抗原特异性T细胞及其制备和使用方法与流程

背景技术：

1、癌症对社会健康的威胁越来越大。平均而言，随着医疗技术日益延长生命，当前人口正在老龄化，导致癌症发病率增加。全球每四例死亡中就有一例归因于癌症。

2、由于患者和类型之间存在巨大异质性，因此癌症是一种治疗起来具有挑战性的疾病。即使是现在，许多癌症中心仍在对每个患者的基因组进行测序以鉴定癌症突变。因此，对于每种癌症都需要独特的治疗，并且个性化药物最终可能成为护理标准。

3、测序已经揭示，每个人的癌症包含其基因组的变化。另外被称为多命中假设，这些变化以逐步方式发生。机体通过消除突变细胞经由免疫系统抵抗这些变化。该系统包含一般性靶向效应细胞和特异性靶向效应细胞，分别称为先天免疫系统和适应性免疫系统。先天细胞，诸如自然杀伤细胞和单核细胞，使用病原体相关分子或人细胞上自体信号的缺失来鉴定外来物质。适应性免疫系统必须由抗原递呈细胞(apc)活化。t细胞具有t细胞受体(tcr)以鉴定在主要组织相容性复合体i或ii(mhc)的背景下由apc呈递的抗原。靶向是严格的，并且可用于对抗表达该抗原的患者细胞，而不是杀伤所有细胞。这些细胞共同向癌细胞施加选择压力，这一过程被称为免疫编辑(cross，2018年；oldfield，2017年)。然而，不引起来自免疫系统的强应答的序列和表达模式的变化作为新抗原出现在癌细胞上。由癌细胞形成的肿瘤进化产生具有免疫抑制属性的肿瘤微环境并继续增殖，导致免疫系统严重功能障碍(spranger，2015年；blank，2016年；poch，2007年；ohm&carbone，2002年)。

4、因此，需要设计成通过靶向其特异性新抗原来治疗每个患者的独特癌症的新癌症疗法。

技术实现思路

1、在一些方面，本技术提供了产生表达一种或多种t细胞受体(tcr)的t细胞群体的方法，该一种或多种tcr特异性结合一种或多种抗原，这些方法包括：(i).从患有癌症或病毒感染的受试者获得血样；(ii).鉴定与该癌症或该病毒感染相关的一种或多种抗原；(iii).制备编码与该癌症或该病毒感染相关的该一种或多种抗原的一种或多种mrna分子；(iv).从该血样的外周血单核细胞(pbmc)中分离单核细胞并保存来自该样本的剩余细胞，这些剩余细胞包括t细胞；(v).使所分离的单核细胞分化成树突状细胞；(vi).用该一种或多种mrna分子转染该树突状细胞；以及(vii).通过使来自这些剩余细胞的t细胞与所转染的树突状细胞接触来刺激这些t细胞，从而产生表达一种或多种tcr的t细胞群体，该一种或多种tcr特异性结合与该癌症或该病毒感染相关的该一种或多种抗原。在一些实施方案中，提供了源自根据本文公开的各种实施方案的方法的t细胞群体。

2、在一些方面，本技术提供了产生表达一种或多种t细胞受体(tcr)的t细胞群体的方法，该一种或多种tcr特异性结合抗原，这些方法包括：(i).用编码一种或多种抗原的一种或多种mrna分子转染树突状细胞群体；以及(ii).通过使初始t细胞群体与步骤(i)的所转染的树突状细胞接触来刺激该初始t细胞群体，从而产生表达一种或多种t细胞受体的t细胞群体，该一种或多种t细胞受体特异性结合由该一种或多种mrna分子编码的该一种或多种抗原。

3、在一些方面，本技术提供了包含t细胞受体(tcr)的分离的工程化t细胞，该t细胞受体靶向选自表1至表9和表11中列出的新抗原的多种癌症新抗原。

4、在一些方面，本技术提供了工程化t细胞群体，这些工程化t细胞群体包含靶向一种或多种抗原的t细胞受体(tcr)，该群体包含小于5％的调节t细胞、小于5％的耗竭t细胞和比效应t细胞多的记忆t细胞。

