一种具有抗冠状病毒活性的化合物IMB-PA1及其应用

一种具有抗冠状病毒活性的化合物imb-pa1及其应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种具有抗冠状病毒活性的化合物imb-pa1及其应用。


背景技术：

2.冠状病毒感染可引起呼吸道、胃肠道及神经系统疾病，是人类健康的切实威胁。近二十年来全球已陆续暴发三次严重的冠状病毒感染事件，即2002年的严重急性呼吸综合征(sars)，2012年的中东呼吸综合征(mers)以及近期由新型冠状病毒(sars-cov-2)引发的covid-19
1.。全球疫情扩散已严重阻碍了社会和经济的发展，研发安全有效的抗冠状病毒药物刻不容缓
2.。目前冠状病毒的传播仍在持续，且冠状病毒变异性强，难以使宿主形成持续性免疫，这使得冠状病毒感染可能逐渐成为一种常态。然而现阶段仍缺乏针对冠状病毒的抗病毒特效药物，临床上仍以联合传统抗病毒药物和对症治疗的方式为主，治疗效果有待确证
3.。因此开发针对冠状病毒的特效药物已成为全球公共健康领域的重大课题。
3.冠状病毒属巢病毒目，冠状病毒科，冠状病毒亚科。根据血清学及基因组序列的特点，冠状病毒可分为α、β、γ、δ四个属，其中β属可进一步分为a、b、c、d四个亚群
4.。冠状病毒广泛存在于自然界，是引起脊椎动物多种疾病的主要病原体之一。不同冠状病毒在物种间的易感性不同。α和β属冠状病毒主要感染哺乳动物，而γ和δ属冠状病毒主要感染禽鸟类。到目前为止可感染人的冠状病毒共有7种，分别为α属的hcov-229e和hcov-nl63；β属a亚群的hcov-oc43和hcov-hku1；β属b亚群的sars-cov和sars-cov-2以及β属c亚群的mers-cov
5.。这几种病毒可引起不同程度的人急性呼吸道疾病，可发展为肺炎，其中，由sars-cov、mers-cov和sars-cov-2引起的疫情以其强烈的传染性和高致死性而著称。
4.天然产物是新型抗病毒药物的重要来源。天然产物结构多样，来源广泛，从中寻找新型药物的先导化合物具有重要价值。如三萜类化合物甘草酸二胺在体外可有效抑制sars-cov的复制
6.。微生物次级代谢产物因具备活性好、成药性强、资源可及等优点而具有较大的开发前景，相关研究陆续被报道。如海洋来源的微生物次级代谢产物trypilepyrazinol、aspergillipeptides d和asteltoxins e等具有良好的广谱抗病毒活性
7.。伊维菌素、可利霉素等大环内酯类化合物被报道具有抗sars-cov-2的活性
[8-9]
。基因组学、代谢组学等组学技术和合成生物学技术的迅猛发展，为天然来源尤其是微生物来源的新型抗冠状病毒药物先导化合物的发现奠定了良好基础
[10]
。
[0005]
我们以测定样品抑制病毒引起细胞病变的程度进行抗普通冠状病毒活性筛选，获得活性化合物若干，经过一系列抗冠状病毒的药效学研究，确定阳性化合物imb-pa1(杀粉蝶菌素a1)可较好地抑制hcov-229e和hcov-oc43的复制。imb-pa1为本实验室前期通过pcsk9转录抑制剂筛选模型在一株链霉菌发酵液粗提物样品中发现的一个pcsk9小分子抑制剂，具有潜在的心血管疾病治疗作用
[11]
。因此imb-pa1可能通过参与调控脂代谢影响冠状病毒的复制，相关机制研究仍在进行中。
[0006]
[参考文献]
[0007]
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技术实现要素：

[0018]
本发明涉及式(1)所示化合物在制备药物中的应用，所述的药物为抑制冠状病毒的药物。
[0019][0020]
优选的，所述的冠状病毒为人冠状病毒；
[0021]
更优选的，所述的冠状病毒为人α属冠状病毒、人β属冠状病毒。
[0022]
最优选的，所述的冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、sars-cov-2。
[0023]
一种治疗冠状病毒的药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的式(1)化合物，以及必要的药用辅料。
附图说明
[0024]
图1、imb-pa1在不同细胞上的毒性测定。
[0025]
图2、imb-pa1对huh7及huh7.5细胞中冠状病毒hcov-229e np mrna水平的影响。
[0026]
图3、imb-pa1对hcov-229e在huh7细胞复制过程中dsrna产生的影响。
[0027]
