：曲霉。
[0256]
额外的抗原也可以是另外的载体疫苗，例如基于hvt、基于mdv2、基于ndv等。
[0257]
在根据本发明的疫苗的一个实施方式中，源自对家禽致病的微生物的额外抗原是“活”减毒mdv、ibdv或ndv疫苗株。这用于改进和扩大根据本发明的疫苗的免疫原性，并且这在mdv、ibdv或ndv的剧毒田野毒株流行的情况或地理区域中是有利的。
[0258]
在这方面，hvt与mdv1、mdv2或hvt的组合是已知的；对于本发明，rispens株(mdv1)、sb1株(mdv2)或fc-126株或pb1株(hvt)的mdv优选作为额外的免疫活性成分。
[0259]
为了提高对nd的反应，根据本发明的rhvt可以与ndv疫苗株例如温和的活ndv疫苗株c2组合。
[0260]
类似地，为了提高对ibd的反应，根据本发明的rhvt可以与活的ibdv疫苗株例如
d78、pbg98、cu-1、st-12或89-03组合。
[0261]
如技术人员将理解的，这些“组合”还包括其中根据本发明的rhvt和另外的免疫活性成分不是同时(simultaneous)应用而是相伴(concurrent)或顺序应用的疫苗接种方案；例如rhvt可在卵内应用，ndv c2在第一天应用，ibdv 89-03在第17天应用。
[0262]
因此，在根据本发明的包含至少一种额外的免疫活性成分的疫苗的实施方式中，所述至少一种额外的免疫活性成分是选自以下疫苗株的微生物：mdv、ibdv、ndv或aiv，或其任何组合。
[0263]
更优选地，额外的免疫活性成分是一种或多种选自：mdv rispens、mdv sb1、ndv c2、ibdv d78和ibdv 89-03。
[0264]
根据本发明的疫苗可以通过本文描述和举例说明的方法制备。
[0265]
因此，本发明的另一方面涉及制备根据本发明的家禽疫苗的方法，所述方法包含以下步骤：
[0266]
a.用根据本发明的rhvt体外感染宿主细胞，
[0267]
b.收获被感染的宿主细胞，和
[0268]
c.将收获的被感染的宿主细胞与药学上可接受的载体混合。
[0269]
适用于本发明的宿主细胞和药学上可接受的载体已在上文进行了描述。此外，用于感染、培养和收获的合适的体外方法是本领域众所周知的并且在本文中描述和举例说明。
[0270]
因此，本发明的不同方面和实施方式可以有利地用于生产安全、稳定和有效的家禽疫苗。
[0271]
因此，在另一方面，本发明涉及rhvt或根据本发明的宿主细胞或其任何组合在制备家禽疫苗中的用途。
[0272]
不言而喻，将其他化合物，例如稳定剂、载体、佐剂、稀释剂、乳剂等与根据本发明的疫苗混合也在本发明的范围内。此类添加剂在众所周知的手册中有所描述，例如：“雷明顿”和“兽医疫苗学”(均同上)。
[0273]
这样，根据本发明的疫苗在非常年轻时通过单次接种保护家禽免受md、ibd、nd和ai的功效可以在需要时进一步优化。
[0274]
根据本发明的疫苗可以制备成适合施用于家禽目标的形式，并且与期望的应用途径相匹配，并且具有期望的效果。
[0275]
取决于根据本发明的疫苗的应用途径，可能需要调整疫苗的组成。这完全在技术人员的能力范围内，并且通常涉及对疫苗的功效或安全性进行微调。这可以通过调整疫苗剂量、数量、频率、途径，通过使用另一种形式或配方的疫苗，或通过调整疫苗的其他成分(例如稳定剂或佐剂)来实现。
[0276]
根据本发明的疫苗原则上可以通过不同的应用途径和在其生命中的不同时间点给予目标家禽，只要接种的rhvt可以建立保护性感染。
[0277]
然而，由于mdv、ibdv、ndv或aiv的感染可以在非常年轻时就已经建立，因此尽早应用根据本发明的疫苗是有利的。因此，根据本发明的疫苗可以是例如在孵化当天(“第1天”)或卵内施用，例如在胚胎发育18天时，这在本领域中都是众所周知的。
[0278]
因此，在一个实施方式中，根据本发明的疫苗在卵内施用于家禽。
[0279]
用于以工业规模将疫苗自动注射到受精卵中的设备可商购获得。这提供了尽可能早的保护，同时最大限度地降低了劳动力成本。已知不同的卵内接种途径，例如进入卵黄囊、胚胎或尿囊液腔；这些可以根据需要进行优化。优选地，用hvt进行卵内接种，使得针接触胚胎。
[0280]
优选地，根据本发明的疫苗被配制成可注射的液体，适用于注射，无论是卵内还是肠胃外；例如：悬浮液、溶液、分散体或乳液。