5、在一些方面，本技术提供了治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，这些方法包括：(i)从该受试者获得血样；(ii).鉴定与该受试者的癌症相关的一种或多种新抗原；(iii).制备编码该一种或多种新抗原的一种或多种mrna分子；(iv).从该血样的外周血单核细胞(pbmc)中分离单核细胞并保存来自该样本的剩余细胞，这些剩余细胞包括t细胞；(v).使所分离的单核细胞分化成树突状细胞；(vi).用该一种或多种mrna分子转染该树突状细胞；(vii).通过使来自这些剩余细胞的t细胞与所转染的树突状细胞接触来刺激这些t细胞，从而产生表达一种或多种t细胞受体(tcr)的t细胞群体，该一种或多种tcr特异性结合与该癌症相关的该一种或多种新抗原；以及(viii).将所得t细胞群体的全部或一部分施用给该受试者。

6、在一些方面，本技术提供了治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，这些方法包括：(i)鉴定与该受试者的癌症相关的两种或更多种新抗原；以及(ii).向该受试者施用t细胞群体，该t细胞群体包含多种t细胞，该多种t细胞各自表达两种或更多种t细胞受体(tcr)并且还包含内源β2-微球蛋白(b2m)基因的缺失或破坏，该两种或更多种tcr特异性结合该两种或更多种新抗原中的至少两种。

7、在一些方面，本技术提供了治疗对其有需要的受试者的病毒感染的方法，这些方法包括：(i)鉴定与该受试者的病毒感染相关的两种或更多种病毒抗原；以及(ii).向该受试者施用表达两种或更多种t细胞受体(tcr)的多种t细胞，该两种或更多种tcr特异性结合所述两种或更多种病毒抗原。

8、在一些方面，本技术提供了在t细胞中瞬时表达一种或多种促炎蛋白质和/或改变细胞外基质的一种或多种外源性酶的方法，这些方法包括用编码该一种或多种促炎蛋白质和/或改变细胞外基质的该一种或多种外源性酶的一种或多种mrna分子转染该t细胞。

9、在一些方面，本技术提供了改变受试者的肿瘤微环境的方法，这些方法包括向该受试者施用瞬时表达一种或多种促炎蛋白质和/或改变细胞外基质的一种或多种外源性酶的t细胞群体。

10、在一些方面，本技术提供了制备包含树突状细胞的组合物的方法，这些树突状细胞编码和/或表达与受试者的癌症相关的一种或多种新抗原，这些方法包括：(i).从该受试者获得血样；(ii).对源自该血样的无细胞脱氧核糖核酸(cfdna)进行测序，以鉴定与该受试者的癌症相关的一种或多种新抗原；(iii).制备编码与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的mrna或对应于与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的肽；(iv).从该血样的外周血单核细胞(pbmc)中分离单核细胞；(v).使所分离的单核细胞分化成树突状细胞；以及(vi).将这些树突状细胞与来自步骤(iii)的该mrna或肽组合，以获得编码和/或表达与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的树突状细胞。

11、在一些方面，本技术提供了包含一种或多种t细胞的组合物，该一种或多种t细胞编码和/或表达结合至与受试者的癌症相关的新抗原的t细胞受体(tcr)，其中该一种或多种t细胞包括一种或多种cd4+t细胞、一种或多种cd8+t细胞、一种或多种cd3+t细胞，并且其中这些cd4+t细胞和cd8+t细胞以约1:1、约1:2或约1:4的比例存在于该组合物中。

12、在一些方面，本技术提供了包含一种或多种t细胞的组合物，该一种或多种t细胞编码和/或表达tcr，该tcr结合至与受试者的癌症相关的新抗原。

13、在一些方面，本技术提供了包含一种或多种t细胞的组合物，该一种或多种t细胞编码和/或表达tcr，该tcr结合至与癌症相关的一种或多种新抗原，其中(a)该一种或多种新抗原与特定类型的癌症相关，或(b)该一种或多种新抗原与对受试者具有特异性的癌症相关，并且其中该癌症选自结肠癌、肺癌、胰腺癌、急性髓系白血病(aml)、黑素瘤、膀胱癌、血液学癌症、胰腺癌和成胶质细胞瘤。

14、在一些方面，本技术提供了包含一种或多种t细胞的组合物，该一种或多种t细胞编码和/或表达tcr，该tcr结合至与受试者的癌症相关的新抗原，其中该一种或多种t细胞包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd3+t细胞，并且其中这些cd4+t细胞和cd8+t细胞以约1:4至约1:1范围内的比例，例如以约1:1、约1:2或约1:4的比例存在于该组合物中。

