一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法

本发明涉及基因工程领域，涉及一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法。

背景技术：

流感是由流感病毒感染引起的一种严重的急性呼吸道传染病。每年在全球造成人和动物的大量死亡，给全球的公共卫生健康以及经济发展带来了严重的威胁。流感病毒根据病毒核衣壳蛋白(np)和基质蛋白m的特征，可将其分为甲、乙、丙三种亚型，其中甲型流感病毒(influenzaavirus)是目前流行最广和影响最深远的流感病毒。甲型流感病毒其基因特性使其经常发生不可预测的变异，因此，对于甲型流感病毒的研究与防制不容忽视。

预防和控制甲型流感的最有效方法是接种疫苗，目前可获得的大多数甲型流感疫苗是亚型特异性的，甲型流感病毒又极易发生变异出现新变异株，并且不能保护患者免受其他病毒亚型的影响，这大大限制了疫苗的适用性和有效性。开发新型通用甲型流感疫苗可以提供较为广泛的保护。其中，dna疫苗是根据实验需求利用分子生物学技术进行设计，与减毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等传统疫苗相比具有较强的可控性。通过设计安全、高效的递送载体有助于dna疫苗顺利靶向免疫细胞，提高其免疫效力。因此，基于现有技术中甲型流感病毒疫苗存在的问题，设计一种新型的通用性甲型流感疫苗非常必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法，该疫苗将甲型流感病毒m2蛋白胞外区、通用疫苗和dna疫苗的优势结合，可以有效预防和控制甲型流感病毒。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种甲型流感病毒通用dna疫苗，包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用dna疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列m2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽。

优选的是，所述基因构建体的核苷酸序列如seqidno：1所示。

优选的是，所述甲型流感病毒的四种不同亚型为h1亚型、h3亚型、h5亚型和h9亚型。

优选的是，所述表达质粒：所述细胞穿透肽按照质量比为(1：10)-(1：20)混合，实现包被。

优选的是，所述细胞穿透肽包括rvg9dr和protamine至少一种。

优选的是，所述细胞穿透肽是由rvg9dr和protamine按质量比(1-3)：(1:3)混合而成。

优选的是，所述疫苗为预防甲型流感病毒通用dna疫苗。

本发明还提供一种所述的甲型流感病毒通用dna疫苗的构建方法，包括以下步骤：

将四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列m2e基因串联，形成基因构建体；

将所述基因构建体转入真核表达载体构建表达质粒；

用细胞穿透肽包被所述表达质粒，构建甲型流感病毒通用dna疫苗。

优选的是，所述基因构建体还包括组织纤溶酶原激活物tpa的分泌序列，所述分泌序列的核苷酸序列如seqidno：2所示。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过将h1、h3、h5、h9亚型流感病毒的m2e序列串联(4m2e)基因片段克隆到真核表达载体，构建出真核表达质粒，然后通过筛选，以最佳细胞穿透肽包被适量的dna进行小鼠免疫实验，发现对甲型流感病毒h1n1和h9n2均具有高保护效力。本发明将甲型流感病毒胞外区、通用疫苗和dna疫苗的优势结合，设计基于甲型流感病毒m2胞外区的通用dna疫苗，该疫苗可以有效的预防和控制甲型流感病毒，具有重要的科学意义和社会价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为目的基因4m2e的设计结构图；

图2为目的片段4m2e的凝胶电泳图；

图3为三种细胞穿透肽的凝胶阻滞实验凝胶电泳图；a为实施例2实验一组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pvax1-4m2e与rvg(9dr)混合，1为对照；b为实施例2实验二组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pvax1-4m2e与protamine混合，1为对照；c为实施例2实验三组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-8分别为按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pvax1-4m2e与细胞穿透肽复合物rvg(9dr)+protamine混合液混合，1为对照；

图4为pvax1-egfp：细胞穿透肽rvg9dr的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应a-e；f为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

图5为细胞穿透肽rvg9dr不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析图；横坐标1-5分别代表pvax1-egfp：细胞穿透肽rvg9dr的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；

图6为pvax1-egfp：细胞穿透肽protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应a-e；f为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

图7为细胞穿透肽protamine不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析；横坐标1-5分别代表pvax1-egfp：细胞穿透肽protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；

图8为pvax1-egfp：细胞穿透肽复合物rvg9dr+protamine的重量比分别为1：1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应a-f；g为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；

图9为细胞穿透肽复合物rvg9dr+protamine不同实验组随机拍摄的荧光图进行荧光强度分析；横坐标1-6分别代表pvax1-egfp：细胞穿透肽protamine的质量比分别为1:1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；

图10为h1n1攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；a为体重变化，b为存活率；

图11为h9n2攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；a为体重变化，b为存活率。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1构建质粒pvax1-4m2e