[0281]
在一个实施方式中，根据本发明的疫苗通过肠胃外途径施用。优选通过肌肉内或皮下途径。
[0282]
每动物剂量的本发明疫苗的本发明rhvt的确切量并不像灭活型疫苗那样重要；这是因为rhvt将在目标动物中复制到生物学上可持续的病毒血症水平。原则上，疫苗剂量只需要足以引发这种生产性感染。较高的接种剂量几乎不会缩短在宿主中达到最佳病毒感染所需的时间。因此，非常高的剂量不是更有效，而且出于经济原因也没有吸引力。
[0283]
因此，优选的接种剂量是每动物剂量的根据本发明的rhvt的1x10^1和1x10^5斑块形成单位(pfu)之间，更优选1x10^2和1x10^4pfu/剂量之间，甚至更优选500和5000pfu/剂量之间；最优选在约1000和约3000pfu/剂量之间。
[0284]
当根据本发明的疫苗是细胞相关的，这些量的rhvt包含在受感染的宿主细胞中。
[0285]
根据本发明计算rhvt病毒颗粒的方法是众所周知的。
[0286]
本发明的rhvt每动物剂量的体积可以根据预期的应用途径进行优化：卵内接种通常以约0.01至约0.5ml/蛋的剂量进行，肠胃外注射通常以约0.1至约1ml/鸟的剂量。
[0287]
将根据本发明的疫苗施用于目标生物的给药方案可以是单剂量或多剂量，以与疫苗制剂相容的方式，并且以免疫有效的量。
[0288]
优选地，将根据本发明的疫苗施用方案整合到目标家禽可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种计划中，以减少对动物的压力并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以以与其许可使用相适应的方式以同时、相伴或顺序方式给药。
[0289]
如上所述和下文中举例说明的，根据本发明的疫苗可以有利地用于预防或减少mdv、ibdv、ndv和aiv中的一种或多种或全部的感染，以及通过在非常年轻的时候进行一次接种来预防或减少与此类感染相关的疾病(的征兆)。
[0290]
因此，本发明的其他方面是：
[0291]-根据本发明的疫苗用于预防或减少mdv、ibdv、ndv和/或aiv感染或其相关疾病的征兆的用途。
[0292]-预防或减少mdv、ibdv、ndv和/或aiv感染或其相关疾病的征兆的方法，该方法包含将根据本发明的疫苗施用于家禽。
[0293]-家禽接种疫苗以预防或减少mdv、ibdv、ndv和/或aiv感染或它们相关的疾病的征兆的方法，该方法包含用根据本发明的疫苗接种所述家禽的步骤。
[0294]
上文已经描述了通过接种家禽使用本发明疫苗的细节；特别是日龄小鸡的肌肉内或皮下接种，以及18日龄胚胎的卵内接种。
[0295]
现在将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0296]
实施例
[0297]
实施例1：多价rhvt载体的构建和测试
[0298]
1.1.构建体制造和测试
[0299]
基于hvt载体构建体hvp360(wo 2016/102647)，制备了一系列额外表达aiv ha基因的hvt重组体。hvp360表达来自us2基因座的ndv-f和ibdv-vp2基因。使用tang et al.2018(同上)描述的crispr/cas9技术，一个额外的表达aiv-ha h9的盒，被引入到hvp360基因组的ul区域的不同位点。通过插入ha基因表达盒制备了几种构建体，并更详细地评估了四种构建体；插入位点相对于genbank登录号af291866表示：
[0300]-hvp400：ha基因插入hvp360的ul40和ul41之间，介于nt.88054-88055之间
[0301]-hvp401：ha介于ul44和ul45之间，介于nt.94482-94483之间。
[0302]-hvp402：ha介于ul47和ul48之间，介于nt.99588-99589之间。
[0303]-hvp403：ha介于ul54和lorf4之间，介于nt：110395-110396之间。
[0304]
用于crispr/cas9定向插入的指导rna序列是：
[0305]-在ul40和ul41之间插入：5'-acctaaagtacacgtgaatc-3'(seq id no:3)
