一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法与流程

1.本发明涉及食蟾虫加工领域，特别是涉及一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法。


背景技术：

2.原发性肝癌(primarylivercancer)是世界上第五常见的恶性肿瘤，在肿瘤相关死亡的原因中位列第四，每年约有84万的新发病例，其中，肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是其重要是组织学类型(占其75％
‑
85％)，具有高侵袭性和高致死率的特点，早期肝癌多采取手术切除，但肝癌切除术后5年复发率仍高达70％，且大多数患者于术后2年内复发，不可切除的肝细胞癌(hcc)患者通常接受多激酶抑制剂索拉非尼或轮伐替尼，然而药物耐药及不良反应使得患者的生存获益受限，近年来，以免疫检查点抑制剂(icis)为代表的免疫治疗取得了很大进展，然而hcc生物学行为的异质性导致仅有25％的患者产生持久的治疗反应，尽管其他治疗方式如消融治疗、经导管肝动脉化疗栓塞术(tace)也取得了很大进展，但高的复发率使得hcc患者5年生存率仅有18％。
3.索拉菲尼是晚期hcc的一线用药，也可通过抑制systemxc
‑
进而导致gsh耗竭诱导铁死亡来治疗肝细胞癌，但由于其耐药性的存在，仅有部分肝癌患者能从中获益。如何更好的提高索拉非尼的疗效，改善索拉非尼耐药造福更多的肝癌患者是当下需要解决的一个问题。
4.由于很多脂溶性药物活性成分难溶于水，导致其生物利用度较低，有效血药浓度维持时间较短，毒副副反应大，脂质体给药系统具有缓释性和靶向性等优点，其良好的给药效果受到了人们的广泛关注。


技术实现要素：

5.针对上述情况，本发明之目的在于提供一种食蟾虫脂质体的制备方法，直接用木香、老鹰、食蟾虫和鳕鱼子为主要原料制备成的食蟾虫脂质体，所制备的食蟾虫脂质体与索拉非尼联合使用，能有效提高索拉非尼的疗效，改善肝细胞癌对索拉非尼的耐药性，减少复发率。
6.其解决的技术方案是：一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法，由以下步骤制备：s1，将老鹰茶、木香粉碎研磨，过100目筛，加入乙醇溶液，室温浸泡2
‑
3h后，400w微波40
‑
60min，8000
‑
10000r/min离心10
‑
15min，取上清液，过滤，浓缩，冷冻干燥，然后研磨成粉末，过300目筛，得提取物；s2，将食蟾虫、鳕鱼子用流水清洗干净，晾干，打浆均匀，加入维生素e、胆固醇搅拌均匀，得浆液；s3，向提取物中加入浆液、乙醇，12
‑
16khz超声30
‑
40min，减压抽滤，得滤液，将滤液减压除去乙醇后，再加入磷酸盐缓冲液，32
‑
35℃下水化成脂质体溶液，利用鳕鱼子中的卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、卵磷脂以脂质体的形式包裹老鹰茶和木香粉提取物以及食蟾虫中的活性药物成分，然后将脂质体溶液加入挤出装置的料筒中，然后通过压力泵压入到
挤出管道内，通过电机带动齿轮使脂质体溶液反复通过滤膜，得到粒径较小并均匀的脂质体混悬液，将得到脂质体混悬液在喷雾或冷冻保护剂作用下，直接喷雾或冷冻干燥，得到粉状食蟾虫脂质体；进一步的，所述的挤出装置包括料筒，料筒通过压力泵压连通挤出管道，挤出管道内设有pc滤膜和不锈钢微孔滤板，挤出管道内还设有不规则齿轮圈，不规则齿轮圈与挤出管道外部的圆形齿轮齿合，圆形齿轮连接电机，通过电机带动齿轮使脂质体溶液反复通过滤膜。
7.进一步的，步骤s1中所述的老鹰茶:木香:乙醇溶液的质量体积比为：100
‑
120g:80
‑
100g:600
‑
1000ml；所述的乙醇溶液的浓度为70
