一种降香组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于中药方剂制备的技术领域，具体涉及一种降香与丹参的组合物及其应用。


背景技术：

2.血管性痴呆(vascular dementia，vad)是指由于脑缺血、脑出血或出血性脑组织损伤以及急慢性缺血、缺氧引起的脑血管器质性和功能性改变，以记忆、认知功能缺损为主，同时还伴有语言、运动、视空间障碍以及人格障碍。流行病学调查显示：血管性痴呆是继阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)之后导致痴呆的第二位常见原因，在中国65岁以上老年人痴呆发病率为3.9％，其中血管性痴呆的发生率可高达68.5％。血管性痴呆的平均生存年龄仅为4～6年。
3.血管性痴呆是一种可防治的痴呆类型，早期治疗具有一定的可逆性。然而血管性痴呆的发生是一个多因素的过程，其病因较为复杂，其确切发病机制尚不明确，因而缺乏有效的治疗药物。
4.目前，治疗血管性痴呆的药物较少，加兰他敏和多奈哌齐为常用的胆碱酯酶阻断剂，加兰他敏对单纯血管性痴呆的病人无明显的改善作用，而对血管性痴呆并发阿尔茨海默病的病人有明显的治疗作用，多奈哌齐对病人的认知及整体的功能有一定的提高。因此，有必要开发治疗血管性痴呆中成药，早期治疗，避免血管性痴呆患者的认知功能及记忆功能的减退，达到其治疗血管性痴呆目的。丹参和降香是传统的药对，丹参具有活血化瘀，通经止痛的作用，归心经、肝经，降香具有化瘀止血，理气止痛的功效。降香与丹参配伍后能够芳香开窍，引药归经。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种降香组合物及其应用。本申请内容主要包括降香及丹参药对的重量比及其应用。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明提供一种降香组合物，其重量配比的原料药为：降香10～30克，丹参10～30克。
7.本发明提供一种降香组合物的制备方法，降香药材10～30克，丹参10～30克，取降香药材，粉碎，水蒸馏法，提取降香挥发油；取丹参药材粉碎，水加入为丹参重量的2～5倍，浸泡1～3小时后，90～100℃回流提取1～3次，合并提取液，浓缩，提取液，将降香挥发油与丹参液混合，加入体积比为2～5％的聚山梨酯80，即得，每毫升溶液相当于降香生药量1～3g，丹参生药量1～3g。
8.本发明的降香组合物，先从传统中药降香及丹参中，提取有效成分，经气相及液相的含量测定，降香挥发油主要成分为反式橙花醇，氧化橙花叔醇ⅰ及氧化橙花叔醇ⅱ；丹参的主要成分为丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸b等。
9.动物实验证实降香组合物，对大鼠的血管性痴呆模型有明显防治作用。药效学实验结果表明，采用morris水迷宫实验法，降香组合物能对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力具有促进作用；缩短血管性痴呆大鼠游泳潜伏期和游泳总路程，增加平台所在象限路程百分比，增加尼氏(nissl)小体的数目，减少神经元凋亡的作用。vad患者大脑神经元细胞的损伤，可导致其记忆的丧失。神经细胞的凋亡是大脑神经元细胞的损伤主要原因。细胞凋亡是由于细胞的某个基因被激活，导致细胞主动依照一定的程序逐渐死亡，又称为程序性细胞死亡过程。细胞凋亡也是维持细胞动态平衡与发展过程中，消除受损细胞必不可少的过程。由于中枢神经系统神经元细胞增殖能力和再生能力有限，因此，减少神经细胞的凋亡是保护vad大脑皮质及海马神经元细胞的主要目的。bcl
‑
2(b
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cell lymphoma2)bcl
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2蛋白质家族对细胞凋亡的调控程序中是一个不可缺少的体系，bcl
‑
2通过线粒体的凋亡进行调控，其作用于caspase
‑
3的上游，抑制细胞色素c等从线粒体的释放，发挥抗凋亡效应。bcl
‑
2高表达时可与凋亡因子bax形成异源二聚体bcl
‑
2/bax，异源二聚体具有抑制bax/bax同源二聚体诱导细胞凋亡的作用，pi3k/akt信号通路是细胞凋亡的通路之一，pi3k该信号通路能够提高细胞生存能力和抑制细胞衰老死亡等，pi3k激活后，可诱导akt活化，活化后的akt从细胞质转至细胞膜上，并提供募集pi3k向膜上转位的锚定位点，用来参与信号转导。细胞凋亡还可通过线粒体途径，caspase家族
68.主要参与线粒体途径，其中caspase 3，caspase
‑
9是细胞凋亡最主要的下游执行因子之一。在vad神经退行性病变过程中，抑制caspase 3，caspase
‑
9活性可产生神经保护作用。降香组合物可降低bax表达，增加bcl
‑
2的表达，使得bcl
‑
2/bax比例增加，抑制细胞的凋亡，vad模型组bax表达水平明显上调，而bcl