[0306]-在ul44和ul45之间插入：5'-acatcgggacgtacatcatg-3'(seq id no:4)
[0307]-在ul47和ul48之间插入：5'-tggcggttacaatttccacg-3'(seq id no:5)
[0308]-在ul54和lorf4之间插入：5'-ttagatttccggacagcctg-3'(seq id no:6)。
[0309]
注意：seq id编号3-6在此处以dna代码表示，因为它们被插入dna质粒，然后被转录以产生指导rna。
[0310]
指导rna是使用internet网站设计的：zlab.bio/guide-design-resources。
[0311]
1.2.体外遗传稳定性
[0312]
这四种rhvt载体构建体在cef细胞上体外传代16次。如下通过ifa监测p16斑块中插入基因的表达：过夜建立的cef单层用在第16代水平的4种hvt重组体之一感染。将板孵育2-3天，直到cpe清晰可见，然后用96％乙醇固定。ibdv-vp2、ndv-f或aiv-h9的表达是用对每种抗原特异的单克隆抗体作为第一试剂，并用alexa tm
标记的偶联物作为二抗来检测的。接下来通过紫外显微镜读取板。对每种重组体计数约100个斑块以评估表达。
[0313]
测试hvp400和hvp401的所有斑块均显示vp2、f和ha基因的完全表达。这证实了这三个基因的功能性和稳定表达，直到(至少)细胞传代水平16。测试hvp402和hvp403的斑块显示vp2和/或f表达的轻微损失。这在表3中进行了概述。
[0314]
表3：异源基因在细胞传代水平16的rhvt中的表达
[0315][0316]
不幸的是，即使是异源基因之一表达的微小不稳定性也是不可接受的。在选择压力增加的条件下，例如大量病毒的产生，或在接种疫苗的目标中体内复制数周，这种突变体具有复制优势，并且会迅速超过其表达所有异源基因的亲属。这将导致越来越多的载体病毒表达缺失。因此，只有对所有异源基因(此处为hvp400和hvp401)显示完全稳定表达的构
建体才可用于进一步的疫苗开发。
[0317]
实施例2：疫苗接种和体内传代
[0318]
2.1引言
[0319]
该实验通过在1日龄时对spf蛋鸡进行皮下疫苗接种，测试了rhvt载体构建体hvp400和hvp401在鸡中的复制和血清学功效。组大小为12只动物，外加5只孵化伙伴。
[0320]
为了确定载体疫苗的体内复制，测定了接种动物的脾脏(第11天)和外周血淋巴细胞(第32天)中的hvt病毒血症水平。定期采集血样，以便使用特定的血清学测试确定血清中的抗体水平。
[0321]
2.2.实验
[0322]
hvp400：
[0323]
rhvt包含在基因间区域ul40-41中插入的gb-aiv/ha/h9，并且在us2中插入的mie1-ibdv/vp2+hie1-ndv/f。病毒在第16次细胞传代，并在液氮中储存在感染的cef细胞中。病毒滴度(在感染细胞中)为1.2x 10^6pfu/ml。
[0324]
hvp401
[0325]
rhvt包含在基因间区域ul45-46中插入的gb-aiv/ha/h9，并且在us2中插入的mie1-ibdv/vp2+hie1-ndv/f。病毒在第16次细胞传代，并在液氮中储存在感染的cef细胞中。病毒滴度(在感染细胞中)为1.0x 10^6pfu/ml。
[0326]
剂量为0.2ml/鸡，在颈部皮下给药，约2000pfu/鸡，在标准hvt/cef稀释剂中。
[0327]
由于雏鸡在孵化后不久被放置在负压隔离器中，并在此后不久被贴上标签并接种疫苗，因此没有进行适应(acclimatization)。
[0328]
在第1天从5只孵化伙伴采集血样，对这些样本进行血清学检测，以确保所有动物在接种当天对ndv、ibdv和aiv的抗体均为阴性。
[0329]
在接种疫苗后第14、21、28和42天从接种疫苗的小鸡身上采集血样。将血样从翼静脉收集到具有凝块激活剂的试管中，并保持在环境温度下。
[0330]
病毒血症：
[0331]
脾和外周血淋巴细胞(pbl)中的病毒血症取样如下进行：在p.v.第11天，从每组5只小鸡死后分离脾脏。每只小鸡都使用干净的镊子。将脾脏收集在装有5ml 10mm pbs和酚红指示剂和抗生素的试管中，并保持在冰上直至处理。接下来将脾脏均质化，放入新鲜培养基中并计数。
[0332]
