一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法和产品及其应用与流程

1.本发明属于护肤品技术领域，具体涉及到一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法和产品及其应用。


背景技术：

2.油脂可以在皮肤表面形成疏水性薄膜，使皮肤柔软、润滑和光泽性；在干燥和寒冷气候条件下，抑制皮肤表面水分的蒸发，防止皮肤干裂；作为特殊成分的溶剂，促进皮肤吸收药物或有效活性成分；赋予毛发柔软和光泽感。
3.植物油脂由于质感亲肤，接近人类皮脂膜结构，更容易被皮肤吸收，渗透性也更好，因此广泛应用于护肤品领域。近年来常用于化妆品的植物油有橄榄油、霍霍巴油、山茶籽油、杏仁油等。目前，植物油脂多是经过化学、物理工艺萃取，植物油料内含有的其他丰富的蛋白质、水溶性维生素等都被抛弃；而传统的生物发酵方法多是在水相里面进行，该传统发酵工艺与植物油脂不能兼容。
4.因此，本领域亟需一种发酵植物油料的制备方法，在有效地将蛋白质、多糖等转变为肌肤易吸收的小分子水溶性发酵体系的同时包载植物油，将植物油料的营养物质最大化。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法，包括，将微生物接种至由植物油料、葡萄糖组成的发酵底物中，发酵培养，破碎细胞释放细胞膜，即得所述高稳定性植物油料发酵自包载体；其中，发酵过程中，利用微生物的细胞膜作为表面活性剂包载脂肪。
9.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物油料包括山茶籽、杏仁、椰子、霍霍巴、白茶、橄榄、花生、核桃、葵花籽、蓖麻、芝麻中的一种或几种。
10.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法的一种优选方案，其中：所述微生物包括酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌和曲霉中的一种或几种。
11.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法的一种优选方案：包括，将植物油料粉碎，灭菌，与无菌葡萄糖混合，得到混合液；按体积比为5～8％向灭菌后的
浆液中加入微生物菌液，在25～30℃条件下发酵36～48h；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为3～5sl
·
min
‑1，ph为5～5.5；将发酵后的发酵液，采用250～300目绢布过滤，保留微生物细胞的同时，去除大分子颗粒，收集滤液；将滤液高压均质，压力为1000～1500bar，均质5～6遍，以破碎细胞，释放细胞膜作为表面活性剂，包载植物油脂；将均质后的滤液，陶瓷膜过滤，收集滤液，即为植物油料发酵自包载体。
12.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品。
13.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得产品，不需要额外添加表面活性剂，由微生物细胞膜包载脂肪，粒径为130～180nm，稳定存在于发酵液中。
14.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品的一种优选方案，其中：所述发酵自包载体产品，离心后油脂仍被稳定包载。
15.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品的一种优选方案，其中：所述发酵自包载体产品，50℃高温放置一个月后，油脂仍被稳定包载。
16.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品的一种优选方案，其中：所述发酵自包载体产品，依次在4℃、
‑
20℃放置一个月后，油脂仍被稳定包载。
17.作为本发明所述高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品的一种优选方案，其中：所述发酵自包载体产品，含有丰富的蛋白质、氨基酸、多酚、多糖。
18.本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法制得的产品在化妆品中的应用，其中：所述高稳定性植物油料发酵自包载体绿色安全，没有溶血作用，不会对皮肤造成不良反应，无刺激性。
19.本发明有益效果：
20.(1)本发明公开了一种高稳定性的植物油料发酵自包载体的制备方法，该发酵产品通过高压均质破碎微生物细胞，释放细胞膜碎片，利用细胞膜作为天然的表面活性剂包载山茶籽油，不需要额外添加表面活性剂。
21.(2)本发明制得的包载体系含有丰富的蛋白质、氨基酸、多酚、多糖，且稳定性高，离心、高温、低温均不会破乳，应用在化妆品中绿色安全，无溶血作用，人体皮肤无不良反应，无刺激性。
