本发明公开了一种干细胞滤液及干细胞因子混合液的制备方法，具体为化妆品技术领域。
背景技术：
皮肤指的是披覆在人体的表层，直接与外界环境相接触的组织。具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能，由表皮和真皮紧密结合而成。皮肤覆盖全身表面，是人体最大的器官之一，约占体重的16％。在当前社会，随着人们生活水平的提高，人们对皮肤管理的需求越来越迫切，常见的皮肤问题主要有由于分泌失调、工作生活的恶劣条件、受伤、疾病、老年化等原因，出现痤疮、干燥、伤口瘢痕、色素沉淀、皱纹等问题，目前常规的皮肤保养主要为护肤品、药物或者是微整容等手段。其中通过化妆品、药物涂抹以及贴面膜的形式无法从根本上解决上述皮肤出现的各种问题，而新兴的医美抗衰手段如水光针、热玛吉、细胞填充等方法也存在一定的缺陷。水光针是通过把透明质酸直接注入到真皮层，给予皮肤部分营养成分，使皮肤呈现更为饱满、光润的状态，从而达到美颜效果。然而使用水光针会发生疼痛、红肿、红疹的副作用，而且注入的透明质酸在一到两个月的时间内被吸收代谢掉，需频繁注射才能保存美颜效果。热玛吉的原理是通过高能量电波穿透皮肤，瞬间高效激活皮肤胶原和纤维母细胞，促进胶原蛋白再生，然而后遗症是会加速老化。面部填充主要包括胶原蛋白、自体脂肪干细胞、自体脂肪等，可起到除皱效果，然而注射后容易出现排斥反应，且有感染风险。上述通过医美抗衰的方法都需要专门的仪器、固定的场所如医美机构等，具备一定资质的操作人员以及相对一般家庭而言的高昂的价格。因此研发一种不破皮、无痛、无感染风险、无副作用、能从根源上改善皮肤的状态，且需要的费用不高，能被一般家庭所接受，可日常居家使用的方法是至关重要的。
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，且其可通过自分泌或旁分泌的方式，分泌大量可参与免疫调节、抗细胞凋亡等功能环节的生物活性因子，如干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、基质细胞源型生长因子(sdf)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、外泌体等，从而可改善局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。
除了干细胞分泌的生物活性因子，干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等有重要作用，但在增殖分化过程这类物质并不分泌到细胞外，故而通过适当的方式裂解细胞，可充分提取间充质干细胞滤液,这一方面可避免因直接注入间充质干细胞所致免疫排斥反应等问题,另一方面可利用干细胞裂解产生的生物活性物质激活机体干细胞，通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。综上所述，间充质干细胞分泌的生物活性因子与其内部具有的生物活性物质在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。
无针水光是一种采用高压真空技术将营养物质通过高压喷射的方式注入到皮肤基底层的方法，无需破皮，也无痛，几乎无恢复期，且所需的仪器价格适中，操作简单，适合客户居家使用。
目前，实际方法存在以下不足：
1、培养细胞获得的上清液是由好几代的细胞的上清液浓缩获得，方法复杂且耗时长，且操作过程中易造成污染；
2、目前通过细胞裂解得到的产物仅仅通过培养基进行重悬，之后简单涂抹于面部，并未充分发挥其中生物活性物质的修复作用；
3、常用的医美方法不仅价格昂贵，通常需要复杂的仪器操作，而且对操作人员的要求极高，还易出现各种副作用。
技术实现要素：
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种干细胞滤液及干细胞因子混合液的制备方法，干细胞滤液及干细胞因子混合液的制备方法步骤如下：
