去免疫原人脐带内膜-纤维蛋白复合皮肤支架的制备方法与流程

去免疫原人脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架的制备方法
技术领域
1.本发明涉及人造皮肤技术领域，具体的涉及去免疫原人脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架。


背景技术：

2.基质层脐带内膜为单层上皮细胞互相连接构成的薄膜基质。随着胚胎的生长发育，脐带内膜与脐带基质层贴附生长，富有韧性。脐带内膜是脐带最内层其光滑，无血管、无神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.1
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0.2mm，脐带内膜含有胶元、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，正是这些成份使脐带内膜可以充当“移植的基底膜”而发挥新的健康合适的基质作用来促进上皮化。具有促进上皮粘附生长及增殖，减轻炎症，抑制新生血管形成，减少瘢痕增生，抗粘连等特性而把其应用于严重急性期或陈旧性皮表烧伤，皮肤缺损创面，提供一个含基底和基质成份的胶质支架，使增殖的上皮细胞可在其上扩展及移行；并且，脐带内膜有助于干细胞的增殖并提供一个适合其生长的微环境，脐带内膜作为新型的生物材料，取得了神奇的效果，(大小动物实验结果证明疤痕小，皮毛生长)而且它来源广泛，价格低廉，取材和保存简便，手术操作简单而且几乎不发生免疫排斥反应，十分适宜在基层医院开展。
3.现有对人体患处进行植皮，多数的采用自体皮肤进行移植，但是当伤口面积较大时，自体皮肤的移至是有限的，从而不能满足医用需求，且由于自体皮肤的移植是需要通过手术才能实现的，这将增大患者在治疗期间的痛苦，不利于患者伤口的愈合，另外虽然现在市场上已经出现并用于临床的皮肤的产品，但是由于其不具有延展性，导致人工合成的皮肤支架在裁切尺寸固定后，只能适用于一定尺寸的患处的贴敷，这将影响复合后皮肤支架的适用范围。


