用于癌症诊断的组合物和方法与流程

背景技术：

1、癌症涉及异常细胞生长，有可能侵入或扩散到身体的其它部位。尽管进行了数十年的癌症研究，但癌症继续导致大量死亡(2020年美国每天有约1,600例死亡)，这主要是由于缺乏早期和/或准确检测的手段。例如，卵巢癌是最致命的妇科癌症，并且是女性死亡的第三大原因。浆液性卵巢癌是卵巢癌中最具侵袭性的亚型，并且通常被称为“沉默的杀手”，因为大多数患者在处于晚期时被诊断。症状不明确，并且容易与其它病状混淆。目前，ca-125是一种用于筛查和监测治疗功效的血液标志物。尽管80％的上皮肿瘤中ca-125水平升高，但这些肿瘤中的大多数都处于晚期。血清ca-125用于早期诊断的检出率低，因为其水平在少于50％的i期卵巢癌中升高，并且特异性有限。因此，非常需要新的生物标志物，例如癌症组织和血液中的生物标志物，以检测早期癌症，这将提高癌症患者的生存率。

技术实现思路

1、神经节苷脂是糖脂，所述糖脂包括(i)以名称具体定义的碳水化合物结构和(ii)碳链长度可以变化的脂质尾部。本发明至少部分基于神经节苷脂(例如，gd2、gd3、gm2和/或gd1)是用于癌症诊断和预后，特别是用于癌症早期检测的有用生物标志物的发现。本文提供了用于癌症诊断和预后的组合物和方法。例如，本文提供了包括与神经节苷脂(例如，gd2或gd3)特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的组合物以及使用所述组合物检测和测量神经节苷脂的量以及使用液体活检(例如，血液、血清)或实体组织活检来诊断癌症的方法。本文进一步提供了基于质谱的新型方法，用于检测神经节苷脂(例如，gd2、gd3、gm2和/或gd1)的存在、水平和/或脂质长度。检测到的神经节苷脂类型的异质性和/或同质性以及癌症患者脂质长度的异质性和/或同质性或其变化，或患者随时间的纵向变化可以从而为癌症诊断和预后提供新型生物标志物。

2、在某些方面，本文提供了一种组合物，其包括经修饰的神经节苷脂。例如，本文提供了一种组合物，其包含具有以下结构的神经节苷脂：

3、(a)x-[(p)y-(l)z]-(m)b；

4、其中a是神经节苷脂或其任何部分；x是1至32的整数；p是杂芳基；y是1；l是接头；z是0至8的整数；m是核心；并且b是0或1；

5、其中p任选地被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：(1)氢；(2)c1-7酰基；(3)c1-20烷基；(4)氨基；(5)c3-10芳基；(6)羟基；(7)硝基；(8)c1-20烷基-氨基；以及(9)-(ch2)qconrb，其中q是0至4的整数，并且其中rb选自由以下组成的组：(a)氢；(b)c1-6烷基；(c)c3-10芳基；以及(d)c1-6烷-c6-10芳基。

6、在一些实施例中，神经节苷脂包括三嗪。在其它实施例中，经修饰的神经节苷脂包括三唑。

7、在一些实施例中，本公开的神经节苷脂被可检测地标记。在一些实施例中，包含本公开的神经节苷脂的组合物是药物组合物。

8、本文还提供了一种在受试者中诱导针对神经节苷脂的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括本公开的神经节苷脂的组合物。

9、本文进一步提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括本公开的神经节苷脂的组合物。在一些实施例中，受试者患有癌症或患有感染(例如病毒(例如，hiv、丙型肝炎病毒(hcv)或爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus))或细菌感染)。例如，本公开的组合物可以用于预防或治疗受试者的癌症。

10、本文提供了一种在哺乳动物中产生抗体的方法，所述方法包括：

11、(a)用包含本公开的神经节苷脂的组合物使所述哺乳动物免疫，所述组合物任选地进一步包含佐剂；以及(b)从所述哺乳动物、来自所述哺乳动物的细胞或使用来自所述哺乳动物的细胞制备的杂交瘤中分离与所述神经节苷脂结合的抗体。在一些实施例中，所述哺乳动物选自兔、小鼠、山羊、骆驼、狗、绵羊或大鼠。

12、在某些方面，本文提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体与神经节苷脂的碳水化合物部分特异性结合。在一些实施例中，神经节苷脂是：(a)gd2；(b)gd3；或(c)gd2和gd3。

13、在某些方面，本文提供了一种分离的核酸分子，其编码：a)包括表1和/或表2中列出的氨基酸序列的多肽；b)包括与表1和/或表2中列出的氨基酸序列具有至少或约85％同一性的氨基酸序列的多肽；和/或c)本文所描述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

14、在某些方面，提供了一种包括本文所描述的分离的核酸的载体。

15、在某些方面，提供了一种宿主细胞，其包括本文所描述的分离的核酸、包括本文所描述的载体、表达本文所描述的抗体或其抗原结合片段。

16、在某些方面，提供了一种产生本公开的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)在适于允许表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包括核酸的宿主细胞，所述核酸包括编码本公开的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的序列；以及(ii)回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。

17、在某些方面，一种包括本文所描述的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的装置或试剂盒。

18、在一些实施例中，所述装置或试剂盒进一步包括：(a)用于检测所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的标记；(b)用于检测初级抗体的次级抗体；和/或(c)至少一种参考抗原，任选地其中所述参考抗原是神经节苷脂。

