一种以包膜蛋白为靶标的基孔肯雅病毒的mRNA疫苗及其制备方法

本发明属于mrna疫苗制备，具体涉及一种以包膜蛋白为靶标的基孔肯雅病毒的mrna疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、基孔肯雅病毒（chikungunya virus, chikv）是一种原发于非洲的蚊媒病毒，属甲病毒属，具有广泛的细胞和组织嗜性，可在除b和t细胞外的大多数细胞类型中复制，通过严重的病毒血症传播至全身，主要引发关节炎症，虽然基孔肯雅热是一种自限性疾病，但是会留下严重后遗症，对老人和小孩的危害较大。

2、起初chikv在非洲东部爆发，随后在非洲各国流行，后在东南亚爆发，后来又在南亚次大陆爆发 chikv有四个主要谱系：（1）西非;（2） 东/中/南非 （ecsa）;（3）亚洲谱系；（4）印度洋谱系。起初chikv仅由埃及伊蚊传播，因此仅在热带地区发生局部爆发，但随着印度洋谱系的诞生，chikv可由分布在温带的白纹伊蚊传播，逐步向温带地区扩散，有全球爆发的趋势。而目前几乎没有上市的安全且效果好的疫苗可用，现有技术下，疫苗制备方法主要有：

3、（1）减毒活疫苗，通过对病毒进行改造使其毒力降低后制备成活疫苗，但病毒进入体内有返祖的趋势，存在安全隐患，且有副作用；

4、（2）灭活疫苗，通过将chikv病毒灭活后制成疫苗，但活毒制备，需重复进行灭活验证，更新代次慢，缺乏良好的t细胞免疫应答，中和抗体存在时间短；

5、（3）重组蛋白疫苗，利用表达系统直接表达出病毒蛋白，甚至可设计为多价或多聚体疫苗，可同时预防多个毒株，但多聚体蛋白折叠后可能不能完全展现抗原全貌，并且其免疫原性相对差，需要合适的佐剂，且免疫周期长；

6、mrna疫苗是一种疫苗形式，其基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mrna导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护，以mrna为基础的药物，特别是mrna疫苗，已被广泛证明是一种很有前途的免疫治疗策略。mrna疫苗的独特优势，包括其高效、相对较低的副作用和低成本，目前，针对基孔肯雅病毒相关的mrna疫苗未见报道。

7、基于此，本发明采用寻找保守序列的方法设计疫苗，设计了一条以包膜蛋白为靶点的保守氨基酸序列，为基孔肯雅病毒的防治提供一种更安全和高效的疫苗。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种以包膜蛋白为靶标的基孔肯雅病毒的mrna疫苗及其制备方法，为基孔肯雅病毒的防治提供新方法，具体的，本发明提供以下技术方案：

2、本发明提供了如seq id no：1所示的核苷酸序列在制备基孔肯雅病毒的mrna疫苗中的应用。

3、进一步的，本发明提供如seq id no：2所示的蛋白在制备基孔肯雅病毒的mrna疫苗中的应用，如seq id no：2所示的蛋白由seq id no：1所示的序列转录、翻译获得。

4、作为一种实施方式，本发明提供一种重组质粒，所述重组质粒的结构为：puc57-t7-5’utr-e3-e2-6k-e1-3’utr-polya，编码区e3-e2-6k-e1的核苷酸序列如seq id no：1所示，5’utr核苷酸序列如seq id no：3所示，3’utr核苷酸序列如seq id no：4所示。

5、进一步的，本发明提供一种基孔肯雅病毒的mrna疫苗，所述疫苗包括疫苗本体和疫苗载体，其特征在于，所述疫苗本体以基孔肯雅病毒包膜蛋白为靶标，所述包膜蛋白的序列如seq id no：2所示。

