靶向CD19和CD20的联合嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，更具体而言，涉及靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

1、血液系统恶性肿瘤约占人类恶性肿瘤的10％，95％的血液系统恶性肿瘤源自b淋巴细胞。传统的化疗和放疗在血液系统恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用。一些患者疗效显著，但大多数患者难以治愈。新的有效治疗方法一直是此领域的探索热点。

2、过继t细胞治疗在恶性肿瘤的临床治疗中已经显示出强大的功效和光明的前景。目前，其被誉为最有前途的治疗血液肿瘤的方法之一。cd19在大多数b细胞恶性肿瘤的表面高度表达。多个中心独立使用嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞靶向表达cd19的b细胞复发难治性恶性肿瘤，取得了前所未有的成功。目前，fda批准上市的两种car-t产品均靶向cd19抗原，其适应症也在扩大，如慢性淋巴细胞白血病。尽管抗cd19 car-t的疗效突出，但许多研究表明，cd19嵌合抗原受体(car)t细胞治疗也存在许多问题。仍有部分患者的治疗效果不佳，容易复发。其原因包括肿瘤细胞对抗原逃逸的易感性。例如，最近的cd19 car细胞治疗实验显示，90％的患者达到完全缓解，但这些患者中的11％最终复发，复发患者主要是cd19阴性肿瘤患者。尤其是在宾夕法尼亚大学医学院开展的一项使用cart19治疗复发性难治性急性b细胞淋巴瘤(r/r b-all)的临床试验中，高达94％的患者达到完全缓解。尽管此临床试验的初始反应率很高，但近40％的患者在治疗1个月达到完全缓解后又出现了复发，并且60％以上的复发患者出现cd19阴性肿瘤细胞逃逸。已经在过继转移的表达ny-eso1的特异性t细胞受体和治疗黑色素瘤的癌症疫苗中发现了抗原逃逸。自发突变和选择性扩增是抗原逃逸的主要原因。

3、因此，本领域迫切需要开发有效治疗肿瘤和预防抗原逃逸的方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明的一个目的是提供用于有效治疗肿瘤和预防抗原逃逸的方法。

2、本发明的一个目的是提供靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其制备方法。

3、具体而言，本发明的一个目的是提供一种靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体的序列、及其修饰的t细胞(car-t19/20)的制备方法和活性鉴定。本发明提供了一种用于治疗cd19和cd20阳性b细胞淋巴瘤的嵌合抗原受体结构。

4、本公开提供双特异性嵌合抗原受体(car)。该双特异性car可以包含：(i)抗cd20抗原结合区，其包含分别具有seq id no:4和seq id no:3所示氨基酸序列的轻链可变区(vl1)和重链可变区(vh1)；和(ii)抗cd19抗原结合区，其包含分别具有seq id no:5和seqid no:6所示氨基酸序列的轻链可变区(vl2)和重链可变区(vh2)。

5、在某些实施方案中，vl1位于vh1的n端。在某些实施方案中，vh2位于vl2的n端。

6、所述抗cd20抗原结合区可以是特异性结合cd20的单链可变片段(scfv)。所述抗cd19抗原结合区可以是特异性结合cd19的scfv。在某些实施方案中，特异结合cd20的scfv位于特异结合cd19的scfv的n端。

7、所述双特异性car可以进一步包含：(a)前导序列，(b)铰链区，(c)跨膜结构域，(d)至少一个共刺激信号传导区，(e)胞质信号传导结构域，或(f)其组合。

8、所述共刺激信号传导区可源自4-1bb(cd137)、cd28、ox40、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、cd70、cd134、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2或其组合。

9、所述胞质信号传导结构域可以源自cd3ζ。

10、所述铰链区可以源自ig4、cd8、cd28、cd137或其组合。

11、所述跨膜结构域可以源自cd8、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154或其组合。

12、在某些实施方案中，所述双特异性car可以具有seq id no:16所示的氨基酸序列。

13、本公开提供表达本发明双特异性car的免疫细胞。该免疫细胞可以是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。该免疫细胞可以是同种异体的或自体的。