19、在一些实施例中，装置或试剂盒的参考抗原选自gd2、gd3、以及gd2或gd3的经修饰形式。在一些实施例中，参考抗原选自：本文所描述的神经节苷脂中的任何一种(例如具有(a)x-[(p)y-(l)z]-(m)b结构的那些神经节苷脂)、苯硫基gd2、苯硫基gd3、gd2-o-芳基-nh2、gd3-o-芳基-nh2、对氨基苯基醚gd2(ap-gd2)、对氨基苯基醚gd3(ap-gd3)、三嗪gd2(例如1,3,5-三嗪-gd2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-gd2)、三嗪gd3(例如1,3,5-三嗪-gd3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-gd3)、多聚体gd2(例如，pamam(聚酰胺-胺)-gd2)和多聚体gd3(pamam-gd3)。

20、在某些方面，一种从样品中提取脂质的方法，所述方法包括：(a)获得所述样品；(b)向所述样品中添加约1、2、3、4或5倍(或2至5倍)体积的以选自以下的比率包括chcl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；(c)振荡(b)中的混合物；以及(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。

21、在某些方面，一种从样品中纯化神经节苷脂的方法，所述方法包括：(a)获得所述样品；(b)向所述样品中添加约1、2、3、4或5倍(或2至5倍)体积的以选自以下的比率包括chcl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；(c)振荡(b)中的混合物；以及(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。

22、在提取脂质的方法或纯化神经节苷脂的方法的一些实施例中，(i)在用所述有机溶剂提取之前，通过离心澄清所述样品；(ii)所述样品来自哺乳动物，任选地来自人类；(iii)通过离心将所述样品与所述有机溶剂分离；(iv)所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者；(v)所述样品包括细胞、血清、血液、瘤周组织和/或瘤内组织；(vi)所述方法进一步包括重复(b)-(d)的步骤至少1、2、3、4或5次；和/或(vii)所述方法进一步包括从(d)的所提取的样品中蒸发残留有机溶剂，任选地通过在真空(例如，快速真空)下离心溶液。

23、对于包括细胞和/或组织(即非液体)的样品，普通技术人员理解此类样品应充分均质化以提高提取效率。因此，在一些实施例中，细胞和/或组织在提取前被均质化。

24、在某些方面，一种检测至少一种神经节苷脂(例如gd2和/或gd3)的存在或水平的方法，所述方法包括使用本文所描述的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段检测样品中的所述神经节苷脂。在一些实施例中，其中所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者。

25、如本文所描述的，某些实施例适用于本文所描述的任何方法。例如，在一些实施例中，所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，gd2或gd3)形成复合物，并且所述复合物以酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫化学方式(例如，免疫组织化学(ihc))的形式或使用流式细胞术检测到。在一些实施例中，所述复合物在酶联免疫吸附测定(elisa)中检测到。在优选的实施例中，所述复合物在夹心elisa或竞争性elisa中检测到。在一些实施例中，所述复合物通过免疫组织化学(ihc)检测到。

26、在优选的实施例中，所述复合物在夹心elisa中检测到。在一些实施例中，所述复合物使用本公开的任何两种抗体或其抗原结合片段在夹心elisa中检测到。在其它实施例中，所述复合物使用本公开的任何一种抗体和本领域已知抗体的组合(例如，可以检测神经节苷脂的抗体，例如针对神经酰胺或神经节苷脂的脂质尾部部分的抗体)在夹心elisa中检测到。在又其它实施例中，所述复合物使用本领域已知的两种抗体或其抗原结合片段在夹心elisa中检测到。

27、在另一种优选的实施例中，所述复合物在竞争性elisa中检测到。

28、在一些实施例中，所述竞争性elisa包括参考抗原，所述参考抗原选自gd2、gd3或gd2或gd3的经修饰形式。在一些实施例中，参考抗原选自：本文所描述的神经节苷脂中的任何一种(例如具有(a)x-[(p)y-(l)z]-(m)b结构的那些神经节苷脂)、苯硫基gd2、苯硫基gd3、gd2-o-芳基-nh2、gd3-o-芳基-nh2、对氨基苯基醚gd2(ap-gd2)、对氨基苯基醚gd3(ap-gd3)、三嗪gd2(例如1,3,5-三嗪-gd2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-gd2)、三嗪gd3(例如1,3,5-三嗪-gd3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-gd3)、多聚体gd2(例如，pamam-gd2)和多聚体gd3(pamam-gd3)。

29、本文进一步提供了一种检测至少一种神经节苷脂的基于质谱的方法。例如，本文提供了一种检测至少一种神经节苷脂的存在、水平或脂质长度的方法，所述方法包括使用质谱法(例如，lc/ms或lc/ms/ms)检测样品中的所述神经节苷脂。

30、在一些实施例中，使用所述方法检测至少一种神经节苷脂的脂质长度的相对异质性或可替代地相对同质性和/或对其进行定量。在一些实施例中，使用所述方法检测在患者中发生的至少一种神经节苷脂的脂质长度的相对异质性或相对同质性的纵向变化(对于给定患者随时间发生的变化)和/或对其进行定量。

31、在一些实施例中，用于检测至少一种神经节苷脂的存在、水平或脂质长度(例如，使用抗体或质谱法检测)的样品包括根据本文所描述的方法(例如，脂质提取)制备的样品。

32、在某些方面，本文提供了本文详细描述的诊断和预后方法。