15、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的约80重量％的编码和/或表达该tcr的该一种或多种t细胞。

16、在一些实施方案中，该组合物包含小于20重量％的除编码和/或表达该tcr的该一种或多种t细胞以外的任何细胞。

17、在一些实施方案中，该一种或多种t细胞是cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd3+t细胞或它们的组合。

18、在一些实施方案中，该一种或多种t细胞是初始t细胞、中枢记忆t细胞、干细胞记忆t细胞、效应记忆t细胞、nk细胞或它们的任何组合。

19、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的cd3+和cd8+t细胞或cd3+和cd4+t细胞。

20、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的中枢记忆t细胞。

21、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的效应记忆t细胞。

22、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的cd4+t细胞。

23、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的cd8+t细胞。

24、在一些实施方案中，该组合物包含占该组合物的总重量的大于约70重量％的cd3+t细胞。

25、在一些实施方案中，该组合物包含t细胞，其中该t细胞显示包括pd-1、lag3、tim-3、ctla4、btla、tigit la的最小耗竭标记物。

26、在一些实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。

27、在一些实施方案中，将细胞输注到患者体内以用于治疗或预防。

28、在其它实施方案中，用于产生t细胞产物的rna可在t细胞产物之前或之后作为初免加强剂施用给同一患者。

29、在一些实施方案中，rna或t细胞可以是新抗原疫苗。

30、在一些实施方案中，新抗原是kras g12a、kras g12c、kras g12d、kras g12r、krasg12s、kras g12v、kras g13d、kras g13c、kras q61k、tp53 e285k、tp53 g245s、tp53r158l、tp53r175h、tp53 r248q、tp53 r248w、tp53 r273c、tp53 273h、tp53r282w和tp53v157f中的一者或多者。

31、在一些方面，本技术提供了治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，这些方法包括向受试者施用根据本技术的任何实施方案的组合物。

32、在一些方面，本技术提供制备组合物的方法，所述组合物包含编码和/或表达结合至与受试者的癌症相关的新抗原的tcr的t细胞，所述方法包括：(a)从该受试者获得血样；(b)对源自该血样的无细胞脱氧核糖核酸(cfdna)进行测序，以鉴定与该受试者的癌症相关的一种或多种新抗原；(c)制备编码与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的信使核糖核酸(mrna)或对应于与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的肽；(d)从该血样中分离单核细胞并保存该血样的剩余细胞，其中这些剩余细胞包括t细胞；(e)使所分离的单核细胞分化成树突状细胞(“dc”)；(f)将这些dc与来自(c)的该mrna或肽组合，以获得编码和/或表达与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的dc；(g)通过使来自(d)的t细胞与来自(f)的dc接触来刺激来自(d)的t细胞；以及(h)获得包含编码和/或表达tcr的t细胞的组合物，该tcr结合至与受试者的癌症相关的新抗原。

33、在一些实施方案中，mrna编码与受试者的癌症相关的所有新抗原。

34、在一些实施方案中，mrna编码与受试者的癌症相关的多种新抗原。

35、在一些实施方案中，肽还包含多种肽，该多种肽包括与受试者的癌症相关的所有新抗原。

36、在一些实施方案中，mrna编码与受试者的癌症相关的所有常见的新抗原。

37、在一些实施方案中，肽还包含多种肽，该多种肽包括与受试者的癌症相关的所有常见新抗原。

38、在一些实施方案中，新抗原是kras基因、tp53基因或两者。

39、在一些实施方案中，新抗原是kras g12a、kras g12c、kras g12d、kras g12r、krasg12s、kras g12v、kras g13d、kras g13c、kras q61k、tp53 e285k、tp53 g245s、tp53r158l、tp53r175h、tp53 r248q、tp53 r248w、tp53 r273c、tp53 273h、tp53r282w和tp53v157f中的一者或多者。

