抗氧化的组合物及其制备方法和护肤品与流程

1.本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种抗氧化的组合物及其制备方法和护肤品。


背景技术：

2.皮肤的衰老随年龄的增长而凸显，而生活水平的提高让人们越来越关注皮肤的保养。研究发现，氧化应激是导致皮肤衰老的一个重要因素，由于机体活性氧成分与抗氧化系统之间平衡失调而引起过多的过氧化物与自由基产生，对细胞造成损害，导致了衰老的发生。
3.皮肤真皮中最重要的细胞成分是成纤维细胞，如果能提高成纤维细胞的抗氧化能力，则能减缓皮肤衰老。但是，目前通过提高成纤维细胞的抗氧化能力来减缓皮肤衰老的产品并不常见，而且效果也不佳。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种抗氧化的组合物，该抗氧化的组合物能通过提高成纤维细胞的抗氧化能力来有效减缓皮肤衰老。
5.此外，还提供了一种抗氧化的组合物的制备方法和护肤品。
6.一种抗氧化的组合物，包括白细胞提取物和富血小板血浆。
7.上述抗氧化的组合物包括白细胞提取物和富血小板血浆，白细胞提取物富含核苷酸，富血小板血浆富含多种生长因子，并且具有抑制氧化应激的作用，通过将这两者结合，充分利用这两者的结合优势，明显提高抗氧化的能力，增强成纤维细胞的抗氧化能力效果好，能有效减缓皮肤衰老。
8.在其中一个实施例中，白细胞提取物的制备包括以下步骤：
9.将含有抗凝剂的血液在500g～1000g条件下离心5min～20min，得到分为上清层、中间白细胞层及下层红细胞层的混合液；
10.将上述上清层、中间白细胞层和靠近中间白细胞层的下层红细胞层在500g～1000g条件下离心5min～10min，吸出白细胞层，制备白细胞；及
11.裂解上述白细胞，制得白细胞提取物。
12.在其中一个实施例中，在吸出白细胞层的步骤之后，还包括以下步骤：
13.将上述白细胞层与蒸馏水混合后在500g～1000g条件下离心2min～5min，弃上清，反复如此离心5次以上，制得纯化后的白细胞。
14.在其中一个实施例中，采用反复冻融的方式裂解白细胞。
15.在其中一个实施例中，在裂解白细胞的步骤之后，还包括以下步骤：将裂解得到的裂解物在500g～1000g条件下离心5min～10min，收集上清，然后经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，制得白细胞提取物。
16.在其中一个实施例中，富血小板血浆的制备包括以下步骤：
endothelial growth factor，vegf)等，并且具有抑制氧化应激的作用，通过将这两者结合，充分利用这两者的结合优势，明显提高抗氧化的能力，增强成纤维细胞的抗氧化能力效果好，能有效减缓皮肤衰老。
33.在其中一个实施例中，白细胞提取物的制备包括步骤a1、步骤a2及步骤a3，具体地：
34.步骤a1：将含有抗凝剂的血液在500g～1000g条件下离心5min～20min，得到分为上清层、中间白细胞层及下层红细胞层的混合液。
35.在一个可选的具体示例中，步骤a1中的离心力为500g、600g、800g或1000g。进一步地，步骤a1中的离心力为600g～1000g。更进一步地，步骤a1中的离心力为800g～1000g。
36.在一个可选的具体示例中，步骤a1中的离心时间为5min、10min、15min或20min。进一步地，步骤a1中的离心时间为10min～20min。更进一步地，步骤a1中的离心时间为10min～15min。
37.步骤a2：将步骤a1中的上清层、中间白细胞层和靠近中间白细胞层的下层红细胞层在500g～1000g条件下离心5min～10min，吸出白细胞层，制备白细胞。
38.在一个可选的具体示例中，步骤a2中的离心力为500g、600g、800g或1000g。进一步地，步骤a2中的离心力为500g～800g。更进一步地，步骤a2中的离心力为500g～600g。
39.在一个可选的具体示例中，步骤a2中的离心时间为5min、6min、8min或10min。进一步地，步骤a2中的离心时间为6min～10min。更进一步地，步骤a2中的离心时间为8min～10min。
40.在其中一个实施例中，在吸出白细胞层的步骤之后，还包括以下步骤：将上述白细胞层与3ml～5ml蒸馏水混合后在500g～1000g条件下离心2min～5min，弃上清，反复如此离心5次以上，制得纯化后的白细胞。可选地，上述白细胞层与蒸馏水混合后离心的步骤中，离心力为500g～800g，离心时间为3min～5min。进一步地，上述白细胞层与蒸馏水混合后离心的步骤中，离心力为500g～600g，离心时间为4min～5min。
