1.本发明属于干细胞美容技术领域，具体涉及一种间充质干细胞提取物及其提取方法和应用。
背景技术：
2.间充质干细胞(mscs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在于骨髓、脂肪组织、脐血及多种胎儿组织。它可分泌多种细胞因子及生长因子，促进造血干细胞(hsc)的增殖与分化。mscs还具有免疫调节、抗炎和组织修复作用，可减轻移植物抗宿主病(gvhd)及其他移植相关并发症。间充质干细胞目前主要是从脊髓和脐血中提取的。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。人体脐带血间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
3.目前已经有临床实验证明人体脐带血间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与骨髓源间充质干细胞相似,相比于骨髓间充质干细胞，脐血间充质干细胞具有以下优点：
4.(1)无伦理问题，来源广泛，易采集，易扩增。
5.(2)具有更强的增值能力，比骨髓msc快数倍。
6.(3)是一种更原始的msc群。
7.(4)较低的hla
‑
abc(经典人类白细胞抗原ⅰ类抗原)和hla
‑
dr表达。
8.因此人体脐带血间充质干细胞是一类比骨髓间充质干细胞更理想的细胞类群。但目前，只能通过人体脐带血间充质干细胞可从细胞中获得其有效成分，或通过人体脐带血间充质干细胞制备其分泌型内容物，而缺少同时获得其有效成分和分泌型内容物的研究。
9.人们尤其是女性对于日常生活中的护肤美容也越来越重视，对于能够减缓皮肤细胞衰老和紫外损伤的产品的诉求也在不断增强。而且人们越来越重视护肤品的质量和安全性。有必要结合体脐带血间充质干细胞的有效成分和分泌型内容物研究美容产品。
技术实现要素：
10.针对上述现有技术，本发明提供一种间充质干细胞提取物及其提取方法和应用，利用高浓度的间充质干细胞分泌的多种细胞因子，为间充质干细胞应用提供高效、快捷、方便的途径。
11.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：
12.s1：从脐血中分离脐带间充质干细胞；
13.s2：对分离后的脐带间充质干细胞进行传代培养，取传代培养的p5～p25代人脐带间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80％融合时，弃掉培养液；
14.s3：先用磷酸盐缓冲液对培养后的细胞进行洗涤，然后加入无血清培养液继续培养70～75h，随后分离无血清培养液与细胞；
15.s4：将细胞用消化液消化后，再超声破碎，然后离心并收集上清液；
16.s5：将s3所得的无血清培养液与s4中的上清液混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
17.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
18.进一步，脐带间充质干细胞的分离包括以下步骤：
19.ss1：取脐血，按1:3～5的体积比与pbs缓冲液混合，然后滴入与脐血等体积的淋巴细胞分离液，于600～750g下离心10～20min；
20.ss2：抽取白膜层细胞，先用pbs缓冲液洗涤，再用基础培养液重悬；
21.ss3：将非特异性促贴壁蛋白及特异性促贴壁蛋白涂抹于培养皿底部，然后将重悬后的白膜层细胞接种到培养皿中，并于37℃以及低氧条件下培养；
22.ss4：待原代细胞融合率达到60％时进行传代培养；
23.ss5：继续在37℃以及低氧条件下对传代的脐血间充质干细胞进行培养，待细胞融合率达到80％后进行传代；
24.ss6：收集脐血间充质干细胞，即得。
25.进一步，基础培养基包括以下体积浓度的组分：
26.mcdb 131 50～80ml/l，人血清蛋白60～90μl/l，乳铁传递蛋白200～300μl/l，地塞米松10～15μl/l，纳他霉素20～30u/l和青霉素90～120u/l。
27.进一步，非特异性促贴壁蛋白为纤连蛋白；特异性促贴壁蛋白为cd90单克隆抗体。
28.进一步，低氧条件为氧气15％，二氧化碳5％和氮气80％。
29.进一步，细胞生长液包括以下体积百分比的组分：
30.复方氨基酸溶液15％，维生素溶液5％，人血白蛋白溶液10％，水解蛋白溶液10％，微量元素溶液2％和电解质溶液58％。
31.进一步，无血清培养液由基础培养液和添加剂组成；基础培养液为dmem/f12，添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、l
‑
抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、氢化可的松、人胰岛素、bfgf、辅酶a和丙酮酸钠。
32.进一步，基础培养液中l
‑
谷氨酰胺的浓度为1～3mm，l
‑
抗坏血酸的浓度为10～30mg/l，亚硒酸钠的浓度为15～17μg/l，纤连蛋白的浓度为40～50mg/l，氢化可的松的浓度为8～12mg/l，人胰岛素的浓度为10～15mg/l，bfgf的浓度为15～20μg/l，辅酶a的浓度为90～100mg/l，丙酮酸钠的浓度为1～5mm。
33.此外，本发明还提出上述人体脐带血间充质干细胞提取物或上述制备方法制备的人体脐带血间充质干细胞提取物在化妆品中的应用。