步骤1：采用的人脐带来源供体无病原体(病毒、支原体、衣原体等)感染；
步骤2：采用无血清、无动物源成分的基础培养基和添加因子进行脐带间充质干细胞的种子细胞及产品细胞制备；
步骤3：采用p4-p6代种子细胞，在培养箱进行间充质干细胞扩增培养，待融合度达到100％时抽出含有细胞因子的培养液；
步骤4：把步骤3的培养液置于离心机中离心，把上清部分转移到新的无菌离心管中，放到温度为4℃冰箱保存；
步骤5：在步骤3已取出上清液的培养瓶/皿中加入适量生理盐水，在培养箱中继续培养细胞24h；
步骤6：通过步骤5的处理，细胞全部悬浮起来。把悬浮起来的细胞以及生理盐水抽到离心管中；
步骤7：把步骤6中装有细胞悬液的离心管放入液氮中冷冻，然后溶解；
步骤8：把步骤7中离心管中的细胞悬液充分吹打，尽量使粘附在细胞膜上的细胞器脱落；
步骤9：再重复一次步骤7、步骤8的操作；
步骤10：把步骤9中装有破碎细胞的混合液置于离心机中离心；
步骤11：把步骤10中离心管中的上清液取出，加入到步骤3中的培养液当中；
步骤12：把步骤11中的混合液充分混合后，按每份5ml的体积分装到可密封的无菌容器当中；
步骤13：将步骤12中装有混合液的容器密封后，冻于-20℃以下的冰箱中；
步骤14：将步骤13中的产品溶解后，用于无针水光导入。
优选的，使用的混合液为干细胞因子和以及产生干细胞因子的细胞滤液混合物。
优选的，所述步骤3和所述步骤5中培养箱的培养条件均为温度37℃，co2浓度为5％。
优选的，所述步骤7中得到装有细胞悬液的离心管的冻存温度为-196℃，溶化温度为25℃。
优选的，所述步骤4和所述步骤10中离心机转速均为2000rpm，时间为10min。
与现有技术相比，本发明通过将破碎细胞后获得的细胞滤液与培养间充质干细胞获得的上清液相混合，以无针水光的形式导入到人体皮肤中，可以激活细胞增殖以及分化，起到修复表皮层细胞的作用，可有效且持续性地从根本上改善皮肤状态，达到祛痘、祛痘印、淡疤、祛皱等效果，整个过程不破皮、无痛、无感染风险、无副作用且能从根源上修复皮肤和抗衰老，且操作简单，操作过程无需任何医疗资质，所需的仪器价格适中，适合家居日常使用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种干细胞滤液及干细胞因子混合液的制备方法，其包括以下几个步骤：
步骤1：采用的人脐带来源供体无病原体(病毒、支原体、衣原体等)感染。
步骤2：采用无血清、无动物源成分的基础培养基和添加因子进行脐带间充质干细胞的种子细胞及产品细胞制备。
步骤3：采用p4-p6代种子细胞，在37℃，5％co2的培养箱进行间充质干细胞扩增培养，待融合度达到80％时抽出含有细胞因子的培养液。
步骤4：把步骤3的培养液经过2000rpm，10min离心，把上清部分转移到新的无菌离心管中，放到4℃冰箱保存。
步骤5：在步骤3已取出上清液的培养瓶/皿中加入适量生理盐水，在37℃，5％co2的培养箱中继续培养细胞24h。
步骤6：通过步骤5的处理，细胞全部悬浮起来。把悬浮起来的细胞以及生理盐水抽到离心管中。
步骤7：把步骤6中装有细胞悬液的离心管放入液氮中冷冻，然后溶解。
步骤8：把步骤7中离心管中的细胞悬液充分吹打，尽量使粘附在细胞膜上的细胞器脱落。
步骤9：再重复一次步骤7、步骤8的操作。
步骤10：把步骤9中装有破碎细胞的混合液进行2000rpm，10min离心。
步骤11：把步骤10中离心管中的上清液取出，加入到步骤3中的培养液当中。
步骤12：把步骤11中的混合液充分混合后，按每份5ml的体积分装到可密封的无菌容器当中。
步骤13：将步骤12中装有混合液的容器密封后，冻于-20℃以下的冰箱中。
步骤14：将步骤13中的产品溶解后，用于无针水光导入。
实施例2：
一种干细胞滤液及干细胞因子混合液的制备方法，其包括以下几个步骤：