‑
80%。
8.进一步的，步骤s2中所述的食蟾虫:鳕鱼子:维生素e:胆固醇的质量体积比为：30
‑
50g:100
‑
150g:2
‑
5g:2.2
‑
3.6g。
9.进一步的，步骤s3中所述的提取物:浆液:乙醇:磷酸盐缓的质量体积比为：10
‑
15g:150
‑
200ml:120
‑
150ml:50
‑
80ml；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/l，ph为7.4。
10.进一步的，所述的挤出装置包括料筒，料筒通过压力泵连通料筒左侧的挤出管道，挤出管道为圆形，挤出管道左部设有开口，挤出管道内部设有过滤片，过滤片位于挤出管道右部，过滤装置由pc滤膜和不锈钢微孔滤板组成，pc滤膜贴不锈钢微孔滤板，挤出管道内套设有不规则齿轮圈，不规则齿轮圈开口180
°
并与挤出管道圆心相同，不规则齿轮圈的两端设有密封圈，密封圈与挤出管道内部相贴合，不规则齿轮圈通过挤出管道的开口与位于挤出管道左侧的圆形齿轮齿合，圆形齿轮齿合上设有电机，电机带动圆形齿轮齿，圆形齿轮齿带动不规则齿轮圈贴合挤出管道向过滤片作往复转动，挤出管道上还设有出气口和可开封，料筒、挤出管道、电机下面设有底板；所述滤片的孔径为0.5um。
11.进一步的，所制得的粉状食蟾虫脂质体，通过加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、助流剂和包囊材料等辅料制成片剂、胶囊剂，用于口服。
12.进一步的，所述的粉状食蟾虫脂质体与索拉非尼联合使用用于治疗肝细胞癌。
13.木香，味辛苦性温，归脾、胃、大肠、三焦、胆经，具有行气止痛的功效，含有木香烃内酯和去氢木香内酯两种有效成分，诱导癌细胞凋亡，从而抑制癌细胞增殖。
14.老鹰茶，具有解毒消肿、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效，老鹰茶总黄酮为其活性部位，主要成分为槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷、槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖苷、山奈酚
‑3‑
o
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷、山奈酚
‑3‑
o
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖苷和山奈酚
‑3‑
o
‑
a
‑
l
‑
鼠李糖苷这五种黄酮苷类，其在降血糖、抗炎、抗氧化、免疫调节等方面均具有显著预防和治疗作用。
15.鳕鱼子，鳕鱼籽富含卵黄蛋白、卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、dha、epa、卵磷脂、维生素等营养。
16.五谷虫，药味咸性寒、无毒，内服用于治疗小儿疳积、疳疮，含生物碱、油脂、蛋白质及氨基酸，具有较好的抗肿瘤作用；蟾蜍，味辛性凉，有毒，能够破症结，行水湿，化毒，杀虫，定痛。蟾蜍内含有蟾毒色胺、华蟾素等，治疔疮，发背，阴疽瘰疬，恶疮，症瘕癖积，臌胀，水肿，小儿疳积，慢性气管炎，能够抑制癌细胞的生长增殖。食蟾虫，苍蝇产卵于蟾蜍尸体产卵食蟾肉而得的幼虫，除五谷虫本身具有的降血脂功、清热消滞的功效外，还具有蟾蜍的有效活性成分，具有抗菌抗病毒抗炎化毒药效，且安全系数较蟾蜍高。
17.由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点；
