TRPML1特异性小分子抑制剂ML-SI3的应用

本发明涉及医药技术领域，具体涉及trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用。

背景技术：

急性心肌缺血再灌注(myocardialischemiareperfusion；i/r)损伤是指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，在一定时间又重新获得再通时，缺血心肌虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列损伤性变化，在血管再通后表现得更为突出，甚至可发生严重的心律失常而导致猝死[1]。心内直视手术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉腔内成形术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下，都可发生心肌缺血后再灌注损伤。对其发生机制认为主要与细胞内氧自由基的大量产生、钙离子超负荷、白细胞的炎症作用及高能磷酸化合物缺乏等有关。

技术实现要素：

本申请的主要目的在于提供一种trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用以解决相关技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的应用，trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，所述trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防和治疗心肌缺血再灌注引发的心肌细胞死亡药物方面的应用。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在治疗急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为0.15mg/kg-1.5mg/kg。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为0.15mg/kg。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为1mg/kg。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为1.5mg/kg。

本发明的有益效果为：本发明所述trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途，为急性心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了新的药物，具有良好的市场价值和临床应用前景。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本发明trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的化学结构图；

图2为急性心肌缺血再灌注损伤模型小鼠的制备及给药时间模式图；

图3为ml-si3联合给药改善急性心肌缺血再灌注小鼠的心肌梗死面积的统计结果；

图4a为ml-si3联合给药对于急性心肌缺血再灌注小鼠短期的心肌功能改善的心超结果图；

图4b为ml-si3联合给药对于急性心肌缺血再灌注小鼠短期的心肌功能改善的统计结果；

图5a为ml-si3联合给药对于急性心肌缺血再灌注小鼠长期的心肌功能改善的心超结果图；

图5b为ml-si3联合给药对于急性心肌缺血再灌注小鼠长期的心肌功能改善的统计结果；

图6a为ml-si3联合给药改善急性心肌缺血再灌注小鼠的心肌纤维化程度的心脏切片纤维化染色图；

图6b为ml-si3联合给药改善急性心肌缺血再灌注小鼠的心肌纤维化程度的统计结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

本申请发现的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途，将该抑制剂用于制备预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤药物方面的应用。具体地将所述抑制剂用于制备预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤的应用时，所述抑制剂能够改善心肌细胞的死亡。

本申请还提供了所述trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3在预防和治疗心肌缺血再灌注引发的心肌细胞死亡药物方面的应用。

在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为0.15mg/kg-1.5mg/kg，优选地，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为1.5mg/kg；更优选的，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为1mg/kg；进一步优选地，在预防和治疗急性心肌缺血再灌注损伤时，所述的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的有效剂量为0.15mg/kg。

研究表明溶酶体阳离子通道trpml1是调控自噬的一个特异性靶点，通过运用trpml1的激动剂或抑制剂改变trpml1通道的活性可以特异性地调控自噬活动。而自噬的缺陷可能是致帕金森病的神经退行性改变的因素之一。所以，以下为本申请为了证实trpml1的特异性小分子抑制剂ml-si3(其化学结构参见图1)对急性心肌缺血再灌注损伤具有预防和治疗效果的试验：

1、试验方法

首先使用c57bl/6j小鼠制备急性心肌缺血再灌注(i/r)损伤模型，共分为3组(各组小鼠数量见附图)，分别为假手术组(sham)、i/r组、i/r联合ml-si3组。i/r造模、ml-si3干预方法如图2所示：

备注：假手术组为开胸暴露心脏，但未进行缺血再灌注造模的对照组；

i/r组：为进行缺血再灌注造模的造模组；

i/r联合ml-si3组：为进行缺血再灌注造模并腹腔给予ml-si3的给药组。

图2具体为：在开始进行急性心肌缺血再灌注造模前24小时、12小时、30分钟分别给予假手术组、i/r组、i/r联合ml-si3组小鼠腹腔注射pbs(5ml/kg)、ml-si3(1.5mg/kg)三次干预后，开始造模。腹腔注射1％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉小鼠，在胸骨左缘三四肋间打开胸腔，暴露心脏，用6-0缝线结扎左前降支并垫一根软管，持续结扎30分钟后取下软管，解除结扎线，关胸缝合并等待小鼠苏醒，急性心肌缺血再灌注模型(i/r)造模成功。

