一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法

1.本发明涉及医疗领域，尤其涉及一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法。


背景技术：

2.腰椎间盘退变性疾病是下腰痛的主要原因，在现代社会极为常见，80％的人一生中曾经历过下腰痛，是成人劳动力丧失的第3位原因。全球每年有570多万人被诊断患有该病，其中以45～64岁之间发病率最高(4.6/100人)，且随年龄增长有明显上升的趋势，造成了沉重的社会负担。然而椎间盘退变目前尚无有效的靶向性治疗措施。
3.髓核细胞是椎间盘重要的组成细胞，髓核细胞衰老在椎间盘退变过程中发挥着重要作用，因此明确椎间盘退变中髓核细胞衰老的具体机制，对于治疗和预防椎间盘退变有着重要意义。
4.非编码rna在调控细胞生理活动及病理变化中发挥重要作用，葡萄牙里斯本大学药物分子研究所(instituto de medicinamolecular，imm)的研究人员发现操纵单一rna分子就能逆转细胞衰老(原文检索：
5.silencing ofthe lncrnazeb2-nat facilitates reprogramming ofaged fibroblasts and safeguards stem cell pluripotency)。因此探索椎间盘退变过程中非编码rna在髓核细胞衰老中的调控作用及机制，并通过相应的干预策略，可明确通过非编码rna的靶向可否缓解椎间盘中髓核细胞的衰老。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，以解决上述技术问题。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，所述方法为：干预非编码rna norad。
9.优选的是，所述干预非编码rnanorad的方法具体为：利用tnfα处理正常的髓核细胞。
10.本发明具有以下有益效果：
11.1、通过实验证明椎间盘退变中髓核细胞衰老伴有norad表达水平降低，抑制正常细胞中的norad的表达，会促进髓核细胞衰老，在衰老髓核细胞中过表达norad，可以抑制髓核细胞衰老；
12.2、首次提出以干预非编码rnanorad来抑制间盘退变中髓核细胞衰老，并通过实验加以证明，具有很强的现实意义。
附图说明
13.图1是正常和退变的髓核组织二代测序结果分析图。
14.图2是利用tnfα处理后的髓核细胞norad的表达量图。
15.图3是荧光实验证实ttnfα处理后的髓核细胞norad的表达量图。
16.图4是组织学fish实验证实ttnfα处理后的髓核细胞norad的表达量图。
17.图5是髓核细胞衰老的指标对比图。
18.图6是荧光实验证实ttnfα处理后的髓核细胞norad的表达量图。
具体实施方式
19.以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
20.本发明可以有许多不同的形式实施，而不应该理解为限于在此阐述的实施例，相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的。
21.如图1所示，在实施本实施例前，从正常人和病变病人取出正常和退变的髓核组织储存在rnalater保存液中，然后用组织剪剪碎，体积平均小于1cm3，离心后加入0.4％二型胶原酶37度消化5小时，制备单细胞悬液，然后1200rpm离心5分钟后，利用trizol提取说明步骤提取髓核细胞中的rna，提取后的rna进行建库，然后进行二代测序，然进行上机扩增，比对，以及分析等。分析在正常组和退变组中存在差异且最为明显的非编码rna，具体rna提取和测序过程皆为本领域较常见手段，为本领域人员所熟知，故在本实施中不在赘述。如图1所示，测序发现非编码rnanorad存在的差异最为明显:测序结果显示，退变的髓核细胞中norad的表达量显著低于正常组的髓核细胞。
22.如图2所示，在实施例1中，可利用20um的人源性tnfα处理正常的髓核细胞48h作为髓核细胞衰老的造模方式，发现tnfα(肿瘤坏死因子，英文名称：tumornecrosis factor；tnf，主要由活化的单核/巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬，抗感染，引起发热，诱导肝细胞急性期蛋白合成，促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。)处理后的衰老的髓核细胞中，norad的表达量显著降低。说明在衰老的髓核细胞中，norad变化与退变的人组织标本中髓核细胞的变化是一致的。
23.如图3所示，在实施例2中，利用rna scop实验，根据acd的rnascop试剂盒说明，进行rnascop实验。首先将种植在细胞爬片上的细胞在4％的多聚甲醛中固定半小时，然后利用pbs清洗3次，每次5分钟。其次用0.5％triton加入细胞中对细胞进行通透20分钟，然后0.5％tbst清晰3次，每次5分钟。然后利用免疫荧光封闭液进行封闭30分钟，后用吸水纸吸干封闭液，加入norad荧光探针4度封闭过夜。第二天利用tbst将爬片避光清洗3次，然后滴上含有dapi的荧光防淬灭剂后在荧光显微镜下进行观察。将norad染成红色，细胞核染成蓝色，利用荧光亮度进一步证实在tnfα处理后的衰老的髓核细胞中，norad的表达量显著降低。
24.如图4所示，在实施例3中，利用组织学fish实验，取新鲜的髓核组织即刻在组织杂交固定液中固定30分钟，然后进行组织切片制片，其次用0.5％triton加入细胞中对组织进行通透20分钟，然后0.5％tbst清晰3次，每次5分钟。然后利用免疫荧光封闭液进行封闭30分钟，后用吸水纸吸干封闭液，加入norad荧光探针4度封闭过夜。第二天利用tbst将玻片组织避光清洗3次，然后滴上含有dapi的荧光防淬灭剂后在荧光显微镜下进行观察。在正常和退变的髓核组织中将norad染成红色，细胞核染成蓝色，利用荧光亮度进一步证实在退变的髓核组织中的髓核细胞里，norad的表达量显著降低。
25.如图5所示，在实施例4中，在正常的髓核细胞和tnfα处理后的衰老髓核细胞中，分别构建norad的过表达质粒和基因敲减慢病毒进行细胞转染，达到抑制和过表达norad基因的水平的目的。慢病毒转染前18-24小时，将髓核细胞以1
×
105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2
×
105/孔左右。
26.第二天，用含有6μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。转然后48小时候，通过荧光显微镜观察病毒转染效率。然后通过westernblot实验检测基因过表达或敲减的水平，以及检测细胞衰老相关的指标，发现正常髓核细胞中抑制norad，髓核细胞会自发性衰老，在衰老的髓核细胞中，过表达norad使其表达水平恢复后，髓核细胞衰老的情况会被抑制(图5中p21和p16是衰老相关指标)。
27.由上述实施例分析可知，椎间盘退变中髓核细胞衰老伴有norad表达水平降低，抑制正常细胞中的norad的表达，会促进髓核细胞衰老，在衰老髓核细胞中过表达norad，可以抑制髓核细胞衰老，因此可通过干预非编码rnanorad来抑制间盘退变中髓核细胞衰老，以实现对相关疾病的预防，具有很强的现实意义。
28.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。