根据4种亚型甲型流感病毒的m2e的核苷酸序列通过一种组合策略设计通用dna疫苗的目的基因4m2e序列。

首先，将h9亚型、h1亚型、h3亚型和h5亚型的基因串联组合形成一个基因构建体，并进行密码子优化后，将所设计的基因构建体与组织纤溶酶原激活物(tpa)的分泌序列(核苷酸序列如seqidno：2所示)结合，进一步改善目的蛋白的分泌(如图1)。

利用pcr技术进行目的片段4m2e的扩增，扩增引物为：

上游引物序列：aatcgaattcatggatgcaatgaagagagg

下游引物序列：aatcctcgagtcaatcagaggagtagtgtcactac

目的基因4m2epcr扩增体系如表1所示：

表1

目的基因4m2e的pcr反应程序如表2所示：

表2

扩增产物用2％琼脂凝胶进行电泳，结果如图2所示，在378bp出现亮条带，与预期片段长度相同。其中，新合成的目的片段4m2e的dna序列(seqidno：1)为：

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaatcttcaagtcttctaaccgaggtcgaaacgcttaccagaaccggatgggggtgcaactgcagcggttcaagtgattccctgctgacagaggtggaaacccctacaaggtccgagtgggaatgccgctgttctgactctagtgatgcagccgctagcctgctgactgaggtggaaaccccaattcgaaacgagtggggctgccggtgtaatgactcaagcgatgcagccgcttctctgctgaccgaagtggaaactcccaccagaaacgagtgggaatgcaggtgtagtgactcctctgattga

回收pcr产物，并将pcr胶回收的4m2e目的片段和真核表达质粒pvax1使用限制性内切酶ecori和xhoi进行酶切；利用t4dnaligase连接以上两个酶切片段，构建质粒pvax1-4m2e。

实施例2凝胶阻滞实验

实验分为如下三组：

实验一组：从-20℃中将储存浓度为1mg/ml的细胞穿透肽rvg(9dr)(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pvax1-4m2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与rvg(9dr)配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。

实验二组：从-20℃中将储存浓度为1mg/ml的细胞穿透肽protamine(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pvax1-4m2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与protamine配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min,使其充分结合。

实验三组：从-20℃中将储存浓度为1mg/ml的细胞穿透肽rvg(9dr)和protamine取出提前放入冰盒上自然融化，使细胞穿透肽rvg(9dr)和protamine按质量比1：1先结合形成多肽混合物，然后从大量提取的pvax1-4m2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与多肽复合物配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。

将上述三组实验组进行1％的琼脂糖电泳，120v，200ma，30min，利用紫外凝胶成像系统观察。结果如图3所示：dna与rvg9dr最适合结合比例为1:2，dna与protamine的最适合结合比例为1:2，dna与rvg9dr+protamine的最适合结合比例是1:1。

实施例3细胞转染实验

细胞培养：293t细胞培养在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum，fbs)和1％双抗(penicillin-streptomycinsolution，ps)的dmem培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自biologicalindustries公司)。

转染：将293t细胞铺在6孔细胞培养板中，每孔1×10⁶个细胞，待其长成均匀的单层细胞，次日进行后续转染实验。

以质粒dna(pvax1-egfp)为模型进行细胞转染实验，从细胞荧光及荧光强度来判断3种细胞穿透肽在细胞水平上对质粒dna递送效果。具体步骤如下：

(1)将6孔板中各个孔内的原细胞培养液弃掉，并用磷酸盐缓冲液pbs液清洗1-2次。

(2)6孔板每孔中需在加入2mlopti-mem培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱。

(3)取出1.5ml灭菌后的离心管，按照所需实验计划分成四组，每个1.5ml离心管需要加入100μlopti-mem无血清培养基。

(4)实验分组：

第一组：1-5号离心管中分别加入1μgpvax1-egfp，相对应的6-10号离心管中分别加入rvg(9dr)2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。

第二组：1-5号离心管中分别加入1μgpvax1-egfp，相对应的6-10号离心管中分别加入protamine2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。

第三组：1-5号离心管中分别加入1μgpvax1-egfp，相对应的6-10号离心管中分别加入(rvg9dr+protamine)1μg、2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。

(5)取出6孔板，做好标记，每孔加入相应的混合液，预留一个细胞培养孔不做处理将其作为空白对照，于37℃、5％co2培养箱中培养。

(6)培养6-8h后，将6孔板中的opti-mem无血清培养基替换成dmem细胞培养基，继续培养24h，利用荧光倒置显微镜观察荧光并利用imagej软件进行荧光强度分析。

如图4和图5所示，结果显示随着穿透肽rvg9dr质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒dna的结合效果越明显，且质粒dna与细胞穿透肽rvg9dr在质量比1:20处结合效果最好。

如图6和图7所示，结果显示随着穿透肽protamine质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒dna的结合效果越明显，且质粒dna与细胞穿透肽protamine在质量比1:20处结合效果最好。

