专利名称：微生物转化葡萄糖制备木糖醇及其中间体d-木酮糖的方法及所用的菌种的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种木糖醇中间体一D-木酮糖的制备方法、利用该中间体制备木糖醇的方法以及所用到的菌种，具体涉及一种以葡萄糖为原料通过微生物转化制备D-木酮糖及木糖醇的方法以及所用的菌种。
背景技术：
木糖醇属于五碳多元醇，是一种天然甜味剂。木糖醇不被口腔中细菌利用，具有优良的防龋齿功能。另一方面，木糖醇无需胰岛素参与，可直接进入人体细胞进行代谢补充能量，不会引起血糖升高，可减轻糖尿病人多饮多食多尿症状。木糖醇甜度和蔗糖相当，但具有比蔗糖更低的卡路里；与其他糖醇相比，它具有最高的溶解热，食用有清凉感，因此木糖 醇是一种理想的蔗糖替代品，近年来广泛应用于口香糖、牙膏、无糖食品、医药等领域。
目前木糖醇的生产方法可分为以下两种
I.化学合成法是工业上常用的生产木糖醇的方法，其基本原理为多缩戊糖经酸水解得到木糖，木糖在镍的催化作用下氢化生成木糖醇，该方法虽然原料易得，但是其工艺复杂、副产物多、分离提纯困难、对设备要求高、过程中消耗大量的酸碱和产生大量废弃物、污染环境严重，导致目前木糖醇价格较高，这也在一定程度上限制了木糖醇的广泛应用。2.生物转化法根据原料不同分为(I)以木糖为原料将农业废弃物如玉米芯、稻草、甘蔗渣等中的木聚糖经稀酸水解后，得到主要产物为木糖的水解液，然后利用微生物发酵水解液中的木糖生成木糖醇，但该法发酵液木糖醇含量很低，分离提取成本仍然很高，不具有工业化意义；(2)以葡萄糖为原料D-葡萄糖在耐高渗酵母的作用下转化成D-阿拉伯糖醇，接着D-阿拉伯糖醇在氧化葡糖杆菌的作用下氧化成D-木酮糖，最后D-木酮糖通过酵母(Candida guilliermodii)的还原作用生成木糖醇,又称为三步发酵法。但该法第一步发酵中，产物阿拉伯糖醇会有明显的产物抑制现象，导致阿拉伯糖醇浓度偏低，此外第三步酵母转化D-木酮糖为木糖醇效率更低，产物浓度不超过30g/L。因此，目前生物转化生产木糖醇主要存在的问题是葡萄糖转化生成阿拉伯糖醇和D-木酮糖转化生产木糖醇效率低下。专利EP403392A和专利EP421882A公开了这样的方法，先用耐高渗酵母生产阿拉伯糖醇，然后通过采用醋酸杆菌属、葡糖杆菌属、克雷白氏杆菌属的细菌将阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，通过葡萄糖(木糖)异构酶作用转化D-木酮糖为D-木糖和D-木酮糖的混合液，上面混合液氢化得到木糖醇。这种方法虽然解决了生物法转化D-木酮糖为木糖醇效率低下的问题，但是耐高渗酵母生成阿拉伯糖醇低效率问题仍然存在，使得该方法生产成本仍然高于化学合成法。生物转化葡萄糖生产木糖醇工艺中，采用耐高渗酵母转化葡萄糖产生阿拉伯糖醇，阿拉伯糖醇会对菌体产生抑制现象，导致中后期阿拉伯糖醇生成速度降低。耐高渗酵母转化葡萄糖为阿拉伯糖醇最适PH 4. 5-5. 5，温度为30-35°C，需要酵母膏、MgSO4, KH2PO4等作为营养成分；而氧化葡糖杆菌转化阿拉伯糖醇生成D-木酮糖速率很快，150 g/L阿拉伯糖醇约20-30 h即可转化完，最适pH 5. 0-5. 5，温度为30-35°C，需要酵母膏、MgSO4、KH2PO4等作为营养成分。从以上可以看出耐高渗酵母和氧化葡糖杆菌的生长及生物转化条件基本一致，利用这一特性，专利CN200410031949. 4中尝试采用微生物混菌发酵生成木糖醇的方法，该方法先分别培养酿酒酵母和氧化葡糖杆菌种液，然后将两者同时接种发酵液混合培养，底物葡萄糖约为160 g/L，最终发酵液木糖醇浓度约为30 g/L，转化效率仍然很低。综上所述，化学合成法生产木糖醇，酸碱和能耗消耗较大，环境污染严重；生物转化法生产木糖醇，条件温和，对环境影响较小，是未来木糖醇生产技术的趋势，但由于其生产木糖醇的效率低，不具有工业化价值。
发明内容
本发明针对现有技术中葡萄糖转化成阿拉伯糖醇效率低下的缺陷，提供了一种微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，该方法可以解除阿拉伯糖醇的反馈抑制，使最终D-木酮糖的产率得到有效的提高。 本发明还提供了利用上述方法制得的D-木酮糖制备木糖醇的方法，该方法所得
木糖醇产率显著提高。本发明还提供了转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母菌种一奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123 CGMCC NO. 6197。发明人通过实验研究发现耐高渗酵母前期转化葡萄糖生成阿拉伯糖醇的效率较高，随着阿拉伯糖醇浓度的增加，转化速率下降，如果前期加入高浓度的阿拉伯糖醇，耐高渗酵母前期转化葡萄糖生成阿拉伯糖醇速率也很慢，表明阿拉伯糖醇对耐高渗酵母有反馈抑制作用；另一方面，氧化葡糖杆菌在高葡萄糖浓度条件下，转化阿拉伯糖醇生成D-木酮糖的速率很慢，分析发现以上因素是导致耐高渗酵母和氧化葡糖杆菌混菌发酵效率不高的原因。在研究过程中，发明人尝试了先培养耐高渗酵母发酵葡萄糖转化为阿拉伯糖醇，中后期接种氧化葡糖杆菌、并且控制葡萄糖浓度在10 g/L以下的方式制备D-木酮糖，发现采用这种方式的混菌发酵可以解除阿拉伯糖醇的反馈抑制，显著提高葡萄糖转化为D-木酮糖的效率。发明人进一步的进行了研究，得到了生产D-木酮糖的技术方案，如下所示