22.(3)本发明是对植物油料的新型开发利用，有利于提高植物油料在化妆品中的经济应用价值。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
24.图1为本发明实施例中样品脂肪形态的对比结果图。
25.图2为本发明实施例1中植物油料发酵自包载体的粒径图。
26.图3为本发明实施例1中样品油脂包载效果图，从左到右依次为样1～6制得的油脂包载效果图。
27.图4为本发明实施例7中样品油脂包载效果图，从左到右依次为试验1～4制得的油脂包载效果图。
具体实施方式
28.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
29.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
30.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
31.本发明所述植物油料包括但不限于山茶籽、杏仁、椰子、霍霍巴、白茶、橄榄、花生、核桃、葵花籽、蓖麻、芝麻。本发明以山茶籽为例进行详细的描述。
32.本发明所述微生物包括但不限于酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、曲霉。本发明以酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)为例进行详细的描述。
33.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.下述实施例中的山茶籽来自市面销售。
35.实施例中所用的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cicc 1210，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
36.本发明中ypd液体培养基配方为：酵母粉10.0g，蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g，ph 6.5～6.7，补足去离子水1000ml。
37.ypd固体培养基为ypd液体培养基中添加2％琼脂粉。
38.培养基成分配置好后于121℃灭菌20min。
39.实施例1
40.山茶籽发酵自包载
41.1、种子液制备
42.在无菌操作条件下，挑取酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)单菌落，接种至ypd液体培养基中。30℃，200r
·
min
‑1振荡培养24h，至od600为16左右，得到种子液。
43.2、备料
44.将山茶籽用去离子水洗净，沥干；加入破壁机中，加入3倍质量比的去离子水，打碎至无可见大颗粒固形物。
45.3、发酵底物配制
46.山茶籽40g
·
l
‑1，葡萄糖20g
·
l
‑1。121℃灭菌20min，得到发酵底物，冷却后待用。
47.4、山茶籽发酵
48.向灭菌后的浆液中加入体积比5％的酿酒酵母种子液，在30℃条件下发酵48h；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为4sl
·
min
‑1，ph为5.5。
49.5、过滤
50.发酵液采用250目绢布过滤，保留微生物细胞的同时，去除大分子颗粒，收集滤液。
51.6、破碎细胞
52.高压均质压力为1000bar，高压均质1～6次，以破碎细胞，释放细胞膜作为表面活性剂，包载植物油脂，油脂的包载效果如表1和图3所示。为了拍照清晰，使用油红将样1～4的油脂染色。
53.表1 高压均质次数对油脂包载效果的影响
[0054][0055]
高压均质次数不足时，细胞未完全破碎，细胞膜未被完全释放，油脂包载效果不好，出现分层现象。高压均质5～6次时，油脂包载效果好。考虑到经济因素，高压均质次数确定为5次。
[0056]
7、微滤
[0057]
使用1μm陶瓷膜过滤，收集滤液，即得所述高稳定性的植物油料发酵自包载体。
[0058]
实施例2
[0059]
与实施例1的区别在于：未进行高压均质，未释放细胞膜。
[0060]
实施例3
[0061]
油滴显微状态对比
[0062]
1、试样的配制
[0063]
将本发明的实施例1(高压均质次数为5次)和实施例2作为待测样品。
[0064]
2、尼罗红染色
[0065]
尼罗红是一种脂溶性的染料，可以将发酵液内脂滴染成红色。尼罗红在大多数极性溶剂中不会发出荧光，然而，在脂质丰富的环境中，可以发出强烈荧光。
[0066]
尼罗红染液储存液：尼罗红10mg，丙酮10ml，充分混勾，避光保存。
[0067]
尼罗红工作液：尼罗红储存液100μl，pbs(ph 7.4)1ml，充分混匀后使用。
[0068]
