专利名称：一种登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种四种虫媒性传播病原体鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时突光聚合酶链式反应技术检测登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒的试剂盒。本试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O,以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒能准确区分登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒以及基孔肯雅病毒，可广泛应用于由上述虫媒传播病毒所引起的的鉴别诊断、检验检疫、疫情防控等多个领域。
背景技术：
虫媒病毒(Arbovirus)是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内 繁殖，但昆虫本身不发病，通过叮咬将病毒传播给人、畜，因此虫媒病毒可以引起人畜共患病。国际上已发现537种虫媒病毒，其中130余种可引起人畜疾病，导致发热、皮疹和关节痛、出血热、休克等，严重的可以引起死亡。此外30种虫媒病毒可引起脑炎。虫媒病毒分布世界各地，并可因人群的流动、宿主和媒介的迁移而传播到异地。登革热(Dengue fever)、黄热(Yellow fever virus)、西尼罗热(West Nile fever)和基孔肯雅热(Chikungunyafever)四种疾病是威胁着热带或亚热带国家人民健康的重要虫媒病毒性传染病，分别因感染登革热病毒(Dengue virus, DV)、黄热病毒(Yellow fever virus, YFV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIK)所引起。我国广东、广西、贵州、海南、云南等地处亚热带气候，有多种虫媒病毒存在和传播的条件，自1978年在广东佛山发生登革热流行以来，广东省每年都有可能由输入性病例引起的登革热后续感染流行的疫情报告，黄热每年都有发生，而西尼罗热和基孔肯雅热极有可能存在输入的可能并造成流行。由于登革热、西尼罗热和基孔肯雅热在临床症状上非常相似，而诊断鉴别对分离培养条件要求较高，因此不排除已存在输入性西尼罗热或基孔肯雅热病例；另外，海南、云南二省已经发现过基孔肯雅病毒并从人群中检出过相应的抗体。登革、黄热、西尼罗和基孔肯雅等四种病毒中，除黄热病毒在我国南方区域广泛存在外，其余三种病毒，特别是登革病毒，需严防入境人员或蚊虫带入；即使已经传入，各地医疗、疾控部门也必需尽早发现，以把疫情控制在最小范围。WHO统计的数字显示，全球每年感染登革病毒的人数高达5000万人，特别在我们毗邻的东南亚各国，一年四季都有登革热流行，对人民的身体健康造成极大的危害；西尼罗热是起源和流行于非洲的虫媒传染病，在二十世纪末，作为一种再发的传染病(Emerging Infectious Disease)传到北美洲后,给美国和加拿大等北美各国带来了重大经济损失和极大的恐慌，单在美国2002年就报告4156例，死亡284例，随后疫情扩散到44个州，2003年又报告9306病例，死亡240例；而近几年中，在我国周边的印度、斯里兰卡等国家，数以万计的人感染基孔肯雅热，2006年上半年，仅印度南部嘻拉拉邦(Kerala)暴发由蚊子传播的基孔肯雅热,最少造成了 87人死亡；2005年3月，太平洋岛国留尼汪的官方数据显示，全国20%的人口约157000人被基孔肯雅病毒感染，死亡77人。周边国家如此严峻的形势正在威胁着我们，我国自从加入WTO后，经国境口岸的人员和货物往来极其频繁，登革、西尼罗、基孔肯雅等病毒随时都有可能被感染的人或蚊虫带入的危险。亟待建立快速鉴别和检测的方法并进行应用。登革热、黄热、西尼罗热和基孔肯雅热四种疾病都是通过带毒蚊子叮咬人而传播，发病初期症状极其相似，难以鉴别；并且具有传染快、易流行等特点，一旦发生，将严重威胁人们健康和社会安定。为了有效防控上述虫媒病毒性疾病的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是一个重要的环节，而对于各出入境口岸来说，在不影响入境人员和货物快速通关前提下，如能在有效时间内，实现对人员以及船舱、货物中可能携带的蚊子进行快速筛查；同时，快速检测各口岸周边环境中蚊子携带病毒情况、建立有效防控网络，以防上述病毒的传入，将具有非常重大的意义。目前，国内外对上述病毒的诊断方法，主要还是依靠血清学试验、组织培养和常规的PCR检测，其中，血清学试验、组织培养。具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺 点；而常规PCR也存在容易污染的不足。多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行扩增，各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到诊断病毒类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光PCR技术应用于4种虫媒的快速检测，能够节约时间、减少取材数量、提高工作效率，能在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染某种病毒，及时采取必要的防控措施，防止这些病毒从境外传入，降低传染病疫情在国内流行爆发的风险，为快速诊断、有效监测和控制疾病的发生和传播提供支持和依据。本发明采用实时荧光PCR技术中的多重实时荧光PCR方法，对四种虫媒病毒(登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒)核酸进行扩增，根据标记的四色荧光的扩增情况，来鉴别四种虫媒病毒。本发明的试剂盒可广泛地运用于由登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒的检验检疫、疫情监测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术进行四种虫媒病毒鉴别检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒。在对GENBANK上所有已知的登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒株的核酸序列进行比对的基础上，分别寻找三种病毒核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。