‑
2因子的表达水平下降，使得bax/bcl
‑
2比例较高，诱导神经元细胞发生凋亡。说明降香组合物对vad的保护作用是通过上调bcl
‑
2，下调bax的表达来实现保护神经元细胞的作用。降香组合物可增加pi3k，akt蛋白表达，降低caspase 3，caspase
‑
9蛋白含量。提示降香组合物可通过活化pi3k/akt信号通路，抑制caspase 3及caspase
‑
9的表达，进而减轻神经元细胞的凋亡。
附图说明
10.图1降香组合物中降香挥发油高效液相色谱图；图2降香组合物中丹参水溶液高效液相色谱图；图3morris水迷宫实验检测降香组合物对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响结果；图4he染色结果图，1.正常组，2.模型组，3.降香组合物组；图5尼氏染色结果图，1.正常组，2.模型组，3.降香组合物组；图6降香组合物组对vad模型大鼠caspase
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3，caspase
‑
9蛋白表达的影响，1.正常组，2.模型组，3.降香组合物组；图7降香组合物组对vad模型大鼠bax、bcl
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2蛋白表达的影响；图8降香组合物对vad模型大鼠pi3k/akt的影响；
具体实施方式
11.以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。
12.实施例1取降香药材10克，丹参药材10克，分别粉碎，水蒸馏法，提取降香挥发油，分取挥发油悬浮液1ml；取丹参药材，加入水50ml，浸泡1小时，90℃回流提取2次，合并取提取液，浓缩至9ml，将降香挥发油与丹参液混合，加入0.5克聚山梨酯80，即得，每毫升溶液相当于降香生药量1g，丹参生药量1g。
13.实施例2取降香药材20克，丹参药材30克，分别粉碎，水蒸馏法，提取降香挥发油，分取挥发油悬浮液1ml；取丹参药材，加入水90ml，浸泡2小时，100℃回流提取1次，取提取液，浓缩至9ml，将降香挥发油与丹参液混合，加入0.2克聚山梨酯80，即得，每毫升溶液相当于降香生药量2g，丹参生药量3g。
14.实施例3取降香药材30克，丹参药材20克，分别粉碎，取降香，水蒸馏法，提取降香挥发油，分取挥发油悬浮液1ml；取丹参，加入水40ml，浸泡3小时，100℃回流提取3次，合并提取液，浓缩至9ml，将降香挥发油与丹参液混合，加入0.75克聚山梨酯80，即得，每毫升溶液相当于降香生药量3g，丹参生药量2g。
15.实施例4降香组合物中降香的含量测定agilent 7890a气相色谱仪(美国安捷伦公司)；色谱柱hp
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innowax(柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.25mm)；fid检测器；载气：氮气；程序升温：初始温度100℃，保持5分钟，以每分钟5℃的速率升温到160℃，保持7分钟，再以每分钟5℃的速率升温到230℃，保持2分钟。进样口温度：230℃，载气流速：3ml/min。
16.对照品溶液制备，取反式橙花叔醇对照品(纯度88.3％，购自sigma公司)，加正己烷溶解。
17.供试品溶液的制备，精密量取降香组合物溶液2ml，加正己烷20ml萃取，取正己烷液，低温蒸干，用正己烷定容至2ml量瓶中，作为供试品溶液，见图1。
18.结果表明，6批降香组合物溶液中反式橙花叔醇含量结果为8.2～31.5(μg/ml)。
19.实施例8降香组合物中降香丹参的含量测定超高效液相色谱仪(美国waters公司)，empower工作站(美国waters公司)；色谱柱：sigma ascentis express c
18
(100mm
×
2.1mm，2.7μm)；流动相：乙腈(a)
‑
0.1％甲酸(b)，梯度洗脱0～3min:5％a；3～9min:5～13％a；9～18min:13～25％a；柱温：35℃；检测波长：280nm；流速：0.6ml/min；进样量：3μl。
20.对照品溶液制备，取丹参素钠对照品(纯度98.1％)、原儿茶醛对照品(纯度98.2％)、迷迭香酸对照品(纯度99.8％)和丹酚酸b对照品(纯度95.4％)均购自中国药品生物制品检定研究院；，用50％甲醇溶解，作为混合对照品溶液。
21.供试品溶液的制备，精密量取降香组合物溶液4ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液，见图2。
22.结果表明，6批降香组合物溶液中丹参素钠含量结果为1.2～3.6(mg/ml)；原儿茶醛含量结果为0.2～0.6(mg/ml)；迷迭香酸含量结果为0.08～0.24(mg/ml)；丹酚酸b含量结
果为0.45～1.15(mg/ml)。