取1ml待测样品，在避光条件下，加入1ml尼罗红工作溶液，孵育5min。取10μl放在载玻片上，并盖上盖玻片，使用激光共聚焦显微镜扫描观察制好的片子的荧光。观察油滴状态。
[0069]
3、油滴状态对比
[0070]
荧光显微镜下观察脂肪形态，如图1所示，其中，(a)实施例1，(b)实施例2。实施例1的油脂呈圆形，而实施例2的油脂形状不规则，呈放射状。与实施例2相比，实施例(高压均质
次数为5次)1的油滴分布更均匀，说明细胞裂解过程中释放的细胞膜碎片会自己组装形成脂质体，可以形成单层的膜，包裹油滴。
[0071]
实施例4
[0072]
粒径比对
[0073]
1、试样的配制
[0074]
将本发明的实施例1(高压均质次数为5次)和实施例2作为待测样品。
[0075]
2、粒径检测
[0076]
使用粒度仪测定样品的粒径，所测样品放入样品池直接测量即可。
[0077]
采用激光光散射法测定样品的粒径。样品用去离子水稀释后放入zeta pals型电位及纳米粒度仪中，设置散射角为90
°
，平行测定3次。
[0078]
3、粒径对比
[0079]
如图2所示，实施例1的粒径为146.1nm，山茶籽中的油被细胞膜包载。而实施例2的粒径过大，超出仪器测量的范围。
[0080]
实施例5
[0081]
山茶籽发酵自包载体系稳定性
[0082]
1、离心稳定性
[0083]
(1)试样的配制
[0084]
将本发明的实施例1(山茶籽自包载发酵液)作为待测样品。
[0085]
(2)离心
[0086]
将样品于3000r
·
min
‑1条件下离心40min，观察油滴是否析出。
[0087]
(3)结果
[0088]
山茶籽自包载发酵液离心后表面无油滴析出，说明包载体系的稳定性较高。
[0089]
2、温度稳定性
[0090]
(1)试样的配制
[0091]
将本发明的实施例1(山茶籽自包载发酵液、高压均质次数为5次)作为待测样品。
[0092]
(2)实验方法
[0093]
将待测样品分别于高温(50℃)、低温(4℃、
‑
20℃)中放置1个月，观察油滴是否析出，测定粒径。
[0094]
(3)结果
[0095]
高温组(50℃)、低温组(4℃、
‑
20℃)放置1个月的样品均无肉眼可见的油滴析出。50℃样品的粒径为186.4nm，4℃样品的粒径为161.2nm，
‑
20℃样品的粒径为160.5nm。说明包载体系的温度稳定性较高。
[0096]
实施例6
[0097]
活性物含量测定
[0098]
1、试样的配制
[0099]
将本发明的实施例1(山茶籽自包载发酵液、高压均质次数为5次)作为待测样品。
[0100]
2、活性物含量测定方法
[0101]
参照lowry method测定样品中总蛋白含量：配制不同浓度的牛血清蛋白溶液，以绘制标准曲线。0.5ml牛血清蛋白溶液加入5ml碱性铜溶液中。室温放置20min后，将0.5ml质
量分数50％的福林酚试剂加入上述溶液中。室温放置30min后，选用650nm波长，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以牛血清蛋白溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。按照上述方法测定待测样品的吸光度，代入标准曲线计算蛋白质含量。
[0102]
参照茚三酮显色法测定样品中总氨基酸含量：配制不同浓度的谷氨酸溶液，以绘制标准曲线。在试管中加入2ml谷氨酸溶液、0.5ml pbs缓冲液、0.5ml 2％的茚三酮溶液，在沸水浴中加热20min。选用570nm波长，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以谷氨酸溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。按照上述方法测定待测样品的吸光度，代入标准曲线计算总氨基酸含量。
[0103]
样品总酚含量的测定方法：配制不同浓度的没食子酸溶液，以绘制标准曲线。在试管中加入100μl没食子酸溶液、1.0ml福林酚、1.0ml 10％na2co3，常温反应90min。选用760nm波长，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以没食子酸溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。按照上述方法测定待测样品的吸光度，代入标准曲线计算总酚含量。
[0104]
样品总糖含量的测定方法：配制不同浓度的葡萄糖溶液，以绘制标准曲线。在试管中加入1.0ml 5％的苯酚水溶液、1.0ml葡萄糖溶液、5.0ml浓硫酸，摇匀，在沸水中反应25min。选用490nm波长，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。按照上述方法测定待测样品的吸光度，代入标准曲线计算总糖含量。
[0105]
山茶籽自包载发酵液活性物含量见表2所示。山茶籽自包载发酵液中含有丰富的蛋白质、氨基酸、酚和糖。