技术实现要素：

4.1.要解决的技术问题
5.本发明的目的在于提供去免疫原人脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.2.技术方案
7.为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：
8.去免疫原人脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架的制备方法，包括包括以下步骤：
9.1)取无病毒及细菌感染的胎盘，剪断脐带，以无菌生理盐水，空气，氮气等无创扩张法，在无菌条件下从脐带基底层上钝性剥离并获得脐带内膜，去除脐带内膜表面的杂质；
10.2)将剥离后的脐带内膜用含0.1
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1mol/l naoh的生理盐水清洗3次后，置于抗生素的自备培养液中浸泡消毒，然后将侵泡液过滤分装后置于
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80℃保存备用；
11.3)脐带内膜转入0.5
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3mol/l naoh溶液中浸泡24
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72h进行灭菌处理，随后用不同浓度的有机溶液
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生理盐水进行脱水处理；
12.4)将脱水后的脐带内膜置于无菌超净工作台内，平铺于无菌细胞培养皿底部，静置；
13.5)将含有0.1
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1000u/ml人凝血酶和2
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20％人血清白蛋白的溶液均匀涂抹在去免疫原处理后的脐带内膜基质表面；
14.6)将含有2.0
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5.0mg/ml等体积纤维蛋白原的溶液均匀涂抹于上述处理后的脐带内膜基质表面；
15.7)加培养皿盖后，移入20
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45℃恒温干燥箱内，静置0.5
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24h后获得干燥的脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架；
16.8)在无菌室内可按需求裁剪成不同规格脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架；
17.9)进行无菌真空包装，阴凉干燥，室温保存备用；
18.10)使用前，提前取出脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架，浸泡于分装保存的脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架复性培养液中，0.5
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24h后方可用于皮肤缺损病人。
19.优选的，所述步骤1)中的脐带来源于人体。
20.优选的，所述步骤2)中的抗生素采用液体广谱抗生素，且脐带内膜的浸泡消毒时间为0.5
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72h。
21.优选的，所述步骤2)中的自备培养液来自改良的商品化脐带内膜细胞培养基且具体是lf
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bio,mscm添加血清替代物。
22.优选的，所述步骤2)中采用0.25um滤膜过滤。
23.优选的，所述步骤3)中采用不同浓度的甲醇
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生理盐水对脐带内膜进行梯度脱水。
24.3.有益效果
25.1、本发明采用两次涂抹工艺，分别将可控剂量的凝血酶、人血清白蛋白及纤维蛋白溶液均匀涂抹于脐带内膜基底层表面，最终将制得的脐带内膜
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纤维蛋白复合的皮肤支架，当该皮肤支架贴附在伤口处时，可通过皮肤支架上的人血清白蛋白对贴附的伤口进行防护，以此降低伤口有溃烂现象产生的概率，同时还可为破损组织提供营养成分，促进伤口的愈合，该皮肤支架贴附在伤口上时，还可通过其上的凝血酶与纤维蛋白的作用，对破损处起到止血效果，同时还有缓解组织液渗出的效果。
26.2、本发明在使用前将其独立保存在步骤2中自备的培养液中，使脐带内膜
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纤维蛋白复合贴片能够有效、快速软化，便于复合支架的粘贴，同时还可使多种原始的细胞因子贴附于复性的脐带内膜
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纤维蛋白复合贴片(人工皮肤)上，直接敷于患处有助于伤口的快速愈合，而且皮瓣之间融合成片，疤痕小而且平坦，无突出皮肤表面与正常皮肤也相融合，且能够促进毛囊的再生；
27.3、本发明由于贴附在伤口上的皮肤支架具有活性，使皮肤支架在贴合在伤口患处一段时间内能够与人体皮肤成为一体，使其可伤口处进行永久性的修复，避免现有需要对患处进行多次的植皮，才能实现患处皮肤较好的恢复，该种复合皮肤支架可减轻病人反复植皮带来的痛苦。
28.4、本发明使用的材料来源广泛，为产后的废弃物，成本较低，便于人工皮肤的制作，有效的减少了皮肤供需矛盾；另外该种复合皮肤支架不仅取材方便，还具有制作过程简单，便于医护人员的操作、便于储存、运输、商品化制备及临床应用的优点。
29.5、本发明通过对脐带内膜的处理，大限度保存脐带内膜基质的完整性，使得制取
得到的脐带内膜具有延展性和可塑性，使医护人员可依据伤口比例将该复合皮肤支架延展式的贴敷于患处，以此提高该复合皮肤支架的适用性。
30.6、本发明通过对脐带内膜去除异体胶原蛋白、相关免疫原的处理，使得复合后的皮肤支架具有相容性好、无排异反应，以保证该复合皮肤支架使用的安全性能。
31.7、本发明可结合机械扩展进一步扩大脐带内膜延展面积，进一步改善柔韧性及弹性，以便更好实现创口融合。
附图说明
32.图1为本发明中猪皮肤的治疗过程；图中a为：雄性小耳猪，深iii度烫伤，烫伤面积11*12cm；b：烫伤1天对伤口进行消毒处理；c：烫伤5天后伤口出现大面积感染、溃烂；d:为烫伤11天，小耳猪因重度感染死亡；e:雄性小耳猪，深iii度烫伤，烫伤面积10*13.2cm；f：烫伤3天后开始手术，伤口深1.5cm至肌膜层，植入皮肤支架；g:植入支架后20天，伤口无感染，干燥，红润，组织相容，无排斥反应,伤口面积1*2cm，伤口周围已长毛发；h为：植入支架后65天，伤口完全愈合，毛发浓密有光泽；
33.图2为脐带内膜的延展性测试拉伸前后对比及创面可塑性展示图。
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
35.实施例
36.去免疫原人脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
37.1)选取离体胎盘，剪断脐带，经血清检测排除病毒和细菌感染，如排除hiv、梅毒、hbv和hcv等感染，在无菌条件下从脐带基底层上钝性剥离并获得脐带内膜，去除脐带内膜表面的杂质，所述脐带来源于人体；
38.2)将剥离后的脐带内膜用含0.1
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1mol/l naoh的生理盐水清洗3次后，置于抗生素的自备培养液中浸泡消毒，然后将侵泡液过滤分装后置于
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80℃保存备用，所述过滤采用0.25um滤膜过滤，所述抗生素采用液体广谱抗生素，且脐带内膜的浸泡消毒时间为0.5
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24h，所述自备培养液来自改良的商品化脐带内膜细胞培养基且具体是lf
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bio,mscm，所述培养基为在基础细胞培养基中添加了以下成分：体积百分比为2～5％的临床级非血清替代物。
39.3)脐带内膜转入0.5
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3mol/l naoh溶液中浸泡24
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72h进行灭菌处理，随后用不同浓度的有机溶液
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生理盐水进行脱水处理,所述有机溶液剂
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生理盐水具体为甲醇
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生理盐水；
40.4)将脱水后的脐带内膜置于无菌超净工作台内，平铺于无菌细胞培养皿底部，静置；
41.5)将含有0.1
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1000u/ml人凝血酶和2
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20％人血清蛋白的溶液均匀涂抹于去免疫原处理后的脐带内膜基质表面；
42.6)将含有2.0
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5.0mg/ml等体积纤维蛋白原的溶液均匀涂抹于上述处理后的脐带内膜基质表面；
43.7)加培养皿盖后，移入20
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45℃恒温干燥箱内，静置0.5
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24h获得干燥的脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架；
44.8)超净工作台内,可按需求裁剪成不同规格脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架；
45.9)进行无菌真空包装，阴凉干燥，室温保存备用；
46.10)使用前，提前取出脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架，浸泡于分装保存的脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架复性培养液中，0.5
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24h后方可用于皮肤缺损病人。
47.下面对脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架进行相关性能的测试，如图2所示：
48.1.延展性：原始平铺3.5cm，拉开延伸后8.5cm厚约0.1
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0.2mm；
49.2.可塑性：可依据创面伤口形状贴敷患处，方便使用且节约成本。
50.应用实施例1
51.采用实施例1的制备方法，先制备脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架，然后选择皮肤烧伤模型，动物编号152700，114天龄，体重11.9kg的雄性滇南小耳猪，在烧伤处植入该脐带内膜
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纤维蛋白复合皮肤支架后，最终治愈。
52.具体如图1所示，图1为本发明中猪皮肤的治疗过程；图中a为：雄性小耳猪，深iii度烫伤，烫伤面积11*12cm；b：烫伤1天对伤口进行消毒处理；c：烫伤5天后伤口出现大面积感染、溃烂；d:为烫伤11天，小耳猪因重度感染死亡；e:雄性小耳猪，深iii度烫伤，烫伤面积10*13.2cm；f：烫伤3天后开始手术，伤口深1.5cm至肌膜层，植入皮肤支架；g:植入支架后20天，伤口无感染，干燥，红润，组织相容，无排斥反应,伤口面积1*2cm，伤口周围已长毛发；h为：植入支架后65天，伤口完全愈合，毛发浓密有光泽。
53.本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。