14、本公开还包括编码本发明双特异性car的核酸。

15、本公开还提供包含本发明核酸的载体。

16、本公开提供治疗癌症的方法。该方法可以包括对有需要的个体施用所述的免疫细胞。

17、所述癌症可以是血液癌症。所述癌症可以是b细胞恶性肿瘤。所述癌症可以是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病和/或多发性骨髓瘤。所述癌症可以是急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或其组合。

18、在本发明的第一方面，提供了嵌合抗原受体(car)，其中该嵌合抗原受体的结构如下式i所示：

19、l-scfv1-i-scfv2-h-tm-c-cd3ζ(i)

20、其中，

21、每个“-”独立地是连接肽或肽键；

22、l是任选的信号肽序列；

23、i是柔性接头；

24、h是任选的铰链区；

25、tm是跨膜结构域；

26、c是共刺激信号分子；

27、cd3ζ是源自cd3ζ的胞质信号传导序列；

28、scfv1和scfv2两者之一是靶向cd19的抗原结合结构域，且另一者是靶向cd20的抗原结合结构域。

29、在另一个优选实施方案中，scfv1是靶向cd20的抗原结合结构域，而scfv2是靶向cd19的抗原结合结构域。

30、在另一个优选实施方案中，靶向cd20的抗原结合结构域的结构如下式a或式b所示：

31、vh1-vl1(a)；vl1-vh1(b)

32、其中vh1是抗cd20抗体重链可变区；vl1是抗cd20抗体轻链可变区；“-”是连接肽或肽键。

33、在另一个优选实施方案中，靶向cd20的抗原结合结构域的结构如式b所示。

34、在另一个优选实施方案中，所述vh1的氨基酸序列如seq id no:1所示，且所述vl1的氨基酸序列如seq id no:2所示；或

35、所述vh1的氨基酸序列如seq id no:3所示，且所述vl1的氨基酸序列如seq id no:4所示。

36、在另一个优选实施方案中，所述vh1和vl1通过柔性接头(或连接肽)连接，并且该柔性接头(或连接肽)是1-4个、优选2-4个、更优选3-4个连续的如seq id no:7(ggggs)所示的序列。

37、在另一个优选实施方案中，所述vl1和vh1通过如seq id no:19所示的柔性接头连接。

38、在另一个优选实施方案中，靶向cd19的抗原结合结构域的结构如下式c或式d所示：

39、vl2-vh2(c)；vh2-vl2(d)

40、其中vl2是抗cd19抗体轻链可变区；vh2是抗cd19抗体重链可变区；“-”是连接肽或肽键。

41、在另一个优选实施方案中，靶向cd19的抗原结合结构域的结构如式d所示。

42、在另一个优选实施方案中，所述vl2的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述vh2的氨基酸序列如seq id no:6所示。

43、在另一个优选实施方案中，所述vh2和vl2通过柔性接头(或连接肽)连接，并且该柔性接头(或连接肽)是1-4个、优选2-4个、更优选3-4个连续的如seq id no:7(gggs)所示的序列。

44、在另一个优选实施方案中，所述vh2和vl1通过如seq id no:20所示的柔性接头连接。

45、在另一个优选实施方案中，所述scfv1和/或scfv2是鼠源的、人源的、人源和鼠源嵌合的或全人源化的单链抗体可变区片段。

46、在另一个优选实施方案中，所述嵌合抗原受体的结构如下式ii所示：

47、l-vl1-vh1-i-vh2-vl2-h-tm-c-cd3ζ(ii)

48、其中每个元件如上文所述。

49、在另一个优选实施方案中，柔性接头i的序列包含2-6个、优选3-4个连续的如seqid no:7(gggs)所示的序列。

50、在另一个优选实施方案中，柔性接头i的序列如seq id no:7所示。

51、在另一个优选实施方案中，l是选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137及其组合。

52、在另一个优选实施方案中，l是源自cd8的信号肽。

53、在另一个优选实施方案中，l的氨基酸序列如seq id no:8所示。

54、在另一个优选实施方案中，h是选自下组蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、ig4及其组合。

55、在另一个优选实施方案中，h是源自ig4的铰链区。

56、在另一个优选实施方案中，h的氨基酸序列如seq id no:9所示。

57、在另一个优选实施方案中，tm是选自下组蛋白的跨膜区：cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154及其组合。