图4、imb-pa1对c3a细胞中冠状病毒hcov-oc43 np mrna水平的影响。
[0028]
图5、imb-pa1对c3a细胞中冠状病毒hcov-oc43 np蛋白水平的影响。
[0029]
图6、imb-pa1作用于冠状病毒的时间进程实验。
具体实施方式
[0030]
实验材料
[0031]
1、细胞株和病毒
[0032]
人肝癌细胞c3a(atcc，crl-10741)，本实验室保存。
[0033]
人肝癌细胞huh7，本实验室保存。
[0034]
人肝癌细胞huh7.5，本实验室保存。
[0035]
非洲绿猴肾细胞vero e6(atcc，crl-1586)，本实验室保存。
[0036]
人冠状病毒hcov-229e(atcc，vr-740)，本实验室保存。
[0037]
人冠状病毒hcov-oc43(atcc，vr-1558)，本实验室保存。
[0038]
人冠状病毒sars-cov-2南非变异株，从广东省疾病控制中心获得。
[0039]
2、化合物
[0040]
阳性对照药利巴韦林(ribavirin，rbv)注射液购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，批号为31712252，规格为100mg/ml；阳性对照药瑞德西韦(remdesivir，rdv)购自medchemexpress公司，货号hy-104077。
[0041]
3、反转录-定量pcr(reverse transcription quantitative pcr，rt-qpcr)引物
[0042]
f＝forward primer，r＝reverse primer，p＝probe，np＝nucleocapsid protein
[0043][0044]
4、抗体
[0045]
冠状病毒np抗体(小鼠单克隆抗体，mab9013，millipore)，
[0046]
gapdh抗体(小鼠单克隆抗体，zb2305，中杉金桥)，
[0047]
抗dsrna抗体(小鼠单克隆抗体j2，scicons)，
[0048]
fitc(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)标记山羊抗小鼠igg(h+l)(hs211，全式金)。
[0049]
实施例1、化合物imb-pa1的细胞毒性测定
[0050]
首先通过cck-8法检测了imb-pa1在多个浓度下给药48h对不同细胞存活率的影响，以明确化合物可能存在的细胞毒性。如图1所示，imb-pa1浓度在26.7μm以下时，给药48h后三种肝癌细胞(huh7、huh7.5和c3a)的存活率均在对照组的80％以上，细胞状态良好。利用reed-muench公式计算药物的半数有毒浓度tc
50
，imb-pa1对huh7、huh7.5和c3a细胞的tc
50
分别是26μm、77μm和65μm，表示化合物对上述三种细胞的毒性较低(图1)。
[0051]
实施例2、imb-pa1抗α属冠状病毒hcov-229e活性测定
[0052]
1、细胞病变效应(cytopathic effect，cpe)法测定抗hcov-229e活性
[0053]
(1)实验以huh7和huh7.5细胞为宿主，细胞接种于96孔培养板，在5％co2，37℃环境中培养约24h；
[0054]
(2)用含2％fbs及1％p/s的mem培养液梯度稀释imb-pa1，得到8个剂量的样品。
[0055]
(3)以100tcid
50
的hcov-229e病毒液感染细胞，感染同时加入含有不同稀释度的样品，同时设置细胞对照孔和病毒对照孔，于5％co2，35℃培养48h左右。待病毒对照组病变程度(cpe)达4+时观察各组细胞病变程度，应用reed-muench公式分别计算样品对细胞的半数有毒浓度(tc
50
)和对病毒的半数抑制浓度(ic
50
)，同时计算选择指数(si＝tc
50
/ic
50
)。
[0056]
cpe评价标准：以细胞死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％～100％)、3+(细胞死亡比例50％～75％)、2+(细胞死亡比例25％～50％)、1+(细胞死亡比例0～25％)、0+(细胞全部存活)。
[0057]
结果如表1所示，imb-pa1在huh7及huh7.5细胞上都有较好的抑制hcov-229e活性，优于阳性对照药rbv。
[0058]
表1 cpe法测定imb-pa1在huh7和huh7.5细胞中抗hcov-229e活性
[0059][0060]