40、在一些实施方案中，新抗原是表1至表10和表11中列出的一者。

41、在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。

42、在一些实施方案中，mrna和/或肽至少约80％纯和/或mrna具有帽15'结构并取代了化学修饰的尿嘧啶核苷酸，诸如5-甲氧基尿嘧啶。

43、在一些实施方案中，mrna和/或肽包含小于20％的任何其它物质。

44、在一些实施方案中，将步骤(g)重复至少一次。

45、在一些实施方案中，使单核细胞分化成dc包括使单核细胞与多种细胞因子接触。

46、在一些实施方案中，使全部或基本上全部的单核细胞分化成dc。

47、在一些实施方案中，使单核细胞分化成dc还包括通过使dc与成熟组合物接触来使dc成熟。

48、在一些实施方案中，dc和t细胞在单个或多个封闭系统生物反应器中培养。

49、在一些实施方案中，可通过核转染，优选4d核转染引入rna。

50、在一些实施方案中，可通过脂质纳米颗粒引入rna。

51、在其它实施方案中，可在封闭系统中从盒中接种并释放dc。

52、在一些实施方案中，刺激t细胞还包括将细胞因子引入细胞。

53、在一些实施方案中，刺激t细胞促进了cd4+、cd3+和/或cd8+t细胞的扩增。

54、在一些实施方案中，患者体内存在的mhc和tcr的全遗传多样性用于在单个生物反应器中靶向多个新抗原

55、在其它实施方案中，通过在实时细胞粘附测定(rtca)中杀伤表达肿瘤抗原的细胞来测量t细胞杀伤肿瘤细胞的能力

56、在一些实施方案中，通过杀伤用rna转染的细胞来测定t细胞杀伤肿瘤细胞的能力

57、在其它实施方案中，t细胞被活化为抗原的能力可通过elispot测定，其中rna表达抗原靶标

58、在一些方面，本技术提供了制备包含dc的组合物的方法，这些树突状细胞编码和/或表达与受试者的癌症相关的一种或多种新抗原，这些方法包括：(a)从该受试者获得血样；(b)对源自该血样的cfdna进行测序，以鉴定与该受试者的癌症相关的一种或多种新抗原；(c)制备编码与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的mrna或对应于与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的肽；(d)从该血样中分离单核细胞；(e)使所分离的单核细胞分化成dc；(f)将这些dc与来自(c)的该mrna或肽组合，以获得编码和/或表达与该受试者的癌症相关的该一种或多种新抗原的dc。

59、在一些方面，本技术提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用包含编码和/或表达tcr的t细胞的组合物，该tcr结合至与受试者的癌症相关的新抗原，其中这些t细胞源自该受试者。

60、在一些实施方案中，癌症治疗包括抑制受试者的癌细胞生长，减少受试者的癌细胞数量，减缓受试者的癌症进展，降低受试者的癌症复发的可能性，或减少受试者的与癌症相关的一种或多种症状。

61、在一些实施方案中，癌症选自结肠癌、肺癌、胰腺癌、aml、黑素瘤、膀胱癌、血液学癌症和成胶质细胞瘤。

62、在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。

63、在一些实施方案中，给受试者施用的t细胞剂量为受试者体重的约1×105个细胞/kg至约5×105个细胞/kg。

64、在一些实施方案中，在首次施用该组合物之后治疗受试者的癌症。

65、在一些实施方案中，这些方法还包括将一种或多种基因转移至t细胞中。

66、在一些实施方案中，将一种或多种基因转移至t细胞中包括：将包含对应于该一种或多种基因的核酸的一种或多种载体转移至t细胞中，其中该一种或多种载体是慢病毒载体、质粒载体和/或腺病毒载体。

67、在一些实施方案中，这些方法还包括用凋亡抑制剂诸如步骤(g)中的rho激酶(rock)抑制剂或者痘苗病毒b18r重组蛋白质处理t细胞。

68、在一些实施方案中，rock抑制剂是rock1抑制剂、rock2抑制剂或两者。

69、在一些实施方案中，这些方法还包括通过用另外的t细胞接种t细胞来刺激t细胞。

70、在一些实施方案中，这些方法还包括用rna转染t细胞。

71、在一些实施方案中，转染通过分子的瞬时表达增加t细胞的寿命和活性。

72、在一些实施方案中，这些方法还包括使用crispr、talen、锌指、归巢核酸内切酶、睡美人或其它基因编辑技术来敲除t细胞中的β2-微球蛋白(b2m)。

73、在一些实施方案中，将具有β2-微球蛋白敲除的同种异体细胞产物施用给患者，而不需要(或仅需要低水平)通过化疗、放射或免疫抑制剂进行调节。

74、在其它实施方案中，它们可在施用自体同源t细胞产物之前施用以管理患者。

75、在一些实施方案中，将具有β2-微球蛋白敲除的同种异体细胞产物施用给患者，而不需要(或仅需要低水平)通过在血液中具有比具有野生型β2-微球蛋白的那些细胞更长的半衰期的化疗、放射或免疫抑制剂进行调节。