41.上述将白细胞层与3ml～5ml蒸馏水混合，目的是为了裂解混合物中的红细胞，红细胞无核而白细胞有核，两者渗透压不一样，故可利用蒸馏水短时间裂解红细胞，再通过反复离心洗涤去除裂解后的红细胞，得到纯化的白细胞。可以理解的是，裂解红细胞的方式不限于上述，还可以是其他方式，如通过红细胞裂解液处理，红细胞裂解液的一种配方如下：150mmol/l nh4cl，10mmol/l khco3，0.1mmol/l na2edta，溶于水。
42.步骤a3：裂解步骤a2得到的白细胞，制得白细胞提取物。
43.在其中一个实施例中，采用反复冻融的方式裂解白细胞。采用反复冻融的方式裂解白细胞可以使蛋白活性成分不易降解，充分发挥活性作用，提高抗氧化能力。可以理解的是，裂解白细胞的方式不限于上述，还可以是其他方式，例如超声裂解，超声功率为600w～1000w，超声时间为5min～10min。
44.在其中一个实施例中，在裂解白细胞的步骤之后，还包括以下步骤：将裂解得到的裂解物在500g～1000g的条件下离心5min～10min，收集上清，然后经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，制得白细胞提取物。进一步地，将裂解得到的裂解物在500g～800g的条件下离心6min～8min，收集上清。
45.上述裂解物在离心后经0.22μm无菌滤膜过滤，目的是去除细菌和其他颗粒物杂
质，保证白细胞提取物的纯度。
46.在其中一个实施例中，富血小板血浆的制备包括步骤b1、步骤b2及步骤b3，具体地：
47.步骤b1：将含有抗凝剂的血液在500g～1000g条件下离心5min～20min，得到分为上清层、中间白细胞层及下层红细胞层的混合液。
48.在一个可选的具体示例中，步骤b1中的离心力为500g、600g、800g或1000g。进一步地，步骤b1中的离心力为600g～1000g。更进一步地，步骤b1中的离心力为800g～1000g。
49.在一个可选的具体示例中，步骤b1中的离心时间为5min、10min、15min或20min。进一步地，步骤b1中的离心时间为10min～20min。更进一步地，步骤b1中的离心时间为10min～15min。
50.在其中一个实施例中，抗凝剂为3.2％(w/v)～3.8％(w/v)的柠檬酸钠。
51.在其中一个实施例中，抗凝剂为3.2％(w/v)、3.5％(w/v)或3.8％(w/v)的柠檬酸钠。
52.以上述两种浓度的柠檬酸钠作为抗凝剂可以防止血小板被破坏，保证血小板的质量，由此制得的富血小板血浆能够有效提高抗氧化能力。
53.步骤b2：将步骤b1中的上清层、中间白细胞层和靠近中间白细胞层的下层红细胞层在500g～1000g条件下离心5min～10min，得到血浆混合液，吸弃血浆混合液的上部三分之二、白细胞层和红细胞层，得到剩余液体。
54.在一个可选的具体示例中，步骤b2中的离心力为500g、600g、800g或1000g。进一步地，步骤b2中的离心力为500g～800g。更进一步地，步骤b2中的离心力为500g～600g。
55.在一个可选的具体示例中，步骤b2中的离心时间为5min、6min、8min或10min。进一步地，步骤b2中的离心时间为6min～10min。更进一步地，步骤b2中的离心时间为8min～10min。
56.在其中一个实施例中，步骤b2的离心容器为15ml离心管，靠近中间白细胞层的下层红细胞层为红细胞上部1mm～2mm部分，在此部分中，仍含有部分血小板，留取此部分能够保证血小板的损失率更小，得到的富血小板血浆中血小板含量更高。可以理解的是，在其他实施方式中，取下层红细胞层的多少需要根据离心管的直径做适应性调整。
57.步骤b3：将步骤b2得到的剩余液体与凝血酶和氯化钙混合，4℃过夜，在500g～1000g条件下离心5min～10min，收集上清，制得富血小板血浆。
58.在一个可选的具体示例中，步骤b3中的离心力为500g、600g、800g或1000g。进一步地，步骤b3中的离心力为600g～1000g。更进一步地，步骤b3中的离心力为800g～1000g。
59.在一个可选的具体示例中，步骤b3中的离心时间为5min、6min、8min或10min。进一步地，步骤b3中的离心时间为6min～10min。更进一步地，步骤b3中的离心时间为8min～10min。
60.加入凝血酶和氯化钙能够激活血小板，使血小板释放多种生长因子，制备激活后的富血小板血浆。同时，4℃过夜能使血小板的生长因子充分释放至血浆中，提高富血小板血浆的生长因子的浓度。
61.在其中一个实施例中，白细胞与血小板的数量比为1:30～1:10。
62.白细胞提取物和富血小板血浆的比例也会影响其抗氧化能力，在此比例下的白细
胞提取物和富血小板血浆混合液提高抗氧化能力的效果更好。在一个可选地具体示例中，白细胞提取物和富血小板血浆的数量之比为1:10、1:15、1:20或1:30。
63.本技术一实施方式还提供了一种上述抗氧化的组合物的制备方法，包括步骤c1、步骤c2、步骤c3、步骤c4和步骤c5。
