苦豆子提取物生物碱类化合物sophalineH的制备方法及应用与流程

苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h的制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h的制备方法及应用。


背景技术：

2.结直肠癌(crc)是世界上常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(international agency for research on cancer，iarc)报告指出，结直肠癌发病率位于肺癌、乳腺癌之后居恶性肿瘤第3位，死亡率位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。结直肠癌发病地域分布在世界范围内有显著差异性，欧美区域发病率较亚洲地区更高。中国的crc发生率为29人/10万人，死亡率为14人/10万人。但随着物质生活水平的不断提高，生活方式的改变，特别是饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率呈现逐渐上升的趋势。相比之下，欧美国家因较早的开展结直肠癌筛查，近20年来结直肠癌的发病率和病死率却明显下降。与欧美国家人相比较，中国人结直肠癌呈现“三高一低”的特点：1、结肠癌的发病率稍低于直肠癌，但近几年结肠癌发病率呈上升趋势；2、低位直肠癌所占比例较高；3、青年人比例很高约占10％
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15％；4、早期筛查就诊率低。
3.目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，逐渐认识到结直肠癌的发生与发展是多基因共同作用，多个信号通路参与而引起的“炎症
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增生
‑
癌变”的演变过程。国内外研究发现，k
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ras的基因突变、dna分子的甲基化及胰岛素样生长因子是促进crc发生发展的重要原因。随着对crc病因的不断研究，与其发病的相关高危因素逐渐被认识，如长期高脂摄入、亚硝酸盐化合物食物摄入、维生素缺乏、长期酗酒等饮食因素；溃疡性结肠炎、结肠腺瘤、家族性腺瘤性息肉病(fap)等被认为是癌前性病变的疾病；年龄增大(＞60岁)及家族遗传等因素都是crc的高危因素。
4.目前结直肠癌患者的治疗手段主要是外科手术治疗，化学药物治疗，放射线放射治疗。其中外科手术目前是结直肠癌治疗最重要、最有效的手段，放疗与化疗已成为结直肠癌辅助治疗的重要组成部分。与此同时，靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对crc患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(vegf)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(egfr)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。
5.苦豆子(sophora alopecuroides l.)别名苦豆根、苦甘草、布亚(维吾尔语)等，隶属于豆科槐属。广泛分布于西亚及中亚地区，我国主要分布于西北一带。作为一种传统中药，苦豆子具有清热燥湿、止痛、杀虫之功效。植物学研究表明苦豆子的主要成分为生物碱类和黄酮类化合物，尤其是其中的生物碱类成分是其特征性成分。现代药理学研究发现，苦
豆子中的生物碱具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和镇痛等作用。临床用于治疗乙型肝炎、细菌性痢疾、肠炎、妇科霉菌性炎症、宫颈糜烂、抗菌消炎等症。在对苦豆子生物碱类成分的研究过程中，我们发现化合物sophaline h具有较好的抑制肺癌细胞增殖活性。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h的制备方法及应用。本发明首次发现中药材苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h具有明显的抗肿瘤活性，具有制备预防或治疗结直肠癌及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，且药物制剂的制备方法简单，成本低，成药经济效益好。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.生物碱类化合物sophaline h在制备抗结直肠癌疾病药物中的应用。
9.所述的应用，其特征在于所述sophaline h显著抑制结直肠癌细胞hct
‑
116和lovo的增殖。
10.所述的应用，其特征在于所述sophaline h显著抑制结直肠癌细胞hct
‑
116迁移、侵袭和克隆，促进结直肠癌细胞hct
‑
116的凋亡。
11.所述的应用，其特征在于所述sophaline h显著抑制huvec血管的形成。
12.生物碱类化合物sophaline h的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
13.(1)称取干燥的苦豆子种子粉碎后，用10倍重量的95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏；
14.(2)将所得浸膏分散于水中，用1％的盐酸调ph到3，并加入氯仿，充分萃取后弃去有机层，剩下的水层用2％的氨水调ph到8，再用氯仿萃取得苦豆子总碱；
15.(3)将苦豆子总碱混悬于水中后，上d101大孔树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱后得水部位、40％乙醇部位、65％乙醇部位和95％乙醇部位；
16.(4)将95％乙醇部位经ods柱分析，采用甲醇：水系统梯度洗脱，得到5个馏分fr.1
‑
fr.5，将fr.5部分再经制备型高效液相，采用乙腈：水：二乙胺系统，纯化后得到生物碱类化合物sophaline h。
17.所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中甲醇：水为30:70
‑
100:0。
18.所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中乙腈：水：二乙胺为35:65:0.01。
19.生物碱类化合物sophaline h添加辅料制备得到用于治疗结直肠癌疾病的药物制剂。
20.所述的药物制剂，其特征在于所述辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇
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4000、聚乙二醇
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6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、交联聚维酮、微粉硅胶、氢化植物油、滑石粉、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、碳酸氢纳、枸橼酸、羧甲基淀粉钠、中一种或一种以上。
21.所述的药物制剂，其特征在于所述制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
22.本发明的有益效果是：
23.1、本发明首次发现苦豆子及提取物生物碱类化合物sophaline h具有明显的抗肿瘤活性，具有制备预防或治疗结直肠癌及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗结
直肠癌创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。
24.2、本发明的苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h成本低、污染小，有利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。
25.3、本发明通过研究苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h对结直肠癌细胞hct
‑
116，lovo的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用，有力证明了本发明的苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h对肿瘤细胞具有明显的抑制和致亡作用。
26.4、本发明的苦豆子或苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h还具有祛风除湿、舒筋活血等功效，可用于风湿性关节炎、跌打损伤、瘀积肿痛、产后风瘫等症，可以在用于预防或治疗肿瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。