用于检测pbl中病毒血症的血样在第32天p.v.从翼静脉收集到肝素化管中，并保持在冰上直至通过离心处理，放入新鲜培养基并计数。
[0333]
对于每个样品，将约2x10^6个细胞接种在预先建立的cef单层上，并孵育3-4天，然后将板固定，并通过ifa染色。
[0334]
血清学
[0335]
将用于测试血清学反应的血样离心，收集血清并灭活补体。这些样品用于各种测试以确定接种鸡对表达的异源基因的血清反应：ibdv-vp反应是通过使用经典ibdv病毒株d78的病毒中和(vn)测定来测量的；ndv-f反应通过elisa测量并以相对于标准样品的单位表示；和aiv-ha反应是通过使用ha h9抗原的血凝抑制试验确定的。
[0336]
2.3.结果和结论
[0337]
病毒血症
[0338]
疫苗接种后(dpv)分别在11天、32天时在脾脏和pbl中检测到rhvt病毒血症。
[0339]
从每个rhvt和每个时间点，测试了5个动物分离物。平均病毒血症数量的详细信息见表4。
[0340]
表4：体内rhvt病毒血症的结果
[0341][0342]
从这些结果可以清楚地看出：根据本发明的多价rhvt确实在目标动物中复制和传播。然而，它们的复制速度相对较慢。毫无疑问，这是携带和维持三个异源基因插入物表达的结果。
[0343]
体内遗传稳定性
[0344]
测试在病毒血症测定中获得的rhvt病毒的异源基因的持续表达。通过ifa分析了100个斑块，来自hvp400的所有3+2个脾脏和pbls分离物，来自hvp401的5个脾脏分离物和5个pbls分离物。
[0345]
在所有情况下，所有对hvp400和hvp401进行分析的斑块在体内复制后都保持了所有三种异源基因的表达：ibdv-vp2、ndv-f和aiv-ha。
[0346]
得出的结论是rhvt构建体hvp400和hvp401的体内遗传稳定性非常好。
[0347]
血清学
[0348]
用rhvt载体hvp400和hvp401对鸡进行疫苗接种诱导的血清学反应结果列于表5。“对照”是在试验第1天测试的孵化伙伴。
[0349]
在自然界中，针对衍生出三种异源抗原的病原体的免疫反应：ibdv、ndv和aiv，在很大程度上都依赖于体液免疫反应。因此，产生的抗体反应的测量是体内抗感染保护的可靠相关性。
[0350]
因此，选择用于检测免疫反应的血清诊断类型来测量这种保护性抗体反应。这种相关性作为特定抗体捕获病毒的指示对于ibdv的病毒中和和aiv的hi是不言而喻的。这也适用于针对ndv-f的elisa滴度：根据现有技术和以前的经验，已知在该测试中超过约1000elisa单位的滴度可以防止ndv攻击感染。
[0351]
此外，由于hvp400和hvp401构建体的载体病毒仍然是一种功能性hvt病毒，因此对马立克病的保护能力是固有的并且没有改变。
[0352]
因此可以得出结论，用rhvt hvp400或hvp401中的每一种疫苗接种在目标动物中诱导针对ibdv、ndv、aiv和mdv中的每一种的保护性免疫应答。为了证实这一点，正在对这些抗原中的每一种进行疫苗接种挑战实验。
[0353]
关于构建体hvp400和hvp401之间的差异：虽然hvp400在病毒血症中似乎比hvp401
稍低，但是这两种载体诱导的血清学反应非常相似。
[0354]
表5：rhvt疫苗接种试验的血清学结果
[0355][0356]
实施例3：疫苗接种挑战实验
[0357]
为了证实根据本发明的重组hvt载体对禽流感病毒的血清学反应的保护能力，如以上实施例2中所述，进行了疫苗接种攻击试验。
[0358]
3.1.设置
[0359]
使用的动物是一天大的小鸡，对于h9n2aiv，可以是spf或mda+。基本上如上所述通过皮下途径接种这些疫苗，在日龄时用hvt载体疫苗hvp400或hvp401(两组均为n＝16)，其处于第16细胞传代水平。hvt载体疫苗剂量约为800pfu/鸡。接下来对小鸡用异源lpai h9n2菌株进行攻击感染；spf小鸡在p.v.3周时受到攻击，mda+小鸡在p.v.6周时受到攻击。使用的攻击病毒是：lpai a/chicken/egypt/v1527/2018(h9n2)，以10^6eid50以0.2ml鼻内给药。
[0360]
