一种喜树碱结肠定位释药微丸及其制备方法

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种喜树碱结肠定位释药微丸及其制备方法。

背景技术：

喜树碱是一种由珙桐科植物喜树中分离出的不溶于水的五环吡咯并喹啉类生物碱，同时也是一种天然的拓扑异构酶i抑制剂，对包括结肠癌在内的诸多肿瘤疾病的治疗均具有良好的效果。但喜树碱水溶性较差，对胃肠黏膜有刺激性，在碱性环境下容易开环，疗效降低而毒性增强，导致其成药性大大降低。

微/纳米载体具有很多优点，例如增加的体积/表面积比，从而使药物在相同剂量下具有更高的接触面积，并使递送更加有效，通过选择生理环境响应的药用高分子材料作为囊材或骨架，选择性释放，减少药物的副作用和毒性；同时将药物包载于内核，保护药物免受生理环境的破坏。纳米载体还可增加药物的溶解度，具有易于修饰的表面，从而设计不同选择性分布的靶向纳米载体。而荷载纳米乳的微丸相比于纳米乳，更加稳定；微丸在特定部位释放出浓缩型纳米乳，遇水自乳化，药物以纳米乳形式被组织摄取。通过选择不同的药用高分子材料，可使微丸响应不同生理环境释放药物。将纳米乳和微丸技术结合起来，既能提高制剂本身和药物的稳定性，又能选择性释放，且使药物以纳米粒子形式高效吸收，逐渐成为复杂制剂的主要研究方向之一。

虽然本领域技术人员公知喜树碱存在水溶性较差，具有胃肠黏膜刺激性，在碱性环境下容易开环，进而使疗效降低而毒性增强等问题，但是目前仍然没有成功制备出能够同时增加喜树碱溶解性，减少胃肠黏膜刺激性，实现在结肠部位稳定释药，以提高疗效和降低毒性的喜树碱制剂。

海藻酸钠作为阴离子多糖，具有菌群/ph敏感性，在ph较低的胃部环境中较少释放，而在ph较高处的肠段释放效果较好，在一定条件下可以起到结肠定位释放的作用；卡波姆为丙烯酸键合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，由于其分子结构中含56-68％的羧酸基团，因此具有一定的酸性。在弱碱性环境下溶解性增加，粘附性大大增强，故而能够在结肠较长时间粘附，进一步增强定向缓释效果。

为了解决喜树碱对胃肠道粘膜的刺激，以及吸收入血导致的全身副作用，拟针对喜树碱在治疗结肠癌的应用，本发明将其制成结肠定位释药微丸。本发明意外发现：将喜树碱与溶于丙二醇单辛酸酯和油酸混合油相后，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油和二乙二醇单乙基醚混合乳化剂制备成喜树碱纳米乳；然后将喜树碱纳米乳加入到海藻酸钠和卡波姆混合凝胶液中，再缓慢滴入氯化钙水溶液，形成的凝胶微丸将喜树碱包载在纳米乳内核中，既解决了内酯环开环的问题，又增加了喜树碱溶解度，使其能够顺利跨过结肠表面的水性屏障，被结肠癌组织摄取，实现了喜树碱的结肠定位释放，增强了疗效，降低了毒性，具有极大的应用价值。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种提高疗效，降低毒性和胃肠刺激性的喜树碱结肠定位释药微丸及其制备方法，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种喜树碱结肠定位释药凝胶微丸，所述喜树碱结肠定位释药凝胶微丸由以下重量份组分组成：喜树碱0.1％-0.2％、丙二醇单辛酸酯15-20％、油酸1-2％、混合乳化剂30-42％、海藻酸钠1-3％、卡波姆1-3％和氯化钙10-20％；所述混合乳化剂包括聚氧乙烯40氢化蓖麻油和二乙二醇单乙基醚。

优选地，所述聚氧乙烯40氢化蓖麻油和二乙二醇单乙基醚的重量比为1:1。

第二方面，本发明提供了一种喜树碱结肠定位释药凝胶微丸的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备喜树碱纳米乳；

(2)制备混合凝胶液：制备海藻酸钠凝胶液和卡波姆凝胶液，将海藻酸钠凝胶液和卡波姆凝胶液按体积比为2:1-1:2混合，得到混合凝胶液；

(3)离子交联法：将步骤(1)制备的喜树碱纳米乳逐滴加入步骤(2)制备的混合凝胶液中，得到纳米乳/凝胶复合物；将上述纳米乳/凝胶复合物缓慢滴入氯化钙水溶液，形成凝胶微丸；过滤后烘干，得到喜树碱结肠定位释药凝胶微丸。

