新型的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的制作方法

本发明涉及用于生产抗体、生理活性物质等的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法。此外，本发明还涉及用于生产抗体、生理活性物质等的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、该纤维的制造方法、和使用该纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法。

背景技术：

1、迄今为止，已知通过使用动物细胞的培养来生产抗体、生理活性物质(例如，干扰素、促红细胞生成素、il-2(白介素-2)、csf(集落刺激因子)、tnf(肿瘤坏死因子)等)等的各种方法。

2、生产抗体时，作为产生抗体的细胞，cho细胞(来自中国仓鼠卵巢)、sp2/0细胞、ns0细胞等被用作宿主细胞，特别时cho细胞是能够悬浮培养的细胞，而且细胞的增殖速度快，通过cho细胞的大量培养，容易大量生产目标蛋白，因此在抗体的制造中被广泛应用。

3、近年来，在抗体药品的开发·制造中，要求向抗体药品的稳定生产、低成本化努力，为了实现这些，生产率更高效的生产系统(例如，连续生产方法、利用小规模生产设备用于产生必要量的抗体的新型培养技术等)的开发受到关注。

4、产生抗体的细胞的培养是在转瓶等中使产生抗体的细胞株产生细胞，然后一边控制培养基组成·温度·搅拌条件·气体交换·ph等培养条件，一边进行扩大培养，最终在数千至1万l规模的大规模生产培养罐中进行培养。

5、在以高密度连续培养产生抗体的细胞时，(1)细胞与培养液的分离方法、(2)有效的氧供给方法等有时成为问题。虽然对(1)和(2)谋求了各种改善，但为了有效地生产抗体，需要解决其它各种问题。

6、已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含各种细胞，壳层由海藻酸凝胶组成(专利文献1：国际公开第2011/046105号小册子、专利文献2：日本特开2016-77229号公报)。

7、已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含产生抗体的细胞，壳层由海藻酸凝胶组成(专利文献3：国际公开第2020/032221号小册子)。

8、已知海藻酸凝胶中空纤维，其中中空部包含各种细胞，外壳层为海藻酸凝胶(专利文献4：国际公开第2015/178427号小册子、专利文献5：专利第6601931号公报、专利文献6：日本特开2014-236698号公报)。

9、已知将包含细胞(具体地，人皮肤成纤维细胞、hek293t细胞)的海藻酸水凝胶纤维用包含纳米颗粒的粘接剂粘接而成的束，所述纳米颗粒是表面用阳离子性水溶性聚合物被覆的纳米颗粒(专利文献7：国际公开第2019/078251号小册子、专利文献8：国际公开第2019/123886号小册子)。

10、已知有使用壳聚糖将神经干细胞或含神经干细胞的海藻酸水凝胶纤维集束化而成的移植用神经束(专利文献9：日本特开2014-136128号公报)。

11、已知将包含粘附性细胞(具体地，c2c12细胞)、微载体和凝胶状多糖类(具体地，海藻酸凝胶)的混合物用聚氨基酸被覆的细胞结构体(可举出例如片材状(板状)、纤维状(纤维状)、球状等)(专利文献10：日本特开2019-075993号公报)。

12、已知将包含细胞(293/gfp细胞)的海藻酸钙微纤维用聚-l-赖氨酸被覆，并用柠檬酸钠溶液溶解而得的管状凝胶(非专利文献1：pa-lab chip，2008，8，p1255-1257)。

13、已知在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基团而导入了环状烷基或叠氮基的化学修饰海藻酸衍生物(专利文献11：国际公开第2019/240219号小册子、专利文献12：国际公开第2021/125255号小册子)。

14、已知具有芯·壳结构的海藻酸凝胶纤维，其中芯层包含产生抗体的细胞，壳层包含由化学修饰海藻酸衍生物形成的交联海藻酸凝胶(专利文献13：国际公开第2021/125279号小册子)。

15、专利文献1～13和非专利文献1中既没有公开也没有暗示本发明的抗体、生理活性物质等的生产用的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维或多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维、各凝胶纤维的制造方法、和使用各凝胶纤维的抗体等的制造方法。

