Nav1.1激动剂在制备治疗自闭症的药物中的应用

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及compound4、luae98314这两种nav1.1激动剂在制备治疗自闭症的药物中的应用。

背景技术：

自闭症是一种广泛性认知障碍，其特征为社会交往障碍、交流障碍、兴趣狭窄和刻板重复的行为方式。自闭症是自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd)的一种，目前的发病原因还不十分明确，可能与遗传变异及环境因素相关。少部分asd的病例与单个基因中的突变相关(geschwind,d.h.,andlevitt,p.(2007).autismspectrumdisorders:developmentaldisconnectionsyndromes.curropinneurobiol17,103-111)。asd至今没有有效的治疗方法，临床上行为训练和康复方式的效果不确定。因此，深入研究自闭症模型小鼠的发病机制，研发针对关键功能改变的药物，对于自闭症患者的治疗具有重大意义。

突触后细胞粘附性分子3(neuroligin3，nl3)上的点突变(r451c位点突变)(jamain,s.,quach,h.,betancur,c.,rastam,m.,colineaux,c.,gillberg,i.c.(2003).mutationsofthex-linkedgenesencodingneuroliginsnlgn3andnlgn4areassociatedwithautism.natgenet,34(1),27-29.)和部分缺失(levy,d.,ronemus,m.,yamrom,b.,lee,y.h.,leotta,a.,kendall,j.,wigler,m.(2011).raredenovoandtransmittedcopy-numbervariationinautisticspectrumdisorders.neuron,70(5),886-897.)都与asds密切相关。nl3r451c位点敲入(knock-in，ki)小鼠表现为过度活跃，重复刻板及社交趋新行为障碍(tabuchi,k.,j.blundell,m.r.etherton,r.e.hammer,x.liu,c.m.powellandt.c.sudhof(2007)."aneuroligin-3mutationimplicatedinautismincreasesinhibitorysynaptictransmissioninmice."science318(5847):71-76.；etherton,m.,c.foldy,m.sharma,k.tabuchi,x.liu,m.shamloo,r.c.malenkaandt.c.sudhof(2011)."autism-linkedneuroligin-3r451cmutationdifferentiallyaltershippocampalandcorticalsynapticfunction."procnatlacadsciusa108(33):13764-13769.；rothwell,p.e.,m.v.fuccillo,s.maxeiner,s.j.hayton,o.gokce,b.k.lim,s.c.fowler,r.c.malenkaandt.c.sudhof(2014)."autism-associatedneuroligin-3mutationscommonlyimpairstriatalcircuitstoboostrepetitivebehaviors."cell158(1):198-212.)。

小清蛋白(parvalbumin，pv)阳性中间神经元是局部网络活动的强大调节者，是gamma振荡(30-80hz)产生的关键因素，其功能障碍会导致gamma振荡受损，从而影响认知功能，认知功能受损与多种神经精神疾病息息相关，比如asd(buzsaki,g.,andwang,x.j.(2012).mechanismsofgammaoscillations.annurevneurosci35,203-225)。

nav1.1是电压门控的钠通道亚单位，主要表达在中枢神经系统(catterall,w.a.(2017).fortyyearsofsodiumchannels:structure,function,pharmacology,andepilepsy.neurochemres42,2495-2504)。在脑内pv阳性的快速发放(fastspiking，fs)中间神经元中大量表达，控制膜去极化和动作电位的发放(ogiwara,i.,miyamoto,h.,morita,n.,atapour,n.,mazaki,e.,inoue,i.,takeuchi,t.,itohara,s.,yanagawa,y.,obata,k.,etal.(2007).nav1.1localizestoaxonsofparvalbumin-positiveinhibitoryinterneurons:acircuitbasisforepilepticseizuresinmicecarryinganscn1agenemutation.jneurosci27,5903-5914)。在编码nav1.1的scn1a基因突变中较多的病例是癫痫，如全身性癫痫伴高热惊厥伴发症(gefs+)。

目前尚没有批准上市或处于临床研究的nav1.1激动剂。可能是由于针对nav通道的治疗缺乏同形选择性，引起靶点以外的副作用。

技术实现要素：

本发明深入研究自闭症模型小鼠的发病机制，研发针对关键功能改变的药物，提供了compound4、luae98314这两种nav1.1激动剂在制备治疗自闭症的药物中的应用，对于自闭症患者的治疗具有重大意义。