本发明所涉及的试剂盒主要包括I) RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O,阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由一对登革病毒特异性的正、反向引物，一条登革病毒特异性的探针，一对黄热病毒特异性的正、反向引物，一条黄热病毒特异性的探针，一对西尼罗病毒特异性的正、反向引物，一条西尼罗病毒特异性的探针，一对基孔肯雅病毒特异性的正、反向引物，一条基孔肯雅病毒特异性的探针组成，其特征在于登革病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’ -GATTCTCAAAAGGATTGCTCTC-3’ (SEQ ID NO :1)和 5’-TTGTTAGGAATGCTATGAAGGC-3’ (SEQ ID NO 2);登革病毒特异性的探针的序列是 5’ _catca+Cca+Att+Tca+Tgg+Gtc_3’ (SEQID NO 3)(喊基如含“ + ” 表不该喊基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ;黄热病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’ -AAACAAAACAAATTGGAAACAG-3’ (SEQID NO:4)和5’ -TTTTCCAGTCAAAATGTTGAAC-3’ (SEQ ID NO :5)，黄热病毒特异性的探针的序列是 5’ _cttg+Aac+Acc+Tct+tgA+agG+Tcc_3’ (SEQID NO :6)(喊基如含 “ + ” 表不该喊基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse ;西尼罗病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5 ’ -CCGCCACCGGAAGTTGA—3，(SEQ ID NO7)和5’ -CGAGACGGTTCTGAGGGCT-3，(SEQID NO :8)，西尼罗病毒特异性的探针的序列是 5’ -caa+Cccc+Agga+Ggact-3’ (SEQ ID NO :9)(碱基前含 “ + ” 表示该碱基为 LNA 修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团ffiX和荧光淬灭基团Eclipse ;基孔肯雅病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是 5’-GTGGGAGTACCGTATAAGACTC-3’ (SEQ ID NO 7)和 5’-CAGACAGAAGCTCCATCTCC-3’ (SEQID NO :8)，基孔肯雅病毒特异性的探针的序列是5’_cta+Cag+Ccc+Cat+Ggt+Act-3’ (SEQ ID NO :9)(碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团Texas Red和荧光淬灭基团Eclipse。本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0. lmmol/Lo本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl (50mmol/L, pH8. 0)、MgCl2 (8mmol/L) > KCl (250mmol/L)组成。本发明的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成。逆转录酶可选择mMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5U，逆转录酶用量为5U，dNTPs用量为IOmmol。本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为50°C 15分钟，95°C 15分钟；94°C 15秒，55°C 45秒，40个循环(55°C时收集荧光信号)；40°C 10秒。本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有四种病毒核酸的DEPC H2O溶液，由四种病毒阳性核酸按照浓度为2. OX 103copies/mL 5. OX 107copies/mL等体积比混合而成。优选I. OX 105copies/mL,并以等体积比混合均勻制备成阳性质控品。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测四个通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于流感病毒分型、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。本发明与现有技术相比优点为①对四种病毒核酸扩增水平进行检测，可反映出样本中登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒感染的状态，可用于四种虫媒传播病原体的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗多重实时荧光PCR技术针对多种病毒核酸特异性序列设计引物、探针，具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，更适用于大多数患者检测；③一份样本一次检测即可鉴别四种虫媒传播病原体的感染情况及感染的型别，相比一个样本做4次检测来说，大大减少了工作量，提高了检测效率；④采用特殊LNA标记探针，比常规探针序列短5-10bp左右也可达到较高的Tm值，而短序列可更保守地扩增目的片段，可大大提高检测的准确率，减少漏检几率出现。