16、现有技术文献

17、专利文献

18、专利文献1：国际公开第2011/046105号小册子

19、专利文献2：日本特开2016-77229号公报

20、专利文献3：国际公开第2020/032221号小册子

21、专利文献4：国际公开第2015/178427号小册子

22、专利文献5：日本专利第6601931号公报

23、专利文献6：日本特开2014-236698号公报

24、专利文献7：国际公开第2019/078251号小册子

25、专利文献8：国际公开第2019/123886号小册子

26、专利文献9：日本特开2014-136128号公报

27、专利文献10：日本特开2019-075993号公报

28、专利文献11：国际公开第2019/240219号小册子

29、专利文献12：国际公开第2021/125255号小册子

30、专利文献13：国际公开第2021/125279号小册子

31、非专利文献

32、非专利文献1：pa-lab chip，2008，8，p1255-1257

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、要求含有能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的海藻酸凝胶纤维，特别是纤维不分解、可长期(例如，7天以上、14天以上、28天以上等)进行细胞培养的更为实用的海藻酸凝胶纤维。

3、用于解决课题的手段

4、本发明人等反复深入研究，结果发现将交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的新型聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和其制造方法，所述交联海藻酸凝胶包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞，且通过使用后述的方式[1]中记载的式(i)和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得到。另外，还发现使用该聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进行产生抗体、生理活性物质等的细胞的培养时，聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维不分解，能够长期连续产生抗体、生理活性物质等，从而完成了本发明。进一步，还发现将聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维用阴离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的新型多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和其制造方法，所述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维是将交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆而形成的抗体、生理活性物质等的生产用的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，所述交联海藻酸凝胶是通过使用后述的方式[1b]中记载的式(i)和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行交联反应而得的。另外，还发现使用该多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维进行产生抗体的细胞的培养时，多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维不分解，能够长期连续产生抗体等。

5、发明效果

6、根据本发明，提供新型聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和使用该凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的生产方法。在一些方式中，通过将使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、后述方式[1]中记载的式(i)和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液制作的交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆，由此提供能够长期连续产生抗体、生理活性物质等的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。另外，根据本发明，提供新型多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和使用该凝胶纤维的抗体、生理活性物质等的生产方法。在一些方式中，通过将使用包含能够产生抗体、生理活性物质等的细胞、后述方式[1b]中记载的式(i)和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液制作的交联海藻酸凝胶用阳离子性聚合物被覆，得到聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，并将其用阴离子性聚合物被覆，由此提供能够长期连续产生抗体、生理活性物质等的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维。

7、由后述实施例可知，通过将使用包含产生抗体的细胞(产生抗gpvi抗体的cho细胞、产生托珠单抗的cho细胞)或产生生理活性物质的细胞(来自胰腺β细胞的min6细胞)、式(i)和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物等的混合液形成的交联海藻酸凝胶(也称为芯层)用聚-l-鸟氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺或聚亚甲基-co-胍(pmcg)的阳离子性聚合物(也称为阳离子性聚合物层)被覆，可以制作聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，使用该纤维进行培养时，可以长期(后述实施例中，最大47天)连续产生抗体或胰岛素。本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维具有下述特征：提供适于能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的环境，在该纤维的芯层中产生的抗体、生理活性物质等连续透过芯层、阳离子性聚合物层而释放至该纤维外。

8、进一步，由后述实施例可知，通过将芯层包含产生托珠单抗的cho细胞的前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维的阳离子性聚合物层的外侧使用作为阴离子性聚合物(也称为阴离子性聚合物层)的海藻酸、式(i)所示的化学修饰海藻酸衍生物和式(ii)所示的化学修饰海藻酸衍生物进行被覆，可以制作多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维，或者通过使用该纤维进行培养，可以长期(后述实施例中，最大35天)连续产生抗体。本发明的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维具有下述特征：与前述聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维相同地提供适于能够产生抗体、生理活性物质等的细胞的环境，在该纤维的芯层中产生的抗体、生理活性物质等连续透过芯层、阳离子性聚合物层和阴离子性聚合物层而释放至该纤维外。

9、本发明的聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维和多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维提供适于抗体、生理活性物质等的生产的环境。对封入芯层的抗体、生理活性物质等的产生细胞的物理压力少，可期待封入的该细胞长期持续产生抗体、生理活性物质等。因此，使用这种纤维的抗体、生理活性物质等的制造方法可以期待飞跃性地提高抗体、生理活性物质等的生产效率。例如，抗体生产的情况中，与需要大规模的培养罐的抗体的悬浮培养不同，还可期待以小规模的生产设备来制造抗体。也可期待作为适于少量·多种品种的抗体药品制造的下一代型抗体药品的连续生产技术。