27.5、苦豆子可以与其他药材进行配伍组成复方药用于预防或治疗肿瘤，还可以将苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂，这些制剂较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。
附图说明
28.图1为生物碱sophaline h化合物化学结构式；
29.图2为生物碱sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
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116，lovo增殖的影响作用，其中a为sophaline h化合物在不同作用时间下对结直肠癌细胞hct
‑
116增殖影响，b为sophaline h化合物在不同作用时间下对结直肠癌细胞lovo增殖影响；
30.图3为生物碱sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116凋亡影响作用，其中a为sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116凋亡影响，b为凋亡统计；
31.图4为生物碱sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116迁移和侵袭的影响作用，其中a为sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116迁移和侵袭影响，b为迁移统计，c为侵袭统计；
32.图5为生物碱sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116克隆形成的影响作用，其中a为sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116克隆形成影响，b为克隆统计；
33.图6为生物碱sophaline h化合物对结直肠癌细胞hct
‑
116血管形成的影响作用，其中a为sophaline h化合物对huvec细胞血管形成影响，b为血管长度统计，c为血管百分比统计，d为血管连接长度统计。
具体实施方式
34.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
35.实施例1：苦豆子提取物生物碱类化合物sophaline h的提取
36.(1)称取干燥的苦豆子种子(30kg)粉碎后，用10倍重量的95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(1.9kg)。
37.(2)将所得浸膏分散于水中，用1％的盐酸调ph到3，并加入氯仿，充分萃取后弃去有机层。剩下的水层用2％的氨水调ph到8，再用氯仿萃取得苦豆子总碱(897g)。
38.(3)将苦豆子总碱混悬于水中后，上d101大孔树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱后得水部位(302g)、40％乙醇部位(317g)、65％乙醇部位(177g)和95％乙醇部位(35g)。
39.(4)将95％乙醇部位再经ods柱分析，采用甲醇：水(30:70
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100:0)系统梯度洗脱，得到5个馏分(fr.1
‑
fr.5)。fr.5部分再经制备型高效液相(乙腈：水：二乙胺＝35:65:0.01)纯化后得到化合物sophaline h，化合物结构如图1所示。
40.实施例2：生物碱类化合物sophaline h可以显著抑制结直肠癌细胞hct
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116，lovo的增殖
41.1.将结直肠癌细胞hct
‑
116，lovo以5
×
103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；
42.2.加入不同浓度梯度(100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm)的化合物分别培养24小时、48小时、72小时；
43.3.每孔加入20μl的mtt工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
44.4.弃培养板中的上清，加入150μldmso(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。
45.如图2所示，不同浓度的sophaline h化合物可以显著抑制结直肠癌细胞hct
‑
116，lovo的增殖，并且随着作用时间的增加，化合物抑制结直肠癌细胞细胞增殖的作用也更为显著。
46.实施例3:生物碱类化合物sophaline h可以促进结直肠癌细胞hct
‑
116的凋亡
47.1.将结直肠癌细胞hct
‑
116以5
×
105个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，培养24h，然后饥饿过夜；
48.2.加入不同浓度梯度(25μm，50μm)的化合物培养48小时；
49.3.先将上清收集到离心管中，再用不含edta的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管。500g左右离心5分钟，沉淀细胞；
50.4.用预冷的pbs洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；
51.5.加入100μl预冷的1
×
annexinv binding buffer，重悬细胞；
52.6.加入5μl annexinv
‑
fitc和5μl pi，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；
53.7.加入400μl预冷的1
×
annexinv binding buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。
54.如图3所示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，sophaline h化合物可以明显促进结直肠癌细胞hct
‑
116发生凋亡。
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p<0.01与对照组相比较。
55.实施例4：生物碱类化合物sophaline h可以显著抑制结直肠癌细胞hct
‑
116的迁移和侵袭
56.1.transwell上室种2
×
105个细胞，加入不同浓度梯度(25μm，50μm)的化合物培养24小时；
57.2.下室加入800μl含有10％fbs的培养基；
58.3.用pbs洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
59.4.用pbs洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；
60.5.用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照。
61.图4显示，通过实验发现，随着作用浓度的升高，sophaline h化合物可以明显抑制结直肠癌细胞hct
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116迁移和侵袭。
**
p<0.01与对照组相比较。
62.实施例5：生物碱类化合物sophaline h可以显著抑制结直肠癌细胞hct
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116的体外克隆形成能力
63.1.将结直肠癌细胞hct
‑
116以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，培养10天，然后饥饿过夜；
64.2.加入不同浓度梯度(25μm，50μm)的化合物作用24h；
65.3.pbs洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
66.4.用pbs洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；
67.5.用pbs洗3次，显微镜拍照。
68.如图5所示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，sophaline h化合物可以明显抑制结直肠癌细胞hct
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116克隆形成。
**
p<0.01与对照组相比较。
69.实施例6：生物碱类化合物sophaline h可以显著抑制huvec血管形成能力
70.1.先用matrigel铺板24孔板过夜；
71.2.将huvec细胞以5
×
104个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度(25μm，50μm)的化合物培养6h；
72.3.用pbs洗3次，显微镜拍照。
73.如图6所示，随着作用浓度的升高，sophaline h化合物可以明显抑制huvec血管形成。
**
p<0.01与对照组相比较。
74.本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。