58、在另一个优选实施方案中，tm是源自cd8或cd28的跨膜区。

59、在另一个优选实施方案中，tm的序列如seq id no:10或11所示。

60、在另一个优选实施方案中，c是选自下组蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2及其组合。

61、在另一个优选实施方案中，c是源自4-1bb或cd28的共刺激信号分子。

62、在另一个优选实施方案中，c的氨基酸序列如seq id no:12或13所示。

63、在另一个优选实施方案中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:14所示。

64、在另一个优选实施方案中，car的氨基酸序列如seq id no:15或16所示。

65、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区包含重链可变区，该重链可变区包含与seqid no:3或seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的氨基酸序列。

66、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seqid no:4或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的氨基酸序列。

67、在某些实施方案中，抗cd19抗原结合区包含重链可变区，该重链可变区包含与seqid no:6所示的氨基酸序列具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的氨基酸序列。

68、在某些实施方案中，抗cd19抗原结合区包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seqid no:5所示的氨基酸序列具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的氨基酸序列。

69、抗cd20抗原结合区的重链可变区可以包含与奥法木单抗(ofatumumab)重链可变区cdr(分别如seq id no:3的位置30-35、位置50-66、位置99-111所示的cdr1、cdr2和cdr3)或leu16抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:1的位置31-35、位置50-66、位置99-111所示的cdr1、cdr2、cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

70、抗cd20抗原结合区的轻链可变区可以包含与奥法木单抗轻链可变区cdr(分别如seq id no:4的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)或leu16抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:2的位置24-33、位置49-55、位置88-96所示的cdr1、cdr2、cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

71、抗cd20抗原结合区的重链可变区可以包含与奥法木单抗重链可变区cdr(分别如seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42所示的cdr1、cdr2和cdr3)或leu16抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:47、seq id no:49、seq id no:51所示的cdr1、cdr2、cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

72、抗cd20抗原结合区的轻链可变区可以包含与奥法木单抗轻链可变区cdr(分别如seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45所示的cdr1、cdr2和cdr3)或leu16抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:54、seq id no:56、seq id no:58所示的cdr1、cdr2、cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

73、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区的重链可变区包含与奥法木单抗重链可变区cdr(如seq id no:3的位置30-35、位置50-66、位置99-111所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr，且抗cd20抗原结合区的轻链可变区包含与奥法木单抗轻链可变区cdr(分别如seq id no:4的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr。

74、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区的重链可变区包含与奥法木单抗重链可变区cdr(分别如seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr，且抗cd20抗原结合区的轻链可变区包含与奥法木单抗轻链可变区cdr(分别如seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr。

75、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区的重链可变区包含与leu16抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:1的位置31-35、位置50-66、位置99-111所示的cdr1、cdr2、cdr3)相同的三个cdr，且抗cd20抗原结合区的轻链可变区包含与leu16抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:2的位置24-33、位置49-55、位置88-96所示的cdr1、cdr2、cdr3)相同的三个cdr。

76、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区的重链可变区包含与leu16抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:47、seq id no:49、seq id no:51所示的cdr1、cdr2、cdr3)相同的三个cdr，且抗cd20抗原结合区的轻链可变区包含与leu16抗体轻链可变区cdr(分别如seqid no:54、seq id no:56、seq id no:58所示的cdr1、cdr2、cdr3)相同的三个cdr。

77、抗cd19抗原结合区的重链可变区可以包含与fmc63抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:6的位置31-35、位置50-65、位置98-109所示的cdr1、cdr2和cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

78、抗cd19抗原结合区的轻链可变区可以包含与fmc63抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:5的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

79、抗cd19抗原结合区的重链可变区可以包含与fmc63抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62所示的cdr1、cdr2和cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

80、抗cd19抗原结合区的轻链可变区可以包含与fmc63抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:63、seq id no:64、seq id no:39所示的cdr1、cdr2和cdr3)具有至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一性的一个、两个或三个互补决定区(cdr)。

81、在某些实施方案中，抗cd19抗原结合区的重链可变区包含与fmc63抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:6的位置31-35、位置50-65、位置98-109所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr，且抗cd19抗原结合区的轻链可变区包含与fmc63抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:5的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr。