1.本发明通过将木香和老鹰茶联合提取，并与食蟾虫和鳕鱼子的浆液混合超声，最终通过挤出装置得到粉状食蟾虫脂质体，利用鳕鱼子中的卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、卵磷脂以脂质体的形式包裹活性药物能有效延长药物释放时间，提高活性药物利用率，同时利用鳕鱼子中的dha、木香中的木香烃内酯、老鹰茶中的多种黄酮、以及食蟾虫兼具五谷虫和蟾蜍二者活性成分联合索拉非尼从多种抑制方式共同抑制肝细胞癌的生长繁殖；2.本发明中一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法中所涉及的挤出装置通过圆形齿轮和不规则齿轮圈联动的方式反复将脂质体溶液通过过滤片，最终得到的粉状食蟾虫脂质体粒径较小并均匀，操作简单，省时省力；3.通过本发明的一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法所制备的食蟾虫脂质体粉末联合索拉非尼对耐药肝细胞癌具有加强治疗效果，15天抑瘤率达54.5%。
附图说明
18.图1为本发明一种挤出装置结构俯视图。
具体实施方式
19.有关本发明的前述及其他技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图1对实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。以下实施例中所提到的结构内容，均是以说明书附图为参考。
20.实施例1一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法，由以下步骤制备：s1，将老鹰茶100g、木香80g粉碎研磨，过100目筛，加入70%乙醇溶液600ml，室温浸泡2h后，400w微波40min，8000r/min离心10min，取上清液，过滤，浓缩，冷冻干燥，然后研磨成粉末，过300目筛，得提取物；s2，将食蟾虫30g、鳕鱼子100g用流水清洗干净，晾干，打浆均匀，加入维生素e 2g、胆固醇2.2g搅拌均匀，得浆液；s3，向提取物10g中加入浆液150ml、乙醇120ml，12khz超声30min，减压抽滤，得滤液，将滤液减压除去乙醇后，再加入0.01mol/l，ph为7.4的磷酸盐缓冲液50ml，32℃下水化成脂质体溶液，利用鳕鱼子中的卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、卵磷脂以脂质体的形式包裹老鹰茶和木香粉提取物以及食蟾虫中的活性药物成分，然后将脂质体溶液加入挤出装置的料筒中，然后通过压力泵压入到挤出管道内，通过电机带动齿轮使脂质体溶液反复通过滤膜，得到粒径较小并均匀的脂质体混悬液，将得到脂质体混悬液在喷雾保护剂作用下，直接喷雾干燥，得到粉状食蟾虫脂质体。所得粉状食蟾虫脂质体粒径为0.5um；所述的食蟾虫由本公司研发自制。
21.如图1所示，所述的挤出装置包括料筒2，料筒2通过压力泵4连通料筒2左侧的挤出管道3，挤出管道3为圆形，挤出管道3左部设有开口306，挤出管道3内部设有过滤片301，过滤片301位于挤出管道3右部，过滤片301由pc滤膜和不锈钢微孔滤板组成，pc滤膜贴不锈钢微孔滤板，挤出管道3内套设有不规则齿轮圈304，不规则齿轮圈304开口180
°
并与挤出管道3圆心相同，不规则齿轮圈304的两端设有密封圈305，密封圈305与挤出管道3内部相贴合，不规则齿轮圈304通过挤出管道3的开口306与位于挤出管道3左侧的圆形齿轮5齿合，圆形
齿轮5齿合上设有电机6，电机6带动圆形齿轮5齿，圆形齿轮5齿带动不规则齿轮圈304贴合挤出管道3向过滤片301作往复转动，挤出管道3上还设有出气口302和出料口303，料筒2、挤出管道3、电机6下面设有底板1；所述过滤片301的孔径为0.5um。