优选地，所述步骤(1)为：将丙二醇单辛酸酯和油酸混合后加入喜树碱，得到混合油相；将融化后的聚氧乙烯40氢化蓖麻油和二乙二醇单乙基醚按重量比1:1混合，得到混合乳化剂；将混合油相和混合乳化剂混合；在持续搅拌下逐滴加入蒸馏水，制备获得喜树碱纳米乳。

优选地，所述喜树碱纳米乳包括以下组分：喜树碱0.1％-0.2％m/v、丙二醇单辛酸酯15-20％m/v、混合乳化剂30-42％m/v、油酸1-2％m/v。

优选地，所述步骤(2)为：将海藻酸钠加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到海藻酸钠凝胶液；将卡波姆加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到卡波姆凝胶液；将海藻酸钠凝胶液和卡波姆凝胶液混合，搅拌均匀后得到混合凝胶液；

优选地，所述海藻酸钠凝胶液和卡波姆凝胶液的浓度均为1-3％m/v。

优选地，所述步骤(2)中，卡波姆为卡波姆934p。

优选地，所述步骤(3)中，纳米乳/凝胶复合物包括重量比为2:1-1:2的喜树碱纳米乳与混合凝胶液。

优选地，所述步骤(3)中，氯化钙溶液的浓度为10-20％m/v。

第三方面，本发明提供了一种根据上述第二方面所述方法制备获得的喜树碱结肠定位释药凝胶微丸。

第四方面，本发明提供了一种上述第一方面或第三方面所述的喜树碱结肠定位释药凝胶微丸作为治疗结肠癌药物的应用。

本发明的有益效果是：首先，本发明提供了一种结肠定位释药的喜树碱纳米乳/微丸，将喜树碱制备成纳米乳可以提高喜树碱的溶解度，进一步制备成载浓缩型纳米乳/微丸，使体积/比表面积显著增大，将喜树碱载药量提高一倍；其次，将喜树碱纳米乳加入到海藻酸钠和卡波姆混合凝胶液中，再缓慢滴入氯化钙水溶液，形成的凝胶微丸将喜树碱包载在纳米乳内核中，既解决了内酯环开环的问题，又增加了喜树碱溶解度，使其能够顺利跨过结肠表面的水性屏障，被结肠癌组织摄取，实现了喜树碱的结肠定位释放，避免了喜树碱在胃部和小肠的大量释放和吸收造成的药物浪费和引起的全身副作用，同时增强了疗效，具有极大的应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1本发明所述的喜树碱结肠定位释药凝胶微丸在模拟消化液中释放的透射电镜图；

图2本发明所述的喜树碱结肠定位释药微丸在模拟消化液内的释放曲线；

图3本发明所述的喜树碱结肠定位释药微丸在小鼠离体胃肠粘膜上的粘附率；

图4载cy7纳米乳/微丸在sd大鼠体内荧光活体成像图，a为不同时间活体成像图；b为12h大解剖大鼠活体成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐明本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1喜树碱结肠定位释药微丸的制备1

(1)喜树碱纳米乳的制备：精密称取喜树碱0.05g，加入油相丙二醇单辛酸酯(capryol90)7.5g，涡旋震荡后超声约30min使其溶解；提前将乳化剂聚氧乙烯40氢化蓖麻油(kolliphorrh40)7.5g于60℃烘箱中加热，待其完全融化后，按照km值1:1加入等量助乳化剂二乙二醇单乙基醚(transcutolhp)7.5g，使用磁力搅拌器在30℃恒温下搅拌，即得混合乳化剂；将0.5g油酸加入到含喜树碱的油相中，搅拌混合5min后，加入30℃恒温的混合乳化剂，继续搅拌约20min，再超声30min，然后置于30℃恒温的磁力搅拌器上缓慢逐滴加入蒸馏水，后继续搅拌10min得喜树碱纳米乳，所述喜树碱纳米乳中含喜树碱0.1％m/v、丙二醇单辛酸酯15％m/v、混合乳化剂30％m/v、油酸1％m/v。

(2)制备混合凝胶液：将海藻酸钠加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为1％m/v的海藻酸钠凝胶液；将卡波姆934p加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为1％m/v的卡波姆凝胶液；将二者按照质量比为1：1混合，搅拌均匀后得到混合凝胶液。

(3)离子交联法：将步骤(1)制备的喜树碱纳米乳逐滴加入步骤(2)制备的混合凝胶液中，所述喜树碱纳米乳与混合凝胶液的质量比为2：1，得到纳米乳/凝胶复合物。充分搅拌后，将上述纳米乳/凝胶复合物缓慢滴入浓度为10％m/v的氯化钙水溶液，形成凝胶微丸。过滤洗涤后，40℃常压热风烘干24h，得到喜树碱结肠定位释药凝胶微丸。