图I显示PCR扩增的反应条件。图2显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、HEX、 Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阴性。图3显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。图4显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。图5显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中Texas Red通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。图6显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中CY5通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。图7显示4例阳性血清样本的扩增曲线。图中4例样本的FAM通道的扩增曲线为S型,说明该样本有登革病毒核酸的扩增,表不样本中存在登革病毒。图8显示I例阳性血清样本的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明该样本有西尼罗病毒核酸的扩增，表示样本中存在西尼罗病毒。图9显示I例阳性血清样本的扩增曲线。图中Texas Red通道扩增曲线均为S型，说明该样本有基孔肯雅病毒核酸的扩增，表示样本中存在基孔肯雅病毒。图10显示I例阳性血清样本的扩增曲线。图中Cy5通道扩增曲线均为S型，说明该样本有黄热病毒核酸的扩增，表不样本中存在黄热病毒。图11显示乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒样本的扩增曲线。图中无扩增曲线，说明该样本中不含有登革病毒或西尼罗病毒或基孔肯雅病毒或黄热病毒核酸。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例I登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒及其使用I、制备包括下列组成成分的试剂盒引物探针混合液(25iU/管)1管，RT-PCR反应液(250 Ul/管)，RT-PCR反应酶系(75 iil/管)I管，阳性质控品(200 yl/管)I管，阴性质控品(200iil/管)1 管，DEPC 40(2000111/管)1管。2、标本的采集、保存和运输2. I标本类型血清、蚊虫样本。2. 2标本采集2. 2. I血清无菌采集发病后5天内静脉血3 5ml，室温静置30分钟使其凝固，然后1500 2000rpm离心IOmin,去除纤维蛋白和血红球,收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。
2. 2. 2蚊虫根据实际工作需要采集蚊子标本。将采集的蚊子直接放入_20°C冰箱冻死后，取出，分类编号，按30 50只一份，装入2ml螺口塑料血清管内。进行核酸提取前，取出样本于灭菌研钵中，加适量液氮进行破碎处理后，再加入400 500 ill DEPC H20(4°C预冷)对破碎标本快速进行匀浆处理，取溶液立即进行核酸提取操作。2. 3样品保存和运送血清标本或分类分组后的蚊子标本，装入螺口塑料血清管，用耐低温油性记号笔记上编号，于_70°C以下运输或保存待检。亦可参照有关国家标准或有关行业标准中推荐的方法。3、核酸提取可采用市售的RNA提取试剂盒，建议使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒，并按照试剂盒的说明书进行操作，最后收集到50 Ul RNA溶液，直接进行检测或保存于-20 °C。4、实时荧光定量PCR扩增及检测4. I试剂准备按比例取相应量的引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系(引物探针混合液I U I/人份+RT-PCR反应液5 iil/人份+RT-PCR酶系3 yl/人份+DEPCH2O Ilu I/人份)，充分混匀后按20 u I/管分装成PCR反应管，备用。4. 2加样向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本RNA溶液5 ，盖紧管盖，放入仪器样品槽。4. 3 编辑(ABI Prism7500 荧光定量 PCR 仪)打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector,选择Reporter为FAM和Quencher 为 none,再选择 Reporter 为 HEX 和 Quencher 为 none ;再选择 Reporter 为 TexasRed和Quencher为none ;然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在Passive Reference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件50°C 15分钟，950C 15分钟；94°C 15秒，55°C 45秒，40个循环(见附图I)。所有设置完成后保存文件，运行。4. 4结果分析反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Base line数值改为start :3, stop :10,并打开manual设定Threshold
I.5 ±100000。双击 Rn 坐标上数值打开 Graph settings 窗口，将 Post Run Settings 中Log 改为 Linear, OK 后打开 Analysis preferences 窗口，在 Analysis 菜单下选择 Analyze自动分析结果。实施例2应用登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒检测临床样品选取经过病毒培养方法分别鉴定为登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒阳性血清标本各I例，以及经病毒培养方法鉴定为乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒阳性的血清样本各I例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例I进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。检测结果阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图2)，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线(见附图3，4，5，6)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒均检测到相应的登革病毒四种亚型、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒核酸的扩增(见附图7，8，9，10);对乙型脑 炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒无非特异扩增(见附图11)。本次试验中11例标本的检测结果与病毒培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测及区分登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，有望应用于四种虫媒传播病原体的临床检测、检验检疫以及疫情监测。