22.实施例2一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法，由以下步骤制备：s1，将老鹰茶110g、木香90g粉碎研磨，过100目筛，加入75%乙醇溶液800ml，室温浸泡2.5h后，400w微波50min，9000r/min离心12min，取上清液，过滤，浓缩，冷冻干燥，然后研磨成粉末，过300目筛，得提取物；s2，将食蟾虫40g、鳕鱼子125g用流水清洗干净，晾干，打浆均匀，加入维生素e 3.5g、胆固醇2.9g搅拌均匀，得浆液；s3，向提取物13g中加入浆液165ml、乙醇135ml，14khz超声30
‑
40min，减压抽滤，得滤液，将滤液减压除去乙醇后，再加入0.01mol/l，ph为7.4的磷酸盐缓冲液65ml，33℃下水化成脂质体溶液，利用鳕鱼子中的卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、卵磷脂以脂质体的形式包裹老鹰茶和木香粉提取物以及食蟾虫中的活性药物成分，然后将脂质体溶液加入挤出装置的料筒中，然后通过压力泵压入到挤出管道内，通过电机带动齿轮使脂质体溶液反复通过滤膜，得到粒径较小并均匀的脂质体混悬液，将得到脂质体混悬液在冷冻保护剂作用下，直接冷冻干燥，得到粉状食蟾虫脂质体。所得粉状食蟾虫脂质体粒径为0.5um；所述的食蟾虫由本公司研发自制。
23.实施例3一种用于肝癌的食蟾虫脂质体的制备方法，由以下步骤制备：s1，将老鹰茶120g、木香100g粉碎研磨，过100目筛，加入80%乙醇溶液1000ml，室温浸泡3h后，400w微波60min， 10000r/min离心15min，取上清液，过滤，浓缩，冷冻干燥，然后研磨成粉末，过300目筛，得提取物；s2，将食蟾虫50g、鳕鱼子150g用流水清洗干净，晾干，打浆均匀，加入维生素e 5g、胆固醇3.6g搅拌均匀，得浆液；s3，向提取物15g中加入浆液200ml、乙醇150ml， 16khz超声30
‑
40min，减压抽滤，得滤液，将滤液减压除去乙醇后，再加入0.01mol/l，ph为7.4的磷酸盐缓冲液80ml， 35℃下水化成脂质体溶液，利用鳕鱼子中的卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白、卵磷脂以脂质体的形式包裹老鹰茶和木香粉提取物以及食蟾虫中的活性药物成分，然后将脂质体溶液加入挤出装置的料筒中，然后通过压力泵压入到挤出管道内，通过电机带动齿轮使脂质体溶液反复通过滤膜，得到粒径较小并均匀的脂质体混悬液，将得到脂质体混悬液在喷雾保护剂作用下，直接喷雾干燥，进一步除去溶剂，得到粉状食蟾虫脂质体。所得粉状食蟾虫脂质体粒径为0.5um；所述的食蟾虫由本公司研发自制。
24.对比例1将实施例1中食蟾虫脂质体的制备步骤中食蟾虫去掉，其余成分不变，得粉状脂质体。
25.对比例2将实施例1中食蟾虫脂质体的制备步骤中木香去掉，其余成分不变，得粉状脂质体。
26.对比例3将实施例1中食蟾虫脂质体的制备步骤中老鹰茶去掉，其余成分不变，得粉状脂质体。
27.对比例4将实施例1中食蟾虫脂质体的制备步骤中“鳕鱼子”改为“蛋黄卵磷脂”，其余成分不变，得粉状脂质体。
28.试验例1肝癌hepg2细胞置于dmem培养液(含10％灭活的胎牛血清、100u
·
ml
‑1青霉素和100mg
·
l
‑1链霉素)中，37℃、5％co2孵箱中培养。取对数生长期的细胞，以3
×
103/孔的密度接种于96孔/组
×
6组孔板，每孔100μl，在37℃、5％co2饱和湿度条件下培养24h。试验设阴性对照组(培养液)、给药组：对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组，给药组，每组培养孔分别加入对应的脂质体干粉(浓度为3.0mg/l)，37℃、5％co2饱和湿度孵箱内培养48h后，每孔加入mtt液(5g/l)20μl，培养4h后，离心，吸弃培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪570nm波长处测od值，按下列公式计算细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率/％＝100