如图8和图9所示，结果显示随着细胞穿透肽复合物(rvg9dr+protamine)质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒dna的结合效果越明显，且质粒dna与细胞穿透肽复合物(rvg9dr+protamine)在质量比1:20处结合效果最好。

综上所述，以质粒dna(pvax1-egfp)为模型进行的三组细胞转染试验，从细胞荧光及荧光强度结果得出：随着细胞穿透肽rvg9dr、protamine以及(rvg9dr+protamine)质量比逐渐增加(1:2、1:4、1:8、1:10、1:20)，其与质粒dna的结合效果越明显，并且细胞穿透肽复合物(rvg9dr+protamine)的效果最佳，其中质粒dna与细胞穿透肽(rvg9dr+protamine)在质量比1:20处结合效果最好。

实施例4dna疫苗免疫小鼠

根据细胞转染实验结果得出，(rvg9dr+protamine)多肽包被dna的效果较好，且质量比1:20的效果最好。按照dna：rvg9dr+protamine多肽质量比为1:20进行小鼠免疫实验。实验共8组balb/c小鼠，8只/每组，按照以下实验分组操作。

第一组(25ugpvax1-4m2e+500ug多肽免疫组，pr8h1n1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ugpvax1-4m2e+500ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的pr8h1n1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第二组(25ugpvax1-4m2e+500ug多肽免疫组，wm01-p15h9n2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ugpvax1-4m2e+500ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的wm01-p15h9n2代病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第三组(50ugpvax1-4m2e+1000ug多肽免疫组，pr8h1n1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ugpvax1-4m2e+1000ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的pr8h1n1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第四组(50ugpvax1-4m2e+1000ug多肽免疫，wm01-p15h9n2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ugpvax1-4m2e+1000ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的wm01-p15h9n2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第五组(25ug载体pvax1免疫+500ug多肽免疫组、pr8h1n1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ugpvax1+500ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的pr8h1n1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第六组(25ug载体pvax1免疫+500ug多肽免疫组、wm01-p15h9n2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ugpvax1+500ug(rvg9dr+protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的wm01-p15h9n2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第七组(pr8h1n1免疫组)：将实验室保存的pr8h1n1病毒原液稀释500万倍，滴鼻免疫小鼠(50μl/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的pr8h1n1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

第八组(wm01-p15h9n2免疫组)：将实验室wm01-p15h9n2病毒原液稀释100万倍，滴鼻免疫小鼠(50μl/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的wm01-p15h9n2病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。

h1n1攻毒组和h9n2攻毒组21d内小鼠的存活率和体重变化情况，如图10和11所示。从图10a和b可以看出，pr8h1n1免疫组感染pr8h1n1后，小鼠体重无明显变化；25μgpvax1-4m2e+500μg(rvg9dr+protamine)免疫组和50μgpvax1-4m2e+1000μg(rvg9dr+protamine)免疫组在感染pr8h1n1后，小鼠临床表现较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μgpvax1-4m2e+500μg(rvg9dr+protamine)免疫组，有4只小鼠死亡，剩余小鼠攻毒后第7天后体重又开始回升；50μgpvax1-4m2e+1000μg(rvg9dr+protamine)免疫组，未出现小鼠死亡，6-7d后体重开始逐渐回升；25μg载体pvax1+500μg(rvg9dr+protamine)免疫组在感染pr8h1n1后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，5d内小鼠全部死亡。(p值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。

从图11a、b可看出，wm01-p15h9n2免疫组感染wm01-p15h9n2后，未发生小鼠死亡，小鼠体重无明显变化；25μgpvax1-4m2e+500μg(rvg9dr+protamine)免疫组和50μgpvax1-4m2e+1000μg(rvg9dr+protamine)免疫组在感染wm01-p15h9n2后，小鼠临床表现也较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μgpvax1-4m2e+500μg(rvg9dr+protamine)免疫组，有1只小鼠死亡，其余小鼠攻毒后第7d起体重开始回升；50μgpvax1-4m2e+1000μg(rvg9dr+protamine)免疫组，无小鼠死亡，攻毒后第7d后体重逐渐回升；25μg载体pvax1+500μg多肽复合物免疫组在感染wm01-p15h9n2后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，8d内小鼠全部死亡。(p值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>378

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt60

tcgcccagccaggaatcttcaagtcttctaaccgaggtcgaaacgcttaccagaaccgga120

tgggggtgcaactgcagcggttcaagtgattccctgctgacagaggtggaaacccctaca180

aggtccgagtgggaatgccgctgttctgactctagtgatgcagccgctagcctgctgact240

gaggtggaaaccccaattcgaaacgagtggggctgccggtgtaatgactcaagcgatgca300

gccgcttctctgctgaccgaagtggaaactcccaccagaaacgagtgggaatgcaggtgt360

agtgactcctctgattga378

<210>2

<211>75

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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tcgcccagccaggaa75