64.步骤c1：将含有抗凝剂的血液在500g～1000g条件下离心5min～20min，得到分为上清层、中间白细胞层及下层红细胞层的混合液。
65.具体地，步骤c1中的离心力和离心时间与在描述上述抗氧化的组合物时的相应步骤对应，此处不再赘述。
66.步骤c2：将步骤c1中的上清层、中间白细胞层和靠近中间白细胞层的所述下层红细胞层在500g～1000g条件下离心5min～10min，得到血浆混合液，吸弃血浆混合液的上部三分之二，吸出白细胞层，制备白细胞，吸弃红细胞层，得到剩余液体。
67.具体地，步骤c2中的离心力和离心时间与在描述上述抗氧化的组合物时的相应步骤对应，此处不再赘述。
68.步骤c3：裂解步骤c2得到的白细胞，制得白细胞提取物。
69.具体地，步骤c3中的裂解白细胞和制备白细胞提取物的方式与在描述上述抗氧化的组合物时的相应步骤对应，此处不再赘述。
70.步骤c4：将步骤c2得到的剩余液体与凝血酶和氯化钙混合，4℃过夜，在500g～1000g条件下离心5min～10min，收集上清，制得富血小板血浆。
71.具体地，步骤c4中的离心力和离心时间与在描述上述抗氧化的组合物时的相应步骤对应，此处不再赘述。
72.步骤c5：将步骤c3制得的白细胞提取物与步骤c4制得的富血小板血浆混合，制备抗氧化的组合物。
73.具体地，步骤c5的白细胞提取物与富血小板血浆的比例与在描述上述抗氧化的组合物时的相应步骤对应，此处不再赘述。
74.上述抗氧化的组合物的制备方法的白细胞提取物和富血小板血浆通过同一血液样品同时制得，上述抗氧化的组合物的制备方法能充分利用资源，又能节约步骤和时间，而且制得的组合物抗氧化的效果好。可以理解的是，在其他实施方式中，白细胞提取物和富血小板血浆还可以通过不同血液样品分别制得。
75.此外，本技术一实施方式还提供了一种护肤品，包括上述抗氧化的组合物或上述抗氧化的组合物的制备方法制得的抗氧化的组合物。
76.上述护肤品，通过添加上述抗氧化物的组合物，能够有效提高皮肤成纤维细胞抗氧化能力，减缓皮肤衰老。
77.具体实施例
78.以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
79.实施例1
80.1.采集血液
81.采集血液后注入含有抗凝剂(3.8％w/v柠檬酸钠)的15ml离心管中，其中抗凝剂和血液的体积比为1:9。
82.2.制备富血小板血浆
83.1)第一次离心：将步骤1中得到的抗凝剂和血液的混合液在1000g的条件下离心10min，得到分为上清层、中间白细胞层和下层红细胞层的混合液。
84.2)第二次离心：将上述的上清层、中间白细胞层和下层红细胞层上方1mm～2mm吸出于新的15ml离心管中，然后在500g的条件下离心10min。将得到的混合液，吸弃上清层，吸出白细胞层至新的离心管中，吸弃红细胞层，剩余约占总体积的10％的液体，制得富血小板血浆。
85.3)血小板激活：将富血小板血浆转移至含有凝血酶(500u/ml，溶解于0.9％氯化钠溶液中)及0.25mol/l氯化钙的促凝管中，置于4℃冰箱过夜使血凝块充分收缩后，在1000g的条件下离心10min，上清液为后续可用的富血小板血浆。
86.3.制备白细胞提取物
87.1)除去红细胞：在上述步骤2第2)步中得到的白细胞层加入3ml蒸馏水在500g条件下离心5min，经过5次如此反复离心至溶液无肉眼可见的红色，即得到白细胞悬液。
88.2)裂解白细胞：调整上述白细胞悬液中白细胞的浓度为5
×
106个/ml，转移至15ml离心管中，从室温转移至液氮，通过反复冻融3次将白细胞裂解。
89.3)收集白细胞提取物：将上述裂解的白细胞在500g条件下离心8min，收集上清，经0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液，获得白细胞提取物。
90.4.制备富血小板血浆和白细胞提取物混合液
91.将上述步骤2制得的富血小板血浆和步骤3制得的白细胞提取物完全混合，制得富血小板血浆和白细胞提取物混合液。
92.5.富血小板血浆和白细胞提取物混合液抗氧化能力检测
93.1)将p3代的人皮肤成纤维细胞接种于细胞培养板中，密度为1.2
×
104个/cm2，设置三个复孔，培养温度为37℃，co2的体积百分浓度为5％。
94.2)在dmem高糖培养基(ge，hyclone，sh30022.01)中加入富血小板血浆和白细胞提取物的混合液，形成成纤维细胞实验培养基。其中，dmem高糖培养基与混合液的体积比为99:1，即富血小板血浆和白细胞提取物的混合液总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的1％。