6、进一步的，所述疫苗本体由所述的重组质粒在体外进行酶切线性化，并转录获得。

7、进一步的，所述疫苗本体的序列如seq id no：5所示。

8、进一步的，所述疫苗载体为脂质纳米粒。

9、优选的，所述脂质纳米粒为： sm102、dmg-peg2000、dspc和胆固醇依次按照摩尔百分比50%，1.5%，10%，38.5%进行混合后溶解到无水乙醇溶液中获得。

10、作为一种实施方式，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒含有所述的重组质粒或任一所述的疫苗。

11、作为一种实施方式，一种基孔肯雅病毒的mrna疫苗的制备方法，包括以下步骤：

12、s1：构建含seq id no：1所示的核苷酸序列的重组质粒；

13、s2：将重组质粒进行酶切线性化，对线性化模板进行体外转录，得到mrna疫苗本体；

14、s3：制备疫苗载体：脂质纳米粒溶液；

15、s4：将mrna疫苗本体溶解在柠檬酸缓冲液，并与脂质纳米粒溶液混合，然后超滤获得所述mrna疫苗。

16、本发明达到的技术效果：

17、本发明采用寻找保守序列的方法设计疫苗，设计了一条以包膜蛋白为靶点的保守氨基酸序列，并鉴于mrna疫苗在sras-cov-2爆发期间的出色表现，我们将其设计成mrna疫苗mrna-chikv-e，通过微流控的方法将其制备成脂质纳米颗粒（lnp），并免疫balb/c小鼠，采用真病毒中和实验检测该mrna疫苗免疫小鼠后产生中和抗体水平及用亚洲谱系毒株的灭活病毒及印度洋谱系的e2（sino biological 40440-v08b）蛋白进行elispot实验检测细胞免疫。发现，小鼠在经过两次免疫后对马来西亚株产生了中和抗体，并对亚洲谱系及印度洋谱系的毒株均产生了高水平t细胞免疫应答，并且免疫后的小鼠完全控制了病毒血症的出现，这说明所设计的疫苗具有一定的免疫原性且可以引发良好的t细胞免疫应答，具有良好的保护效力。

技术特征：

1.如seq id no：1所示的核苷酸序列在制备基孔肯雅病毒的mrna疫苗中的应用。

2.如seq id no：2所示的蛋白在制备基孔肯雅病毒的mrna疫苗中的应用，其特征在于，如seq id no：2所示的蛋白由seq id no：1所示的序列转录、翻译获得。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的结构为：puc57-t7-5’utr-e3-e2-6k-e1-3’utr-polya，编码区e3-e2-6k-e1的核苷酸序列如seq id no：1所示，5’utr核苷酸序列如seq id no：3所示，3’utr核苷酸序列如seq id no：4所示。

4.一种基孔肯雅病毒的mrna疫苗，所述疫苗包括疫苗本体和疫苗载体，其特征在于，所述疫苗本体以基孔肯雅病毒包膜蛋白为靶标，所述包膜蛋白的序列如seq id no：2所示。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗本体由权利要求3所述的重组质粒在体外进行酶切线性化，并转录获得。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗本体的序列如seq id no：5所示。

7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗载体为脂质纳米粒。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述脂质纳米粒为： sm102、dmg-peg2000、dspc和胆固醇依次按照摩尔百分比50%，1.5%，10%，38.5%进行混合后溶解到无水乙醇溶液中获得。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3所述的重组质粒或权利要求4-8任一所述的疫苗。

10.一种基孔肯雅病毒的mrna疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明属于mRNA疫苗制备技术领域，具体公开一种以包膜蛋白为靶标的基孔肯雅病毒的mRNA疫苗及其制备方法，具体的本发明提供如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在制备基孔肯雅病毒的mRNA疫苗中的应用，本发明设计出针对CHIKV不同谱系具有交叉保护性的疫苗，降低生产成本与免疫周期，可有效的应对CHIKV的爆发。

技术研发人员：鲁帅尧,梁晓鸣,唐聪,王俊斌,杨云,周亚楠,杨浩,黄青,禹文海
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31