23.实施例9vad大鼠模型的制作，永久性结扎双侧颈总动脉法制备vad大鼠模型。本实验采用两血管阻断法(2
‑
vo)建立vad大鼠模型，其原理是双侧颈总动脉永久结扎后，会导致全脑不完全性缺血，造成慢性脑组织低灌注，从而使大脑等产生缺血缺氧性损害。2
‑
vo是一种有效的模仿vad发病机制的大鼠模型制作方法该模型国内外应用较多，也是较为公认的vad模型之一；vad大鼠模型分组，随机分成假手术组、模型组、尼莫地平组(3mg/kg)，金纳多组(12mg/kg)、降香组合物组(剂量为40g/kg，32g/kg或16g/kg)口服给药每日一次，连续给药21天至大鼠的行为学测试结束。大鼠的morris水迷宫实验，定位航行实验，实验5天，第一天大鼠需熟悉环境，让其进行自由游泳2分钟左右。morris水迷宫的平台置于第四象限中间点位，将大鼠从相对的象限选择固定位置放入水中，同时大鼠需背对平台方向，共计采集120s，利用视频跟踪分析系统记录大鼠的逃避潜伏期(escape latency)和游泳总路程(total distance)，数据进行统计分析。实验结果表明，从第四天开始，降香组合物组，金纳多组可显著缩短游泳潜伏期和游泳总路程，尼莫地平组则可在第五天时，具有缩短模型大鼠游泳潜伏期和游泳总路程的作用(p<0.01)。空间探索实验，morris实验第六天，将平台撤除，实验大鼠需要同一入水点进入水中，自由游泳，测试时间为120s，记录120s内实验大鼠穿越平台区域的次数，及平台象限停留的时间。空间探索实验结果，与假手术组大鼠相比，vad模型组大鼠在原平台所在象限的路程百分比明显下降(**p<0.05)；与模型组相比，降香组合物组，金纳多组，尼莫地平组可显著增加大鼠所在平台象限游泳路程百分比(**p<0.05)。morris水迷宫实验研究发现降香组合物组对vad大鼠小鼠空间学习记忆能力具有促进作用。
24.实施例10降香组合物组对vad大鼠脑组织病理学实验影响大鼠行为学实验结束后，各组分别取7只大鼠，取出整脑，置于4℃的4％多聚甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚度5μm，用于病理组织学检测。将石蜡切片进行常规he染色及尼氏(nissl)染色。he染色结果，镜下可见假手术组神经细胞排列有序，间隙无异常，细胞周围组织结构完整，细胞核清晰，核仁明显，胞浆着色均匀，细胞膜完整；模型组神经细胞排列紊乱，水肿。淡染，核固缩核内染色质凝集成块。降香组合物组则神经细胞排列有序，锥体细胞排列紧密，神经元细胞层数增加，部分神经元细胞的神经突触出现恢复，见图4。尼氏染色的结果反映了神经元细胞的凋亡情况，镜下可见假手术组神经元细胞排列有序，神经元细胞结构清晰、完整，尼氏体呈蓝色颗粒状，较为丰富；模型组神经元细胞结构明显改变，核型不规则，核内染色质边集，尼氏体明显减少，提示神经细胞发生了凋亡。降香组合物各给药组可见大鼠海马神经元细胞数及尼氏体数目增加、结构较清晰，表明降香组合物具有保护vad模型大鼠神经元细胞的作用，见图5；nissl染色统计结果表明，与假手术组相比，模型组神经元细胞数明显减少，有显著性差异(p<0.01)；降香组合物组与模型组相比，可提高vad大鼠海马神经元细胞存活率，具有显著性差异(p<0.01)。
25.实施例11降香组合物组对vad模型大鼠caspase
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3，caspase
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9蛋白表达的影响(1)蛋白质的提取大鼠的行为学实验结束后，分别取各组大鼠5只，腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，断头取脑，将取出的脑放于洁净滤纸上，滤纸放于冰上，快速分离海马，加入组织裂解液，加入比例为5：1，放入
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20℃冰箱冷冻，组织匀浆器匀浆，匀浆后冰浴30min。将样品离心，转数为14000g，温度4℃，时间为20min，分取上清液，取少量上清液定量后，分装，于
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80℃冰箱储存备用；(2)蛋白浓度的测定应用bca法测定。蛋白标准品bsa浓度为0.5mg/ml，加入bca工作液，作成系列标准曲线溶液，同法制备供试品，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸光度；(3)十二烷基硫酸钠
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聚丙烯酰胺凝胶(sds
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page)的配制制胶程序如下：安装玻璃板。配制12％分离胶液，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，去离子水封60min，后加入5％浓缩胶液，插入梳子，封边，聚合60min。4℃保存备用；(4)电泳条件根据bca法蛋白定量的结果，上样前调整各样品的体积使各组蛋白总量一致，加入5