步骤1：采用的人脐带来源供体无病原体(病毒、支原体、衣原体等)感染。
步骤2：采用无血清、无动物源成分的基础培养基和添加因子进行脐带间充质干细胞的种子细胞及产品细胞制备。
步骤3：采用p4-p6代种子细胞，在37℃，5％co2的培养箱进行间充质干细胞扩增培养，待融合度达到90％时抽出含有细胞因子的培养液。
步骤4：把步骤3的培养液经过2000rpm，10min离心，把上清部分转移到新的无菌离心管中，放到液氮保存。
步骤5：在步骤3已取出上清液的培养瓶/皿中加入适量生理盐水，在37℃，5％co2的培养箱中继续培养细胞24h。
步骤6：通过步骤5的处理，细胞全部悬浮起来。把悬浮起来的细胞以及生理盐水抽到离心管中。
步骤7：把步骤6中装有细胞悬液的离心管放入液氮中冷冻，然后溶解。
步骤8：把步骤7中离心管中的细胞悬液充分吹打，尽量使粘附在细胞膜上的细胞器脱落。
步骤9：再重复一次步骤7、步骤8的操作。
步骤10：把步骤9中装有破碎细胞的混合液进行2000rpm，10min离心。
步骤11：把步骤10中离心管中的上清液取出，加入到步骤3中的培养液当中。
步骤12：把步骤11中的混合液充分混合后，按每份5ml的体积分装到可密封的无菌容器当中。
步骤13：将步骤12中装有混合液的容器密封后，冻于-20℃以下的冰箱中。
步骤14：将步骤13中的产品溶解后，用于无针水光导入。
实施例3：
步骤1：采用的人脐带来源供体无病原体(病毒、支原体、衣原体等)感染。
步骤2：采用无血清、无动物源成分的基础培养基和添加因子进行脐带间充质干细胞的种子细胞及产品细胞制备。
步骤3：采用p4-p6代种子细胞，在37℃，5％co2的培养箱进行间充质干细胞扩增培养，待融合度达到100％时抽出含有细胞因子的培养液。
步骤4：把步骤3的培养液经过2000rpm，10min离心，把上清部分转移到新的无菌离心管中，放到4℃冰箱保存。
步骤5：在步骤3已取出上清液的培养瓶/皿中加入适量生理盐水，在37℃，5％co2的培养箱中继续培养细胞24h。
步骤6：通过步骤5的处理，细胞全部悬浮起来。把悬浮起来的细胞以及生理盐水抽到离心管中。
步骤7：把步骤6中装有细胞悬液的离心管放入液氮中冷冻，然后溶解。
步骤8：把步骤7中离心管中的细胞悬液充分吹打，尽量使粘附在细胞膜上的细胞器脱落。
步骤9：再重复一次步骤7、步骤8的操作。
步骤10：把步骤9中装有破碎细胞的混合液进行2000rpm，10min离心。
步骤11：把步骤10中离心管中的上清液取出，加入到步骤3中的培养液当中。
步骤12：把步骤11中的混合液充分混合后，按每份5ml的体积分装到可密封的无菌容器当中。
步骤13：将步骤12中装有混合液的容器密封后，冻于-20℃以下的冰箱中。
步骤14：将步骤13中的产品溶解后，用于无针水光导入。
使用效果调查：
使用方法：本发明选择了10名面部有痤疮、疤痕、色斑、皱纹的患者进行治疗，一个疗程为每天进行1次无针水光导入，每次使用5ml，连续使用10天，具体可视患者具体情况而定。
其中，面部有大量痤疮的女性患者，结果显示，在接受无针水光导入后，其面部痤疮数量显著减少，色素沉着现象显著改善，瘢痕变淡。
其中，面部有疱疹的女性患者，结果显示，在接受无针水光导入后，其面部疱疹显著变小、愈合情况良好，且愈合后无明显瘢痕。
其中，面部有大面积瘢痕的男性患者，结果显示，在接受无针水光导入后，除颧骨部位没有完全恢复以外，其他缝合部位几乎没有留下瘢痕。
综上所述，本发明通过将破碎细胞后获得的细胞滤液与培养间充质干细胞获得的上清液相混合，以无针水光的形式导入到人体皮肤中，可有效且持续性地从根本上改善皮肤状态，达到祛除痤疮、淡化瘢痕等效果，整个过程不破皮、无痛、无感染风险、无副作用且能从根源上修复皮肤和抗衰老,且操作简单，所需的仪器价格适中，适合居家日常使用。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。