‑
(给药组od值
‑
空白对照od值)/(对照组od值
‑
空白对照od值)
×
100；采用相同的方法，改变加入脂质体干粉的浓度，测试ic50(细胞增殖50％抑制时药物浓度)值由数学方法计算所得；数据以`x
±
sem表示，采用t检验或方差分析进行统计学处理，如表1：从表1结果可见，相比于对比例1
‑
4，实施例1所制备的粉状食蟾虫脂质体，能明显抑制肝癌hepg2细胞的生长增殖，抑制作用具有浓度依赖性。相比于对比例1
‑
4，粉状食蟾虫脂质体的ic50值最低，表明粉状食蟾虫脂质体的体外抗肿瘤作用最强。
29.试验例2粉状食蟾虫脂质体对索拉非尼耐药肝癌的体内的治疗作用评价采用浓度梯度递增法构建肝癌hepg2
‑
索拉非尼耐药细胞株,以浓度为0.5μmol/l的索拉非尼作为起始浓度进行诱导肝癌hepg2细胞,逐步进行浓度爬坡,每次爬坡浓度约提高1.5倍,每14d爬坡1次,最终得到稳定的能耐受4μmol/l索拉非尼的hepg2
‑
索拉非尼耐药细胞株。hepg2
‑
索拉非尼耐药细胞株培养在含有0.2μmol/l索拉非尼的培养液以维持其耐药性；
将hepg2
‑
索拉非尼耐药细胞置于dmem培养液(含10％灭活的胎牛血清、100u
·
ml
‑1青霉素和100mg
·
l
‑1链霉素)中，37℃、5％co2孵箱中培养。雄性balb/c裸鼠(6周龄)，饲养于无特殊病原体条件下。取对数生长期的细胞，用pbs制成细胞悬液，每鼠右后背部接种0.2ml(2
×
107个)。待肿瘤长至100mm3(1周左右)时，小鼠随机分为4组，每组8只，每天分别腹腔灌胃；对照组：0.9％生理盐水、实施例1组：实施例1的粉状食蟾虫脂质体配制的悬浮液（1.5mg/kg）、索拉非尼组：市购的索拉非尼配制成的溶液（0.2mg/kg）、联合组：实施例1的粉状食蟾虫脂质体配制的悬浮液（1.2mg/kg）+市购的索拉非尼配制成的溶液（0.1mg/kg）。自给药物开始，每5天观察小鼠饮食、活动及体质量等一般状况，用圆规和游标卡尺测量瘤块的最长径和与其垂直的短径，按照公式：v(mm3)＝(长径
×
短径2)/2计算瘤体积。15天后，用戊巴比妥钠麻醉过量致死，完整剥离瘤体并称重，计算抑瘤率，肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重
‑
给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重
×
100％。数据以x
±
sem表示，采用t检验或方差分析进行统计学处理，如表2：从表2可以看出：给药前，三组的肿瘤体积没有明显差异。但15天时，对照组小鼠肿瘤生长迅速，肿瘤体积平均达到4123.5
±
857.4mm3；比较而言，实施例1组和联合组可显著性降低肿瘤的生长，肿瘤体积分别为2421.1
±
497.2、1876.1
±
348.9mm3，而索拉非尼单独用药效果相对较差，肿瘤体积为3175.3
±
668.4 mm3。实施例1组、索拉非尼组、联合组的抑瘤率分别为41.3％、23.0％、54.5%，粉状食蟾虫脂质体联合索拉非尼具有更强的抗肿瘤作用。此外，通过小鼠体重的监测和肺、肝脏和肾脏的毒性观察，表明此剂量的粉状食蟾虫脂质体无明显的毒性。
30.以上所述是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施仅局限于此；对于本发明所属及相关技术领域的技术人员来说，在基于本发明技术方案思路前提下，所作的拓展以及操作方法、数据的替换，都应当落在本发明保护范围之内。