82、在某些实施方案中，抗cd19抗原结合区的重链可变区包含与fmc63抗体重链可变区cdr(分别如seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr，且抗cd19抗原结合区的轻链可变区包含与fmc63抗体轻链可变区cdr(分别如seq id no:63、seq id no:64、seq id no:39所示的cdr1、cdr2和cdr3)相同的三个cdr。

83、在本发明的第二方面，提供编码本发明第一方面的嵌合抗原受体的核酸分子。

84、在另一个优选实施方案中，所述核酸分子是分离的。

85、在另一个优选实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:17或18所示。

86、在本发明的第三方面，提供包含本发明第二方面的核酸分子的载体。

87、在另一个优选实施方案中，所述载体包含dna、rna。

88、在另一个优选实施方案中，所述载体选自质粒、病毒载体、转座子及其组合。

89、在另一个优选实施方案中，所述载体包括dna病毒和逆转录病毒载体。

90、在另一个优选实施方案中，所述载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及其组合。

91、在另一个优选实施方案中，所述载体是慢病毒载体。

92、在本发明的第四方面，提供宿主细胞，该宿主细胞包含本发明第三方面的载体、或具有整合到其基因组中的本发明第二方面的外源核酸分子、或表达本发明第一方面的嵌合抗原受体。

93、在另一个优选实施方案中，所述细胞是分离的细胞。

94、在另一个优选实施方案中，所述细胞是遗传改造的细胞。

95、在另一个优选实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

96、在另一个优选实施方案中，所述细胞是car-t细胞和/或car-nk细胞。

97、在另一个优选实施方案中，所述细胞靶向cd19和cd20二者。

98、在本发明的第五方面，提供用于制备表达本发明第一方面的嵌合抗原受体的car-t细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：将本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的载体转导入t细胞，从而获得car-t细胞。

99、在另一个优选实施方案中，该方法进一步包括检测所获得的car-t细胞的功能和有效性的步骤。

100、在本发明的第六方面，提供制剂，其包含本发明第一方面的嵌合抗原受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明三方面的载体或本发明第四方面的宿主细胞，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

101、在另一个优选实施方案中，所述制剂为液体制剂。

102、在另一个优选实施方案中，所述制剂的剂型是注射剂。

103、在另一个优选实施方案中，所述制剂包含本发明第四方面的宿主细胞，且所述宿主细胞的浓度为1×103-1×108细胞/ml，优选1×104-1×107细胞/ml。

104、在本发明的第七方面，提供本发明第一方面的嵌合抗原受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明三方面的载体或本发明第四方面的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物或制剂中的用途。

105、在另一个优选实施方案中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤及其组合；优选地，所述肿瘤是血液肿瘤。

106、在另一个优选实施方案中，所述血液肿瘤选自急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性成淋巴细胞白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)及其组合。

107、在另一个优选实施方案中，所述实体瘤选自胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、胶质瘤、子宫内膜癌及其组合。

108、在本发明的第八方面，提供用于制备本发明第四方面的细胞的试剂盒，其中该试剂盒包含容器以及位于该容器中的本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的载体。

109、在本发明的第九方面，提供本发明第四方面的细胞或本发明第六方面的制剂在预防和/或治疗癌症或肿瘤中的用途。

110、在本发明的第十方面，提供治疗疾病的方法，其包括对需要治疗的个体施用适量的本发明第四方面的细胞或本发明第六方面的制剂。

111、在另一个优选实施方案中，所述疾病是癌症或肿瘤。

112、本公开提供双特异性嵌合抗原受体(car)。该双特异性car可以包含：(i)含有轻链可变区(vl1)和重链可变区(vh1)的抗cd20抗原结合区；以及(ii)含有轻链变区(vl2)和重链可变区(vh2)的抗cd19抗原结合区。vl1可以包含三个互补决定区(cdr)，即cdr1、cdr2和cdr3，其分别具有与seq id no:43、seq id no:44和seq id no:45所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％同一性的氨基酸序列。vh1可以包含三个cdr，即cdr1、cdr2和cdr3，其分别具有与seq id no:40、seq id no:41、seq id:42所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％同一性的氨基酸序列。vl2可以包含三个互补决定区(cdr)，即cdr1、cdr2和cdr3，其分别具有与seq id no:63、seq id no:64和seq id no:39所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％同一性的氨基酸序列。vh2可以包含三个cdr，即cdr1、cdr2和cdr3，其分别具有与seq id no:60、seq id no:61、seq id:62所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％同一性的氨基酸序列。