95.3)检测各孔中的人成纤维细胞的细胞外和细胞内的超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)和过氧化氢酶(cat)的活性。其中，细胞外酶活性检测的样本为各培养基上清；细胞内酶浓度检测样本为通过机械裂解获得的细胞裂解液，通过bca法检测各蛋白浓度，均一化后再进行细胞内酶活性的对比。sod、gsh
‑
px和cat活性及bca蛋白浓度检测试剂均购自南京建成生物工程研究所有限公司。结果如表1所示。
96.实施例2
97.本实施例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基与混合液的体积比为98:2，即富血小板血浆和白细胞提取物的混合液总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的2％。
98.本实施例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
99.实施例3
100.本实施例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基与混合液的体积比为95:5，即富血小板血浆和白细胞提取物的混合液总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的5％。
101.本实施例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
102.实施例4
103.本实施例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基与混合液的体积比例为90:10，即富血小板血浆和白细胞提取物的混合液总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的10％。
104.本实施例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
105.对比例1
106.本对比例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基中没有添加富血小板血浆和白细胞提取物的混合液，dmem高糖培养基即作为成纤维细胞实验培养基。
107.本对比例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
108.对比例2
109.本对比例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基中只添加富血小板血浆，形成成纤维细胞实验培养基。其中dmem高糖培养基培养基与富血小板血浆的体积比为95:5，即富血小板血浆总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的5％。
110.本对比例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
111.对比例3
112.本对比例制备的抗氧化的组合物的步骤与实施例1的步骤大致相同，其不同在于：步骤5的第2)步中，dmem高糖培养基中只添加白细胞提取物，形成成纤维细胞实验培养基。其中dmem高糖培养基与白细胞提取物的体积比为95:5，即白细胞提取物总体积占成纤维细胞实验培养基总体积的5％。
113.本对比例的抗氧化组合物的抗氧化效果如表1所示。
114.表1
[0115][0116]
表1是各实施例和对比例中的人成纤维细胞的细胞外和细胞内的超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)和过氧化氢酶(cat)的活性检测结果。
[0117]
从表1中可知，与对比例1相比，在培养基中加入的不同比例的富血小板血浆与白细胞提取物的混合液(实施例1～4)均不同程度地提高人成纤维细胞的细胞外和细胞内的sod、gsh
‑
px和cat活性；且2％、5％和10％混合液对人成纤维细胞的抗氧化能力的促进效果显著；10％与5％混合液对成纤维细胞抗氧化能力提高的效果相似，基于成本考虑，5％体积浓度更优。
[0118]
与对比例2和对比例3相比，在添加的体积浓度均为5％的情况下，添加富血小板血浆和白细胞的混合液提高人成纤维细胞的细胞外和细胞内的sod、gsh
‑
px和cat活性的程度，均远高于单独添加富血小板血浆或白细胞提取物的情况。
[0119]
综上所述，本发明通过在人成纤维细胞培养基中添加一定比例的白细胞提取物与富血小板血浆混合液，能够有效增加人成纤维细胞的细胞内和细胞外的抗氧化能力相关酶活性，提高人成纤维细胞的抗氧化能力，添加到护肤品中，能够有效地减缓皮肤衰老。
[0120]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0121]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。