本发明研究发现，并非所有的nav1.1激动剂都对自闭症治疗有明显效果，只是在本发明中被验证有效的compound4、luae98314这两种化合物刚好都是nav1.1激动剂。其中，compound4相比于luae98314，选择特异性更强，起效浓度低，并且可透过血脑屏障。当我们用30mg/kg的浓度腹腔注射小鼠一小时后，进行三厢社交行为检测，结果显示compound4可以显著改善ki小鼠的社交障碍。我们还进一步探索compound4拯救社交行为可能的机制，发现在急性离体脑片中，0.3μmcompound4就可以显著提高ki小鼠mpfc中pv阳性fs中间神经元的兴奋性到wt水平，表明compound4可能是通过提高pv阳性中间神经元的兴奋性，从而拯救自闭症模型小鼠的社交趋新缺陷，对于自闭症患者的治疗具有重大意义。

nav1.1激动剂在制备治疗自闭症的药物中的应用，所述nav1.1激动剂为compound4和/或luae98314；

所述compound4的结构如下式所示：

所述luae98314的结构如下式所示：

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种适用于治疗自闭症的药物，所述药物含有组分compound4和/或luae98314。在该药物中，compound4、luae98314作为治疗自闭症的活性组分。

本发明所述治疗自闭症的药物可为固体制剂或液体制剂，可以按照药学领域的常规生产方法制备，制成所需的剂型，制备过程中可加入药学上可接受的载体等，形式可以多样，如片剂、胶囊剂、口服液、小针、输液、软膏、冻干粉针、搽剂或栓剂等。

所述治疗自闭症的药物为经胃肠道给药剂型药物或非经胃肠道给药剂型药物，可以以单位剂量形式给药。作为外用药物不经胃肠道进行给药的方式包括注射给药，包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、穴位注射和皮下注射等。

所述治疗自闭症的药物还可包括药学上可接受的载体和/或辅剂。这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂等，填充剂如蔗糖、淀粉等；粘合剂如羟丙纤维素、淀粉浆等，湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等，吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂脂肪酸山梨坦、伯洛沙姆等。另外还可以在所述治疗自闭症的药物中加入其它辅剂如甜味剂、香味剂等。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明研究发现luae98314、compound4由于自身特殊结构，通过不同方式给药，都可以表现出对自闭症治疗的明显疗效，而aa43279虽然也是nav1.1激动剂且也能透过血脑屏障，但治疗效果却明显不佳，不具有应用前景。令人惊喜的是，本发明研究发现compound4选择特异性更强，起效浓度低，并且可透过血脑屏障，在治疗自闭症中具有显著效果。本发明对于自闭症患者的治疗具有重大意义。

附图说明

图1(a)、图1(d)分别为aa43279的结构和对不同电压门控钠通道的响应；图1(b)、图1(e)分别为luae98314的结构和对不同电压门控钠通道的响应；图1(c)、图1(f)分别为compound4的结构和对不同电压门控钠通道的响应；

图2表示aa43279、luae98314和compound4对成年ki小鼠社交趋新行为缺陷的不同作用；其中(a)手术埋置给药套管脑区位置示意图，以及aa43279套管给药实验社交拯救效果检测的流程图；(b-c)显示aa43279可以轻微改善ki小鼠的社交趋新缺陷，(b)图为社交性的差异指数，(c)图为社交趋新的差异指数；(d)手术埋置给药套管脑区位置示意图，以及luae98314套管给药实验社交拯救效果检测的流程图；(e-f)显示luae98314可以拯救ki小鼠的社交趋新缺陷，(e)图为社交性的差异指数，(f)图为社交趋新的差异指数；(g)腹腔注射compound4一小时后用三厢社交检测拯救效果的流程图；(h-i)显示compound4可以拯救ki小鼠的社交趋新缺陷，(h)图为社交性的差异指数，(i)图为社交趋新的差异指数。柱子中的数值代表小鼠只数，*p<0.05，**p<0.01，统计方法：one-wayanova，数据表示方法：平均值±s.e.m.；