2、ml-si3联合给药对急性心肌缺血再灌注小鼠的心肌梗死面积的影响：

2.1测试方法：

在灌注24h后，收集假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的小鼠心脏，将2％伊文氏蓝(evansblue)注入冠状动脉循环后，将心脏切成1mm厚切片，用1％三苯基四唑(ttc，sigma，usa)溶液在37℃下避光染色15min，4％多聚甲醛固定24h。24h后拍照记录，使用imagej分析软件分析左心室梗死面积及危险区域面积，并以梗死面积占总面积的平均百分比表示；

结果如图3所示：ttc染色结果表明，与未干预组相比，ml-si3干预组(1.5mg/kg；1d)明显减少了急性心肌缺血造成的心肌梗死面积。

3、ml-si3联合给药对于急性心肌缺血再灌注小鼠短期的心肌功能的影响

3.1试验方法

分别在造模前24h、造模后7天和28天使用超声仪器(visualsonics，vevo2100)测量假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的心超。

3.2测量方法

小鼠使用1.5％异氟烷吸入麻醉，在胸骨旁左室长轴面测量左室舒张末期内径(lvedd)和左室收缩末期内径(lvesd)，经系统计算后得到左室射血分数(ef)和左室短轴缩短率(fs)。

备注：左室射血分数(ef)：指每搏输出量占心室舒张末期容积量(即心脏前负荷)的百分比，反应左心室射血功能，是左心室收缩功能指标参数之一；

左室短轴缩短率(fs)：指左心室舒张末期-收缩末期内径的缩短率，是左心室收缩功能指标参数之一。

图4a为造模后7天假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的心超图；图4b为造模后7天假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的心肌功能改善统计结果；

图5a为造模后28天假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的心超图；图5b为造模后28天假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的心肌功能改善统计结果；

从图4和图5可以看出与未干预组相比，ml-si3干预组对于心肌短期(7天)、长期(28天)功能都有显著改善。

4、ml-si3联合给药改善急性心肌缺血再灌注小鼠的心肌纤维化程度

4.1试验方法

在造模28天后，将假手术组(sham)、造模组(i/r)、ml-si3干预组(i/r+ml-si3)的小鼠麻醉，心室穿刺灌注4％多聚甲醛；

采集心脏，在4％多聚甲醛中室温固定24小时，然后包埋石蜡，最后用切片机切成5μm厚切片，使用regaud苏木精溶液(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)将切片细胞核染色5分钟，蒸馏水冲洗3次后，用0.7％masson-ponceau-acid品红染色溶液(sigma-aldrich)染色10分钟。之后切片在2％冰醋酸中冲洗，磷钼酸中分化4分钟，并用2％苯胺蓝染料溶液(sigma-aldrich)染色。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂固定后，用光学显微镜拍摄染色切片图像。胶原纤维(梗死区域)染成蓝色，正常心肌染成红色。统计图表显示纤维化区域与左心室面积的比值用来评估心肌纤维化程度。

从图6中可以看出：ml-si3给药组的心肌纤维化的水平明显低于未进行ml-si3干预的造模组，提示ml-si3对于急性心肌缺血再灌注后损伤的心肌预后有显著改善作用。

综上所述，与pbs干预组的心肌缺血再灌注小鼠相比，我们发现联合ml-si3给药组小鼠的心梗面积、心肌短期、长期功能得到明显改善。

通过以上实验结果证明：ml-si3小分子化和物可以明显改善心肌缺血再灌注模型小鼠短期、长期的心脏功能情况。本发明为急性心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。