实施例2喜树碱结肠定位释药微丸的制备2

(1)喜树碱纳米乳的制备：精密称取喜树碱0.10g，加入油相丙二醇单辛酸酯(capryol90)10g，涡旋震荡后超声约30min使其溶解；提前将乳化剂聚氧乙烯40氢化蓖麻油(kolliphorrh40)10.5g于60℃烘箱中加热，待其完全融化后，按照km值1:1加入等量助乳化剂二乙二醇单乙基醚(transcutolhp)10.5g，使用磁力搅拌器在30℃恒温下搅拌，即得混合乳化剂；将1.0g油酸加入到含喜树碱的油相中，搅拌混合5min后，加入30℃恒温的混合乳化剂，继续搅拌约20min，再超声30min，然后置于30℃恒温的磁力搅拌器上缓慢逐滴加入蒸馏水，后继续搅拌10min得喜树碱纳米乳；所述喜树碱纳米乳中含喜树碱0.2％m/v、丙二醇单辛酸酯20％m/v、混合乳化剂42％m/v、油酸2％m/v。

(2)制备混合凝胶液：将海藻酸钠加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为3％m/v的海藻酸钠凝胶液；将卡波姆934p加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为3％m/v的卡波姆凝胶液；将二者按照质量比为1：1混合，搅拌均匀后得到混合凝胶液。

(3)离子交联法：将步骤(1)制备的喜树碱纳米乳逐滴加入步骤(2)制备的混合凝胶液中，二者质量比为1：2，得到纳米乳/凝胶复合物。充分搅拌后，将上述纳米乳/凝胶复合物缓慢滴入浓度为20％m/v的氯化钙水溶液，形成凝胶微丸。过滤洗涤后，40℃常压热风烘干24h，得到喜树碱结肠定位释药凝胶微丸。

实施例3喜树碱结肠定位释药微丸的制备3

(1)喜树碱纳米乳的制备：精密称取喜树碱0.05g，加入油相丙二醇单辛酸酯(capryol90)9.0g，涡旋震荡后超声约30min使其溶解；提前将乳化剂聚氧乙烯40氢化蓖麻油(kolliphorrh40)10.0g于60℃烘箱中加热，待其完全融化后，按照km值1:1加入等量助乳化剂二乙二醇单乙基醚(transcutolhp)10.0g，使用磁力搅拌器在30℃恒温下搅拌，即得混合乳化剂；将1.0g油酸加入到含喜树碱的油相中，搅拌混合5min后，加入30℃恒温的混合乳化剂，继续搅拌约20min，再超声30min，然后置于30℃恒温的磁力搅拌器上缓慢逐滴加入蒸馏水，后继续搅拌10min得喜树碱纳米乳；所述喜树碱纳米乳中含喜树碱0.2％m/v、丙二醇单辛酸酯18％m/v、混合乳化剂42％m/v、油酸2％m/v。

(2)制备混合凝胶液：将海藻酸钠加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为2.18％m/v的海藻酸钠凝胶液；将卡波姆934p加入到蒸馏水中，常温放置后搅拌均匀得到浓度为1.92％m/v的卡波姆凝胶液；将二者按照质量比为1：1混合，搅拌均匀后得到混合凝胶液。

(3)离子交联法：将步骤(1)制备的喜树碱纳米乳逐滴加入步骤(2)制备的混合凝胶液中，二者质量比为1：1，得到纳米乳/凝胶复合物。充分搅拌后，将上述纳米乳/凝胶复合物缓慢滴入浓度为15％m/v的氯化钙水溶液，形成凝胶微丸。过滤洗涤后，40℃常压热风烘干24h，得到喜树碱结肠定位释药凝胶微丸。

实施例4喜树碱结肠定位释药凝胶微丸在水中的自乳化

分别取0.1-0.5g实施例1-3制备的喜树碱凝胶微丸置于10ml离心管中，加入ph7.4的磷酸盐缓冲液10ml，在37℃摇床中以100rpm的转速震荡24h，取释放液用蒸馏水稀释，微孔滤膜过滤，续滤液通过粒度测定仪测定纳米乳的平均粒径和多分散指数(pdi)。结果显示，本发明实施例1-3制备的喜树碱凝胶微丸释放介质上清液平均粒径为125.27±4.84nm，pdi值为0.487±0.007，与纳米制剂的粒径保持一致，说明，本发明所述的喜树碱凝胶微丸在释放介质中软化后，在释放介质中至少有部分药物以纳米乳的形式存在。