[0106]
表2 山茶籽自包载发酵液活性物含量
[0107][0108]
实施例7
[0109]
在实施例1(高压均质次数为5次)的条件下，探讨不同的发酵参数对植物油料发酵自包载体性能的影响，条件与结果见表3、图4：
[0110]
试验1：酿酒酵母种子液的体积比2％；
[0111]
试验2：酿酒酵母种子液的体积比7％；
[0112]
试验3：30℃条件下发酵24h；
[0113]
试验4：30℃条件下发酵60h。
[0114]
表3
[0115][0116][0117]
可以看出，与实施例1相比，试验1酿酒酵母的接种量减少，试验3发酵时间不足，高压均质后油脂与水相立即分层。发酵的接种量过低或发酵时间不足，发酵结束时菌体量不
足，无法释放充足的细胞膜以包载油脂。与实施例1相比，试验2酿酒酵母的接种量增加，试验4发酵时间增长，样品于50℃放置一段时间后分层。发酵的接种量过多或发酵时间过长，发酵体系中蛋白、多酚等含量过高，反而会降低体系的稳定。本发明包载体系含有丰富的蛋白质、氨基酸、多酚、多糖，且稳定性高，而发酵参数的不同，均会对最终的体系中的蛋白、多酚的含量有影响，而蛋白、多酚等含量，最终对体系的稳定性也会产生影响。
[0118]
实施例8
[0119]
安全性评价
[0120]
1、红细胞溶血实验
[0121]
(1)实验材料
[0122]
猪红细胞(2％，北京博尔西科技有限公司)；
[0123]
pbs：0.27g(2mm)kh2po4、3.58g(10mm)na2hpo4、8gnacl和0.2gkcl溶解于1l去离子水中，盐酸调节ph至7.4。
[0124]
(2)实验方法
[0125]
全溶血对照组：水+猪红细胞
[0126]
阴性对照组：pbs+猪红细胞
[0127]
样品组：实施例1(山茶籽自包载发酵液)+猪红细胞
[0128]
溶血测试：样品分散在pbs或生理盐水中，红细胞与样品按照2:3的比例混合均匀，于37℃孵育10min，10000r
·
min
‑
1离心3min，取上清液测试540nm下的吸光度。溶血率计算公式为：hd％＝(a540样
‑
a540pbs)/(a540水
‑
a540pbs)
×
100％
[0129]
在hd50上下设置5个点，以样品浓度为横坐标，hd为纵坐标设置标准曲线，计算hd50。
[0130]
(3)山茶籽自包载发酵液的hd50
[0131]
山茶籽自包载发酵液在最大实验浓度下(90％，液体中需添加一定量的pbs来去除细胞内外渗透压差异导致的溶血)下没有溶血作用，因此hd50>90％。
[0132]
2、人体皮肤斑贴实验(封闭式)
[0133]
(1)实验方法
[0134]
依据2015化妆品技术规范中规定的方法进行。
[0135]
志愿者要求：30名(20
‑
40岁)正常受试者，未患有炎症性皮肤病临床未愈者，皮肤待试部位无瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其它瑕疵的判定者，未参加其它的临床试验研究者，体质无高度敏感者，近一个月未进行过斑贴试验者。
[0136]
样品组：实施例1(山茶籽自包载发酵液)
[0137]
阴性对照组：去离子水
[0138]
将上述各个溶液加在斑试器所附的滤纸片上置于斑试器内，用量约为0.020～0.025ml，将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。去除受试物斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次记录反应结果。
[0139]
(2)结果
[0140]
表3 人体皮肤斑贴实验结果(封闭式)
[0141][0142]
如表3所示，人体斑贴实验受试者30例均为0级反应，根据2015化妆品卫生规范中规定，山茶籽自包载发酵液未对人体皮肤引起不良反应，由此可知，产品具有很高的人体安全性。
[0143]
目前植物油的包载多为外源添加表面活性剂，而微生物菌体裂解后释放的细胞膜磷脂是最为丰富、最为天然的生物表面活性剂。现有的发酵体系多为水相，植物油料的油在发酵体系中无法稳定存在；目前油脂只能通过外源添加表面活性剂进行包载，才能存在于水相中。而本发明无需额外添加其他成份，即可在发酵过程中通过微生物的细胞膜包载油脂。
[0144]
本发明公开了一种高稳定性的植物油料发酵自包载体的制备方法，该发酵产品通过高压均质破碎微生物细胞，释放细胞膜碎片，利用细胞膜作为天然的表面活性剂包载山茶籽油，不需要额外添加表面活性剂。本发明制得的包载体系含有丰富的蛋白质、氨基酸、多酚、多糖，且稳定性高，离心、高温、低温均不会破乳，应用在化妆品中绿色安全，无溶血作用，人体皮肤无不良反应，无刺激性。本发明是对植物油料的新型开发利用，有利于提高植物油料在化妆品中的经济应用价值。
[0145]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。