76、在一些实施方案中，具有β2-微球蛋白敲除的同种异体细胞产物在部分mhc匹配或完全不匹配的t细胞存在下比具有野生型β2-微球蛋白的那些细胞表现出更长的存活。

77、在其它实施方案中，此类具有β2-微球蛋白敲除的同种异体细胞产物在患者血液中表现出更长的半衰期。

78、在其它实施方案中，可通过核转染、用脂质纳米颗粒转染或通过其它rna手段修饰t细胞以增强t细胞抑制、克服或修饰肿瘤微环境的能力。在一些实施方案中，所引入的核酸导致肿瘤微环境中的促炎变化。

79、在一些实施方案中，所引入的核酸由环状rna、自我复制rna或化学合成的mrna组成，所有这些都具有或不具有取代或修饰的核苷以延长所引入的rna的半衰期用于延长的表达。

80、在一些实施方案中，该半衰期可以是3天至5天。在其它实施方案中，该半衰期可以是1周至3周。在其它实施方案中，半衰期可以是1个月、2个月、3个月、6个月、12个月或其间的任何时间。

81、在其它实施方案中，用这种rna核转染的t细胞在肿瘤微环境中具有存活优势。

82、在其它实施方案中，用这种rna核转染的t细胞充当此类微环境修饰分子穿过肿瘤的递送媒介物。

83、在其它优选实施方案中，对多种癌抗原具有反应性的用这种rna核转染的t细胞充当此类微环境修饰分子穿过异源肿瘤的递送媒介物。

84、在其它实施方案中，针对多种新抗原刺激t细胞，对其t细胞进行tcr的单细胞测序，并将tcr组库转染到新鲜t细胞中。

85、在一些实施方案中，将一个或多个基因转移至t细胞中包括：经由成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)介导的插入将对应于该一个或多个基因的一种或多种核酸插入到t细胞的基因组中。

86、在一些实施方案中，插入是通过内源tcr的敲除与所转染的tcr的相继或同时敲入来进行的。

87、在其它实施方案中，使用脂质纳米颗粒制剂或核转染将编码病毒、新抗原或抗原的rna直接转染到pbmc中，然后将t细胞暴露于细胞因子和抗cd3、抗cd28抗体以扩增t细胞产物。

88、在一些方面，本技术提供了治疗对其有需要的受试者的病毒感染的方法，这些方法包括向该受试者施用包含编码和/或表达tcr的t细胞的组合物，该tcr结合至与病毒相关的病毒抗原，其中这些t细胞源自该受试者。

89、在一些实施方案中，病毒抗原是由以下项中的一者或多者表达的蛋白质：巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、乙肝病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、人呼吸道合胞病毒、痘苗病毒、水痘带状疱疹病毒、黄热病病毒、埃博拉病毒、冠状病毒(例如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2)、东部马脑炎病毒、polyomavirus hominis1(bkv)、sv40和寨卡病毒。

90、在一些实施方案中，在首次施用该组合物之后治疗受试者的病毒感染。

91、在其它实施方案中，疫苗含有来自多种病毒蛋白质的抗原

92、在优选实施方案中，该疫苗是rna或dna。

93、在其它优选实施方案中，该疫苗靶向来自sars-cov-2的多种病毒蛋白质的抗原

94、在优选实施方案中，所选择的抗原反映了对病毒的天然免疫中的有效清除应答

95、在其它优选实施方案中，该疫苗靶向来自sars-cov-2的多种病毒蛋白质的抗原，包括以下中的两种或更多种：cov-2 s、m、n、3a、7a、8。

96、在一些实施方案中，对病毒和新抗原具有反应性的t细胞均存在于t细胞产物中以治疗或预防癌症。

97、在其它实施方案中，t细胞产物和/或dc可在封闭系统中进行制造。