将上述续滤液滴在涂布了碳膜的铜网上，并用0.5％的磷钨酸水溶液进行染色，将涂布的网格置于室温条件下干燥，用tecnaig2场发射透射电子显微镜(tem)观察乳滴显微形态。结果如图1所示，包载喜树碱的凝胶微丸在释放液中呈现球形，分布均匀。在tem图像中观察到的粒径一部分在100nm左右，一部分在50nm左右，乳滴均匀性分散性好，颗粒间无杂质，背景清晰，其与激光粒度仪检测的粒径大小基本统一。

实施例5喜树碱结肠定位释药微丸的体外释放

分别取0.25-0.75g实施例1-3制备的喜树碱凝胶微丸置于盛有30ml释放介质的具塞广口瓶中，在37.0±0.5℃，100rpm条件下恒定持续震摇。在ph1.2盐酸溶液中释放2h后，立即将样品取出转移至ph6.8磷酸盐缓冲液中释放3h，然后转移至ph7.4磷酸盐缓冲液中释放19h，分别在各自的时间段收集0.7ml释放介质，同时补充等体积同温度的释放介质。在取出的释放介质中加入等体积的甲醇，混合均匀后在离心机中以12000rpm转速离心10min，取上清液用0.45μm有机系微孔滤膜过滤，取续滤液放入棕色进样瓶中，用高效液相色谱法测量释放介质中喜树碱浓度。

本发明实施例1-3制备的喜树碱结肠定位释药微丸在模拟消化液内的释放曲线如图2所示，喜树碱凝胶微丸中的喜树碱释放遵循异常运输机制，表明药物释放机制为扩散和溶胀/侵蚀相结合，体外释放2h释放20％，5h释放45％左右，24h释放80％以上，达到大部分于结肠释放的要求。

实施例6小鼠离体器官粘膜上的粘附性评价

昆明种小鼠，20-22g，禁食12h(可自由饮水)，颈椎处死后，立即解剖分离小鼠胃部，除去胃部内容物后，用生理盐水冲洗干净，随后泡于生理盐水之中，2h之内使用。将解剖得到的小鼠胃剖开后内侧朝上贴于提前标记的载玻片上。分别计数20个实施例1-3制备的喜树碱凝胶微丸，均匀置于胃粘膜上，将整个载玻片放入干燥器上层，密封干燥器30min后，取出载玻片，斜45°放置，将人工胃液(ph1.2的盐酸溶液)以20ml/min的恒定流速冲洗胃粘膜5min。目视计数粘附在胃粘膜上的喜树碱凝胶微丸，计算喜树碱凝胶微丸的黏附率(mr)，平行操作三组。小肠粘膜和结肠粘膜粘附率的测定操作同胃粘膜一致，不同之处在于冲洗时小肠粘膜使用模拟小肠液(ph6.8的磷酸缓冲液)，结肠粘膜使用模拟结肠液(ph7.4的磷酸盐缓冲液)。

本发明实施例1-3制备的喜树碱结肠定位释药微丸在离体小鼠胃肠粘膜上的粘附率如图3所示，喜树碱微丸的胃粘膜平均粘附率为11.67％，小肠粘膜粘附率为88.33％，结肠粘膜粘附率为98.33％。结果表明本发明制备的喜树碱结肠定位释药微丸在胃粘膜的粘附性很小，微丸在体内经过胃时被截留下来的较少，而在小肠末端和结肠部位大量滞留，可以达到较好的定位释放的效果。

实施例7喜树碱结肠定位释药凝胶微丸在大鼠体内的转运及释放

cy7为近红外荧光染料，常被应用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。其激发波长为747nm，发射波长为774nm，外观为绿黑色固体粉末。本实验通过将cy7替换喜树碱，按照实施例3制备方法，制备荧光标记的凝胶微丸。本实验用内径为2mm的聚乙烯管给禁食20h的sd大鼠灌胃cy7标记微丸若干粒，大鼠的麻醉方法为乙醚吸入麻醉，通过小动物活体成像技术观测荧光物质在大鼠胃肠道的转运和扩散情况，判断结肠定位微丸在大鼠胃肠道的释放情况。

载cy7纳米乳/微丸在sd大鼠的活体成像图如图4所示，在a组中，从2h的荧光图可以看出，微丸在胃内呈现聚集状态，很少扩散，荧光点集中，微丸有一部分开始向小肠转移；4h时可以看到荧光物质开始扩散；8h、12h时微丸基本到达结直肠部位，荧光强度逐渐降低(因此处有较厚的脂肪，影响荧光的观察)；b为12h时将大鼠解剖后观察到的荧光成像图，发现此时荧光物质扩散面积较大，主要分散在结肠部位，证明微丸大部分已经溶解。上述现象可以初步证明微丸基本可以达到结肠定位释放作用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。