阴性对照组(n＝16)接种了非重组hvt，阳性对照组(n＝11)接种了经典的h9n2灭活疫苗(influenza h9n2+nd)。对5只spf孵化动物进行了血清学检测，以确认spf动物的ha抗体呈阴性。同样，对10只mda+动物进行了血清学检测，以确认它们的mda+h9 ha状态。
[0361]
来自所有hvt接种组的5只小鸡在p.v.15天被安乐死。测试他们的脾脏是否有hvt病毒血症，以确认hvt载体疫苗的摄取和复制。在攻击后1、3和6天取后鼻孔拭子以监测攻击病毒的脱落。定期采集血样以测量血清中的抗体水平。从攻击后1天开始监测临床征兆，直到一组中的所有小鸡都没有ai症状。
[0362]
每日临床评分系统使用以下积分系统：
[0363]
0 无临床症状
[0364]
1 轻度临床症状
[0365]
2 中度临床体征
[0366]
3 严重的临床症状。
[0367]
3.2.结果
[0368]
hvt疫苗复制良好：所有hvt接种组的脾脏在第15天都对疫苗接种呈阳性。这持续了整个实验：在p.v.42(spf)或63(mda+)天对pbl进行的病毒血症测试也是如此，hvt均为阳性。
[0369]
为了确定hvp400和hvp401载体病毒在体内的遗传稳定性，用针对ndv-f、ibdv-vp2或aiv-ha h9的特异性抗血清染色从p.v.第15天开始的病毒的病毒血症斑块。所有斑块均显示所有插入基因的稳定表达。在接受载体疫苗之一的组中，在p.v.28、42和63天采集的血清样品中，elisa也检测到ndv f基因和ibdv-vp2基因的明显阳性表达。阴性对照(非重组hvt疫苗)在所有时间点对异源抗原均为阴性。
[0370]
aiv血清学显示mda+小鸡在实验开始时具有高抗ha h9滴度，如间接elisa和hi测试所检测到的。接受载体疫苗的mda+小鸡在p.v.第14天时具有明显阳性的抗ha抗体，但这
些滴度在p.v.第28天和第42天时下降到背景水平，类似于模拟hvt接种mda+小鸡。接受载体疫苗的spf小鸡在p.v.第21天时显示抗h9滴度增加。
[0371]
有趣的是，h9 ha mda在小鸡中的预先存在并不影响根据本发明的hvt载体疫苗，尽管这些疫苗表达了ha h9抗原；在被接种的鸡中的载体复制和传播良好，包括h9 ha抗原在内的异源基因表达也良好。
[0372]
通过在攻击后第1、3和6天取后鼻孔拭子检测h9n2攻击病毒复制。使用flu
tm
pcr(biochek)通过qpcr分析拭子。发现aiv攻击病毒复制的峰值出现在p.c.第3天。为了了解载体疫苗诱导的攻击病毒复制减少的程度，将当天的载体疫苗接种的qpcr分数与模拟hvt疫苗接种的被攻击的小鸡的分数进行比较。考虑到所有小鸡都是从接种过aiv疫苗的母亲那里出生并因此是ha抗体阳性的现场情况，mda+组的结果是相关的。
[0373]
结果如下：通过qpcr测量的mda+小鸡组在p.c.第3天重新分离的h9n2攻击病毒的相对量(相对于模拟hvt疫苗设定的100％)：对于hvp400载体疫苗为53.2％；对于hvp401载体疫苗为61.4％；对于h9n2灭活疫苗为77.7％。这表明根据本发明的hvt载体疫苗对aiv攻击病毒复制的减少至少与经典灭活的aiv疫苗的减少一样好，甚至略好。
[0374]
从攻击后观察到的临床评分结果中出现了类似的图像。这些测量最多至p.c.3周但在p.c.14天后未发现评分。表6显示了各组疫苗接种的mda+小鸡在攻击后每天的平均临床评分，以及第1-14天每组临床评分的总和。
[0375]
有趣的是，根据本发明的hvt载体疫苗比经典的灭活疫苗更好地防止了来自攻击感染的临床征兆。
[0376]
表6：不同组的疫苗接种的mda+小鸡被攻击后的平均临床评分
[0377][0378]
3.3.结论：
[0379]
hvp400和hvp401载体疫苗在p.v.15天时在体内遗传稳定，并且很好地复制和表达了3个异源基因，即使在其中一种表达抗原为mda+的小鸡中也是如此。两种载体都在接种疫苗的小鸡中诱导了针对三种异源抗原中每一种的明确抗体滴度。
[0380]
此外，可以在很大程度上预防由异源lpai h9n2病毒攻击感染引起的感染和疾病：攻击病毒复制减少，临床症状几乎完全被预防。
[0381]
这是了不起的，因为在hvt载体疫苗接种的mda+动物中诱导的ha特异性抗体水平相对较低。这表明，对于由根据本发明的hvt载体疫苗诱导的针对aiv感染的免疫保护，体液免疫反应的相关性是有限的。