权利要求
1.一种登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒，包括1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O,阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物探针混合液由一对登革病毒特异性的正、反向引物，一对黄热病毒特异性的正、反向引物，一对西尼罗病毒特异性的正、反向引物，一对基孔肯雅病毒特异性的正、反向引物，一条登革病毒特异性的探针，一条黄热病毒特异性的探针，一条西尼罗病毒特异性的探针，一条基孔肯雅病毒特异性的探针组成，其特征在于 登革病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’ -GATTCTCAAAAGGATTGCTCTC-3’和5’ -ITGTTAGGAATGCTATGAAGGC-3’，登革病毒特异性的探针的序列是 5’ -catca+Cca+Att+Tca+Tgg+Gtc-3’ (碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ;该对引物探针可检测登革病毒所有亚型，包括I型、II型、III型及IV型； 黄热病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-AAACAAAACAAATTGGAAACAG-3’，和5’ -TITTCCAGTCAAAATGITGAAC-3’ 黄热病毒特异性的探针的序列是 5’ -cttg+Aac+Acc+Tct+tgA+agG+Tcc-3’ (碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse ； 西尼罗病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5 ’ -CCGCCACCGGAAGTTGA-3 ’和5’ -CGAGACGGTTCTGAGGGCT-3’，西尼罗病毒特异性的探针的序列是5’ -caa+Cccc+Agga+Ggact-3’ (碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰)，探针的两端分别结合有荧光发生基团ffiX和荧光淬灭基团Eclipse。 基孔肯雅病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5，-GTGGGAGTACCGTATAAGACTC-3’和 5’ -CAGACAGAAGCTCCATCTCC-3，，基孔肯雅病毒特异性的探针的序列是5’ -cta+Cag+Ccc+Cat+Ggt+Act-3’ (喊基如含“ + ”表不该喊基为LNA修饰),探针的两端分别结合有荧光发生基团Texas Red和荧光淬灭基团Eclipse。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征还在于所用探针采用特殊LNA标记。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L,探针浓度均为 0. Immol /L
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应液由pH值为8.0的50mmol/LTris-HCl>8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl 组成。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其中RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，特征在于每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5U，逆转录酶用量为 5U，dNTPs 为 IOmmol。
6.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为50°C15分钟，95°C 15分钟；94°C 15 秒，55°C 45 秒，40 个循环；40°C 10 秒。
7.根据权利要求I的试剂盒，还提供了阴性质控品和阳性质控品，其特征在于阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有登革、黄热、西尼罗、基孔肯雅这四种病毒核酸的DEPCH2O溶液，由四种病毒阳性核酸按照浓度为I. OX 105COpieS/mL浓度等体积比混合而成。
全文摘要
本发明涉及一种四种虫媒性传播病原体鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术检测登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒的试剂盒。本试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒能准确区分登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒以及基孔肯雅病毒，可广泛应用于由上述虫媒传播病毒所引起的鉴别诊断、检验检疫、疫情防控等多个领域。
文档编号C12Q1/68GK102776297SQ20121028219
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者丁国允, 师永霞, 李小波, 李明, 郑夔, 陈华云, 高秀洁, 黄吉城 申请人:中山大学达安基因股份有限公司, 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心