2、imb-pa1在rna水平抑制冠状病毒hcov-229e
[0061]
对imb-pa1的体外抗冠状病毒hcov-229e的药效进行评价。首先检测了imb-pa1对hcov-229e np的mrna水平的影响(图2)。
[0062]
以moi＝0.035的病毒载量感染huh7及huh7.5细胞，感染同时以三个浓度的imb-pa1或200μm阳性药rbv给药，24h后提取rna并进行rt-qpcr检测。如图2a、b所示，imb-pa1在huh7和huh7.5细胞中均能剂量依赖性地降低hcov-229e np的mrna的水平，且在huh7细胞上的抗病毒活性优于huh7.5。
[0063]
随后通过免疫荧光实验检测imb-pa1对hcov-229e双链rna(double strand rna，dsrna)的影响(图3)。
[0064]
以moi＝0.035的病毒载量感染huh7细胞，同时加入不同浓度的imb-pa1或阳性药rbv，置35℃培养24h后，清洗细胞，加入4％多聚甲醛室温孵育15min进行固定，清洗后用含0.5％triton x-100的pbs缓冲液室温孵育20min透化细胞，清洗后加入含1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)的tbst缓冲液室温封闭1h。随后加入抗dsrna抗体，置于4℃孵育过夜或室温孵育1h。清洗细胞后加入fitc荧光标记二抗，室温避光孵育1h。最后加入染核液(hoechst 33342)室温孵育10-30min，通过荧光显微镜观察病毒dsrna的水平并拍照。如图3所示，imb-pa1对hcov-229e在huh7细胞复制过程中dsrna的产生同样具有抑制作用。这表示imb-pa1对α属冠状病毒hcov-229e rna的复制具有良好的抑制作用。
[0065]
实施例3、imb-pa1抗β属冠状病毒hcov-oc43活性测定
[0066]
1、imb-pa1在rna水平抑制hcov-oc43
[0067]
检测了imb-pa1对c3a细胞中冠状病毒hcov-oc43 np mrna水平的影响(图4)。以moi＝0.023的病毒载量感染c3a细胞，感染同时加入梯度浓度的imb-pa1或200μm阳性药rbv，于24h后提取rna并进行rt-qpcr检测。结果表明imb-pa1在c3a细胞中可剂量依赖性地降低hcov-oc43 np mrna的水平。
[0068]
2、imb-pa1在蛋白水平抑制hcov-oc43
[0069]
为了进一步验证化合物对hcov-oc43的抑制效果，检测了imb-pa1对冠状病毒hcov-oc43 np蛋白水平的影响(图5)。以moi＝0.023的病毒载量感染c3a细胞，同时加入梯度浓度的imb-pa1或200μm阳性药rbv，于24h后检测病毒np的表达水平。如图所示，imb-pa1对hcov-oc43具有很好的抑制作用，可剂量依赖性地抑制病毒的核衣壳蛋白的表达，且化合物在浓度为4nm时对hcov-oc43 np蛋白的抑制效果已与200μm阳性药产生的效果相当。
[0070]
实施例4、imb-pa1抗sars-cov-2活性测定
[0071]
通过cpe法检测imb-pa1抗sars-cov-2的活性。以vero e6细胞为病毒宿主，在37℃培养过夜后弃培养液，以sars-cov-2南非变异株(moi＝0.05)感染细胞，感染同时用不含fbs的dmem培养基稀释药物并加入96孔培养板，感染1h后弃去培养液，将以2％fbs的dmem培养基按浓度梯度稀释的药物加入96孔培养板继续培养，待病毒对照组cpe达4+时观察各组细胞病变程度。结果表明imb-pa1对sars-cov-2南非变异株具有抑制活性。
[0072]
表2 cpe法测定imb-pa1在vero e6细胞中抗sars-cov-2活性
[0073][0074]
实施例5、imb-pa1作用于冠状病毒感染的早期阶段
[0075]
为了初步确定imb-pa1作用于冠状病毒复制周期中的阶段，在c3a细胞中通过时间进程分析实验进行研究。在hcov-oc43(moi＝0.28)感染c3a细胞后的不同时间点加入20μm imb-pa1，通过免疫荧光检测病毒核衣壳蛋白的表达水平(图6)。结果显示在感染病毒的同
时加药对病毒的抑制效果最为明显，在感染1h至4h后给药均具有较好的抗病毒作用，而在感染5h及以后给药所产生的抗病毒效果大大减弱。这提示imb-pa1可能作用于冠状病毒感染的早期阶段。
[0076]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。