34.本发明的有益效果是：
35.从人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞，并依次进行传代培养和无血清培养液培养，获得干细胞培养物，提高了干细胞培养物中人体脐带血间充质干细胞的分泌型内容物的产量，此外也加快了细胞的繁殖速率。从干细胞培养物中获得人脐带血间充质干细胞的分泌型内容物，将经过培养的人脐带血间充质干细胞破碎，获得人脐带血间充质干细胞的非分泌型内容物，再将分泌型内容物与非分泌型内容物混合，得到人体脐带血间充质干细胞提取物，充分利用了人剂带血中分离人脐带血间充质干细胞制备包括分泌型内容物和非分泌型内容物的提取物。
具体实施方式
36.1.脐带血采集
37.选择30岁以下健康的，无遗传性疾病，无传染病，抗hiv及乙肝血清标志物检测都为阴性的剖宫产妇采集脐血。采集完成后将脐血置于冰盒内并立即运输至实验室进行分离处理。其中，涉及的产妇对分离的脐带血实验方案知情并同意。
38.2.分离脐带间充质干细胞
39.采用以下步骤对脐血进行干细胞分离：
40.(1)取脐血，按1:3～5的体积比与pbs缓冲液混合，然后滴入与脐血等体积的淋巴细胞分离液，于600～750g下离心10～20min；
41.(2)抽取白膜层细胞，先用pbs缓冲液洗涤，再用基础培养液重悬；基础培养基包括以下体积浓度的组分：
42.mcdb 131 50～80ml/l，人血清蛋白60～90μl/l，乳铁传递蛋白200～300μl/l，地塞米松10～15μl/l，纳他霉素20～30u/l和青霉素90～120u/l；
43.(3)将非特异性促贴壁蛋白(如纤连蛋白)及特异性促贴壁蛋白(如cd90单克隆抗体)涂抹于培养皿底部，然后将重悬后的白膜层细胞接种到培养皿中，并于37℃以及低氧条件下培养；低氧条件为氧气15％，二氧化碳5％和氮气80％；
44.(3)待原代细胞融合率达到60％时进行传代培养；
45.(5)继续在37℃以及低氧条件下对传代的脐血间充质干细胞进行培养，待细胞融合率达到80％后进行传代；
46.(6)收集脐血间充质干细胞，即得。
47.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
48.实施例1
49.一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：
50.s1：按上述方法从脐血中分离脐带间充质干细胞；
51.s2：对分离后的脐带间充质干细胞进行传代培养，取传代培养的p5～p25代人脐带间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80％融合时，弃掉培养液；细胞生长液包括以下体积百分比的组分：
52.复方氨基酸溶液(浓度为5wt％左右)15％，维生素溶液(浓度为1wt％左右)5％，人血白蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，水解蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，微量元素溶液(含有铁、锌和硒，并且铁、锌和硒的浓度均为1wt％左右)2％和氯化钠溶液(浓度为5wt％左右)58％；
53.s3：先用磷酸盐缓冲液对培养后的细胞进行洗涤，然后加入无血清培养液，于37℃下继续培养72h，随后分离无血清培养液与细胞；无血清培养液由基础培养液和添加剂组成，基础培养液为dmem/f12，添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、l
‑
抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、氢化可的松、人胰岛素、bfgf、辅酶a和丙酮酸钠，并且l
‑
谷氨酰胺的浓度为2mm，l
‑
抗坏血酸的浓度为20mg/l，亚硒酸钠的浓度为16μg/l，纤连蛋白的浓度为45mg/l，氢化可的松的浓度为10mg/l，人胰岛素的浓度为12mg/l，bfgf的浓度为18μg/l，辅酶a的浓度为100mg/l，丙酮酸钠的浓度为3mm；
54.s4：将分离后的细胞用消化液消化后，再超声破碎，然后离心并收集上清液；消化
液为经0.22μm的滤膜过滤除菌的0.25％胰蛋白酶
‑
0.02％edta混合消化液；超声破碎采用超声破碎仪进行，破碎细胞的条件为4℃、400w、超声3s、间隔6s，99个循环；
55.s5：将s3分离所得的无血清培养液与s4中的上清液按1:1的体积比混合混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
56.实施例2
57.一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：
58.s1：按上述方法从脐血中分离脐带间充质干细胞；
59.s2：对分离后的脐带间充质干细胞进行传代培养，取传代培养的p5～p25代人脐带间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80％融合时，弃掉培养液；细胞生长液包括以下体积百分比的组分：