113、在某些实施方案中，vl1位于vh1的n端。

114、在某些实施方案中，vh2位于vl2的n端。

115、在某些实施方案中，vl1和vh1分别具有与seq id no:4和seq id no:3所示的氨基酸序列约80％至约100％同一性的氨基酸序列。

116、在某些实施方案中，vl2和vh2分别具有与seq id no:5和seq id no:6所示的氨基酸序列约80％至约100％同一性的氨基酸序列。

117、在某些实施方案中，抗cd20抗原结合区是特异性结合cd20的单链可变片段(scfv)。在某些实施方案中，抗cd19抗原结合区是特异性结合cd19的scfv。

118、所述双特异性car可以进一步包含以下之一或多个元件：(a)信号肽，(b)铰链区，(c)跨膜结构域，(d)共刺激区，和(e)胞质信号传导结构域。

119、所述共刺激区可以包含选自下组蛋白的共刺激区：4-1bb(cd137)、cd28、ox40、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、cd70、cd134、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2或其组合。

120、所述胞质信号传导结构域可以包含cd3ζ的胞质信号传导结构域。

121、所述铰链区可以包含选自下组蛋白(野生型和突变体)的铰链区：ig4、cd8、cd28、cd137或其组合。

122、所述跨膜结构域可以包括选自下组蛋白的跨膜结构域：cd8、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154或其组合。

123、在某些实施方案中，所述双特异性car包含与seq id no.16所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％同一性的氨基酸序列。

124、本公开提供表达本发明双特异性car的免疫细胞。该免疫细胞可以是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。

125、本公开还包括编码本发明双特异性car的核酸。

126、本公开提供包含本发明核酸的载体。

127、本公开还提供治疗癌症的方法。该方法可以包括对有需要的个体施用本发明的免疫细胞。

128、所述免疫细胞可以是同种异体的或自体的。

129、所述癌症可以是血液癌症。该癌症可以是b细胞恶性肿瘤。该癌症可以是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病和/或多发性骨髓瘤。该癌症可以是急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或其组合。

130、在某些实施方案中，在对个体施用所述双特异性car后约28天中，该双特异性car可以在个体血液中产生约0.5e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约4e+06拷贝/gdna、约0.5e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.5e+06拷贝/gdna、约1e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.5e+06拷贝/gdna、约1.2e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna、约0.8e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna、约1.6e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna、约1e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约2e+06拷贝/gdna、约0.6e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约1.8e+06拷贝/gdna、约3e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna、约0.5e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约1.7e+06拷贝/gdna、约2e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna、约1.5e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约2e+06拷贝/gdna、或约1e+06拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.2e+06拷贝/gdna的曲线下面积(auc)。

131、在某些实施方案中，在对个体施用所述双特异性car后，该双特异性car在个体血液中产生约0.8e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.5e+05拷贝/gdna、约1e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.5e+05拷贝/gdna、约1e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约1.6e+05拷贝/gdna、约1e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.3e+05拷贝/gdna、约0.8e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约1.5e+05拷贝/gdna、约0.8e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约2e+05拷贝/gdna、约1e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约2e+05拷贝/gdna、约2e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3e+05拷贝/gdna、约2e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3.5e+05拷贝/gdna、约2e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约2.5e+05拷贝/gdna、或约1e+05拷贝/μg基因组dna(拷贝/gdna)至约3e+05拷贝/gdna的最大血浆浓度(cmax)。

132、在某些实施方案中，所述双特异性car具有约3天至约20天、约4天至约18天、约5天至约17天、约6天至约16天、约7天至约15天、约9天至约15天、约10天至约15天、约10天至约14天、约8天至约12天、约6天至约14天、约12天至约14天、约8天至约11天、约8天至约15天、或约10天至约14天的tmax(所述双特异性car达到cmax所花费的时间)。

133、应当理解，上述本发明的各种技术特征和下文(如实施例中)具体描述的各种技术特征可以在本发明的范围内相互组合，以构成新的或优选的技术方案，其由于篇幅限制而无需逐一描述。