图3表示aa43279、luae98314和compound4对成年ki小鼠pv阳性fs中间神经元兴奋性的不同影响；其中(a-b)脑片预孵30μmaa43279三十分钟后，记录的成年小鼠fs中间神经元兴奋性，(a)图为wt小鼠上记录的动作电位发放的点线图(左)和去极化方波刺激产生的动作电位总数的直方图(右)，(b)图为ki小鼠上记录的动作电位发放的点线图(左)和去极化方波刺激产生的动作电位总数的直方图(右)；(c-d)脑片预孵30μmluae98314三十分钟后，记录的成年小鼠fs中间神经元兴奋性，(c)图为wt小鼠上记录的动作电位发放的点线图(左)和去极化方波刺激产生的动作电位总数的直方图(右)，(d)图为ki小鼠上记录的动作电位发放的点线图(左)和去极化方波刺激产生的动作电位总数的直方图(右)，*p<0.05，**p<0.01，统计方法：双尾t-test；(e)脑片预孵0.3μmcompound4三十分钟后，记录的成年小鼠fs中间神经元动作电位发放的点线图(左)和去极化方波刺激产生的动作电位总数的直方图(右)，4组数据均分别各来自3对同窝生小鼠，*p<0.05，统计方法：one-wayanova。数据表示方法：平均值±s.e.m.。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明选择了三种nav1.1激动剂进行实验。aa43279化学式为c12h12n2o2s，cas号为354812-16-1，分子量为248.30，可透过血脑屏障。luae98314化学式为c21h23n5o3s，cas号为849000-18-6，分子量为425.50，不能够透过血脑屏障。compound4化学式为c24h23f3n4o，cas号为2332897-85-3，分子量为440.46，可透过血脑屏障。aa43279、luae98314和compound4的结构和对不同电压门控钠通道的响应如图1所示。aa43279对nav1.1有较高响应的同时对nav1.5、nav1.6也有较高响应，对nav1.2有一定的响应。luae98314在更低的浓度下就可以对nav1.1有较高响应，但对nav1.5也有较高的响应，对nav1.2有一定的响应。compound4在较luae98314更低的浓度下就可以对nav1.1有较高的响应，对nav1.3有一定响应，特异性更高。本发明采用腹腔注射(30mg/kg)的方式探索aa43279、luae98314对于自闭症模型小鼠社交行为的影响，结果发现腹腔注射aa43279、luae98314并不能改善ki小鼠的社交趋新缺陷，其原因可能是luae98314本身不能够透过血脑屏障，而aa43279虽然可透过血脑屏障，但在30mg/kg的低浓度下并不能起效。基于此，我们采用手术埋置给药套管的方式，探索aa43279、luae98314对于自闭症模型小鼠社交行为的影响(图2a-f)。手术后恢复一周，再进行三厢社交实验检测。对照组中，局部脑区注射对照溶剂半小时后，ki小鼠与wt鼠相比社交能力是正常的，但是社交趋新存在异常，即不能够很好地区分熟悉鼠和陌生鼠，保留了缺陷表型即排除了手术可能对社交行为产生影响(图2b-c和e-f)。aa43279给药半小时后，并不影响wt小鼠的社交性和社交趋新，但是改善ki小鼠的社交趋新缺陷，但不明显(图2b-c)。luae98314给药半小时后，并不影响wt小鼠的社交性和社交趋新，但是可以显著改善ki小鼠的社交趋新缺陷(图2e-f)。但考虑到其不能透过血脑屏障，增大了递送难度，很大程度地限制了其成药性。本发明采用同样腹腔注射(30mg/kg)的方式，探索compound4对于自闭症模型小鼠社交行为的影响(图2g-i)。在三厢社交实验对照组中，ki小鼠与wt鼠相比社交能力是正常的，但是社交趋新存在异常(图2h-i)。compound4给药一小时后，并不影响wt小鼠的社交性和社交趋新，但是可以显著改善ki小鼠的社交趋新缺陷(图2h-i)。可见，compound4的给药方式更加便捷，更有应用前景。

本发明还进一步探索了nav1.1激动剂拯救社交行为可能的机制。

为了标记pv阳性中间神经元，我们利用了pv-cre/ai14小鼠品系，因此荧光标记的神经元均是pv阳性的fs中间神经元。通过将nl3r451cki小鼠与pv-cre/ai14小鼠杂交来产生带有荧光标记的小鼠，所有的电生理实验都是采用这种小鼠。

制备300μm厚度的mpfc急性离体脑片，用于脑片电生理记录。我们向fs中间神经元注入递增的去极化电流，再比较相同去极化条件下，wt和ki小鼠fs中间神经元发放动作电位的个数。fs中间神经元先经电流钳将vh维持在-70mv，然后给予150pa到600pa的去极化方波电流刺激，每个方波的持续时间是500ms，每次递增50pa。脑片孵育30μmaa43279后开始记录，结果显示aa43279对wt和ki小鼠pv阳性fs中间神经元兴奋性均没有显著影响(图3a-b)。脑片孵育30μmluae98314后开始记录，结果显示luae98314对wt小鼠pv阳性fs中间神经元兴奋性没有影响，而ki小鼠中pv阳性fs中间神经元的兴奋性明显提高(图3c-d)。同样方法进行电生理记录比较compound4的作用。在control组中，与wt小鼠相比，成年ki小鼠中fs中间神经元动作电位发放个数显著减少(图3e)。脑片孵育0.3μmcompound4后开始记录，结果显示compound4可以使ki小鼠中pv阳性fs中间神经元的兴奋性恢复到wt水平(图3e)，并且使用浓度远小于luae98314。由此可见，虽然luae98314、compound4都能将ki小鼠中pv阳性fs中间神经元的兴奋性恢复到wt水平，但要实现相同的效果，luae98314的用量远远大于compound4(luae98314用量为compound4用量的100倍)。相比之下，aa43279虽然有改善的趋势，但治疗效果明显差于luae98314、compound4。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。