60.复方氨基酸溶液(浓度为5wt％左右)15％，维生素溶液(浓度为1wt％左右)5％，人血白蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，水解蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，微量元素溶液(含有铁和锌，并且铁和锌的浓度均为1wt％左右)2％和氯化钠溶液(浓度为5wt％左右)58％；
61.s3：先用磷酸盐缓冲液对培养后的细胞进行洗涤，然后加入无血清培养液，于37℃下继续培养75h，随后分离无血清培养液与细胞；无血清培养液由基础培养液和添加剂组成，基础培养液为dmem/f12，添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、l
‑
抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、氢化可的松、人胰岛素、bfgf、辅酶a和丙酮酸钠，并且l
‑
谷氨酰胺的浓度为1mm，l
‑
抗坏血酸的浓度为30mg/l，亚硒酸钠的浓度为15μg/l，纤连蛋白的浓度为50mg/l，氢化可的松的浓度为8mg/l，人胰岛素的浓度为15mg/l，bfgf的浓度为15μg/l，辅酶a的浓度为100mg/l，丙酮酸钠的浓度为1mm；
62.s4：将分离后的细胞用消化液消化后，再超声破碎，然后离心并收集上清液；消化液为经0.22μm的滤膜过滤除菌的0.25％胰蛋白酶
‑
0.02％edta混合消化液；超声破碎采用超声破碎仪进行，破碎细胞的条件为4℃、400w、超声3s、间隔6s，99个循环；
63.s5：将s3分离所得的无血清培养液与s4中的上清液按2:1的体积比混合混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
64.实施例3
65.一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：
66.s1：按上述方法从脐血中分离脐带间充质干细胞；
67.s2：对分离后的脐带间充质干细胞进行传代培养，取传代培养的p5～p25代人脐带间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80％融合时，弃掉培养液；细胞生长液包括以下体积百分比的组分：
68.复方氨基酸溶液(浓度为5wt％左右)15％，维生素溶液(浓度为1wt％左右)5％，人血白蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，水解蛋白溶液(浓度为1wt％左右)10％，微量元素溶液(含有硒和锌，并且硒和锌的浓度均为1wt％左右)2％和氯化钠溶液(浓度为5wt％左右)58％；
69.s3：先用磷酸盐缓冲液对培养后的细胞进行洗涤，然后加入无血清培养液，于37℃下继续培养75h，随后分离无血清培养液与细胞；无血清培养液由基础培养液和添加剂组成，基础培养液为dmem/f12，添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、l
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抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、氢
化可的松、人胰岛素、bfgf、辅酶a和丙酮酸钠，并且l
‑
谷氨酰胺的浓度为3mm，l
‑
抗坏血酸的浓度为10mg/l，亚硒酸钠的浓度为17μg/l，纤连蛋白的浓度为40mg/l，氢化可的松的浓度为12mg/l，人胰岛素的浓度为10mg/l，bfgf的浓度为20μg/l，辅酶a的浓度为90mg/l，丙酮酸钠的浓度为5mm；
70.s4：将分离后的细胞用消化液消化后，再超声破碎，然后离心并收集上清液；消化液为经0.22μm的滤膜过滤除菌的0.25％胰蛋白酶
‑
0.02％edta混合消化液；超声破碎采用超声破碎仪进行，破碎细胞的条件为4℃、400w、超声3s、间隔6s，99个循环；
71.s5：将s3分离所得的无血清培养液与s4中的上清液按1:2的体积比混合混合，过滤，收集滤液并浓缩，得间充质干细胞提取物。
72.结果分析
73.以实施例1制得的间充质干细胞提取物为例，说明其作用。
74.将表皮细胞生长因子、谷胱甘肽和烟酰胺混合配成混合液，混合液中表皮细胞生长因子的浓度为30μg/ml，谷胱甘肽的浓度为5μg/ml，烟酰胺的的浓度为2mg/ml。然后将实施例1中制得的间充质干细胞提取物以0、0.5％、1％、2％、5％的体积分数加入到混合液中，配成培养液，分别编号a、b、c、d、e。
75.使用人皮肤成纤维细胞，按照1
×
103/孔接种于96孔板，然后加入培养液，并在最适条件下培养。分别在接种后第3天(d3)，第5天(d5)和第7天(d7)考察人皮肤细胞的的增殖速率。结果如表1所示。
76.表1含不同浓度的间充质干细胞提取物的培养液处理后的人皮肤细胞增殖速率
[0077] 00.5％1％2％5％d398.97％108.34％110.97％112.72％112.94％d5100.88％113.98％125.62％128.37％129.31％d7100.54％111.88％117.54％118.47％118.56％
[0078]
从表中可以看出，添加本发明中的间充质干细胞提取物后，人皮肤细胞增殖速率显著提升，表明其在促进细胞增殖方面具有积极作用，可用于美容产品的制备。
[0079]
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。