×
sds
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page蛋白上样缓冲液，沸水浴使其变性，上样，起跑电压为80v，当样品由浓缩胶进入分离胶后，将电压加到180v，当指示剂跑至分离胶底部时终止电泳；(5)转模取出除去浓缩胶的凝胶，并将滤纸和pvdf膜用甲醇活化，放入转移缓冲液。由正极至负极依次为滤纸，pvdf膜，凝胶，滤纸，进行转模，条件为恒流电转1～2h，电流为50～80ma，结束后取出膜备用；(6)封闭和免疫反应将膜放入5％脱脂奶粉封闭液中(用pbs缓冲液配置)，室温轻摇2h。加入一抗(caspase
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3、caspase
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9、iκb、pi3k、akt、bax、bcl
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2、β
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actin)，4℃过夜，洗膜，加二抗，室温摇床上孵育2h，洗膜；(7)显色ecl发光液进行显色，显影液显影约5min，定影液进行定影，后用image j软件对其进行分析。对目标蛋白进行定量分析，同时以β
‑
actin作为内参来校正组间各蛋白表达的差异和变化；(8)统计方法实验数据采用spss17.0软件进行统计学分析，数据以表示，两组间的数据用t检验进行进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析进行统计，p<0.05有统计学意义。结果：用western blot方法测定caspase
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3，caspase
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9蛋白表达，实验结果所示，与假手术组比较，模型组caspase
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3，caspase
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9的蛋白表达显著增加(p<0.01)，说明caspase
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3,caspase
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9被激活；与模型组比较，降香组合物各剂量组可显著降低caspase
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3，caspase
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9的表达，说明降香组合物抑制了caspase
‑
3,caspase
‑
9的活化，结果见图6。v
26.实施例12
降香组合物组对vad模型大鼠bax、bcl
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2蛋白表达的影响用western blot方法测定各组大鼠凋亡因子bax，bcl
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2蛋白表达，实验结果所示，与假手术组比较，模型组bax表达显著增加，bcl
‑
2表达的显著降低(p<0.01)；与模型组比较，降香组合物上调抗凋亡因子bcl
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2，下调凋亡前因子bax，说明可调控bax，bcl
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2蛋白表达(p<0.05)。
27.实施例13降香组合物对vad模型大鼠pi3k/akt的影响用western blot方法测定各组大鼠凋亡因子pi3k/akt蛋白表达，研究表明，pi3k激活后，可诱导akt发生活化，进而促进神经元细胞的存活，抑制其细胞凋亡，发挥脑保护作用。western blot实验结果表明，模型组大鼠脑内pi3k、akt表达水平明显低于假手术组，两组比较具有统计学意义(p＜0.001)，降香组合物组与模型组比较，脑内pi3k、akt表达显著增加，说明降香组合物可通过活化pi3k/akt信号通路发挥抗凋亡作用。