一种微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，以D-葡萄糖为原料，通过将可转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母和可转化阿拉伯糖醇为D-木酮糖的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵得含有D-木酮糖发酵液,发酵液经进一步处理得D-木酮糖，其特征是，混菌发酵包括以下步骤首先，分别制备耐高渗酵母种液和氧化葡糖杆菌种液，然后先将耐高渗酵母种液接种到含葡萄糖的发酵培养基中进行发酵培养，将葡萄糖转化为阿拉伯糖醇，在耐高渗酵母发酵中后期再将氧化葡糖杆菌种液接种到发酵液中，同时控制发酵液中葡萄糖含量为5-10 g/L，继续发酵将阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，得含有D-木酮糖的发酵液。上述制备D-木酮糖方法的主要创新点是将混菌发酵的方法由原先的将两种菌种培养液同时加入含葡萄糖培养基中进行混菌发酵，使葡萄糖转化成阿拉伯糖醇和阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖的方式变为先在葡萄糖中接种耐高渗酵母转化葡萄糖为阿拉伯糖醇，在发酵中后期再接种氧化葡糖杆菌进行发酵将阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，控制过程中葡萄糖的浓度10g/L左右，解除阿拉伯糖醇的反馈抑制作用，以提高阿拉伯糖醇的转化率，提高D-木酮糖的产率。图2为微生物混菌发酵生产木糖醇中间体(D-木酮糖)典型过程曲线图，从图中可以看出耐高渗酵母接种后，OD值(菌体量)迅速增加，20 h时进入稳定期，与此同时，阿拉伯糖醇开始生成；在20-80 h，菌体生长缓慢，葡萄糖快速消耗，阿拉伯糖醇快速生成；在80h接种氧化葡糖杆菌后，菌体出现二次生长，阿拉伯糖醇含量迅速下降，100 h时降到3 g/L,此后一直保持较低水平，过程中D-木酮糖含量迅速升高，直到发酵140 h后OD值下降，D-木酮糖生产速率逐渐下降，发酵150 h,发酵液中D-木酮糖含量148 g/L。上述方法中，所用的耐高渗酵母和氧化葡糖杆菌可以是现有技术中公开的可用于葡萄糖转化为D-木酮糖的所有耐高渗酵母菌种和氧化葡糖杆菌菌种，例如专利EP403392A、专利EP421882A和专利CN200410031949. 4中公开的菌种，只要按照本发明的方式进行混菌发酵均可起到解除阿拉伯糖醇反馈抑制、提高葡萄糖转化为D-木酮糖效率的目的。在使用现有技术公开的菌种，其培养时间和培养条件根据现有技术公开的内容即可实现。 进一步的，上述方法中，可转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母优先选用发明人自行筛选的奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)TL-1123,该TL-1123菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCCNO. 6197。该菌种能够耐高渗、耐高温，在200 g/L葡萄糖和35°C条件下可以正常生长繁殖，能够高效转化葡萄糖生成阿拉伯糖醇，转化率可达44%，发酵液中D-木酮糖的含量可达150g/L。该菌种筛选过程为
①将桃树、南瓜、西瓜花粉等样品，在无菌条件下接入富集培养基中(2 X 25 cm试管，装液量10 mL)于35 ° C，220 r/min下培养2 4 d。富集培养基组成(g吨―1):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3。②用移液枪以10%接种量移将①中的培养液转接入装有10 mL的富集培养基摇管中培养广3天，如此重复3 4次，将菌液稀释涂布于分离培养基中进行平皿分离，于35° C下培养2 4 d。平板分离和斜面保藏培养基组成(g · Γ1):富集培养基+琼脂20。③将分离获得的单菌落扩大培养，于30 ° C下培养2 4 d后，分别接入装有50 mL初筛发酵培养液的三角瓶内(250 mL摇瓶装50 mL发酵液)，35 ° C下培养3 d，发酵培养结束后，检测D-阿拉伯糖醇含量，留取产率较高的菌株进行复筛。初筛发酵培养基组成(g · L-1):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3，CaC0315。④将复筛菌株接入装有50 mL复筛发酵培养液的250 mL三角瓶内，35 ° C下培养3 d，发酵培养结束后，检测D-阿拉伯糖醇含量，选取阿拉伯糖醇产率高的菌株进行进一步发酵实验和菌种鉴定实验。复筛发酵培养基组成(g ·Ι^):葡萄糖200，酵母膏3，蛋白胨 3，CaCO315 ο进一步的，上述方法中，可转化阿拉伯糖醇为D-木酮糖的氧化葡糖杆菌优选专利CN200910024579. 4 中公开的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans) NH-10,保藏号CGMCCNo.2709。进一步的，上述方法中，混菌发酵具体包括以下步骤首先，分别制备耐高渗酵母种液和氧化葡糖杆菌种液，然后按5-15%的接种量，先将耐高渗酵母种液接种到含有葡糖糖的发酵培养基中，在100-200 rpm，通气比为O. 3-0. 8 L/L*min，30_35°C条件下发酵培养65-85 h，将葡萄糖转化为阿拉伯糖醇；然后再将氧化葡糖杆菌种液按5-15%的接种量接种到发酵液中，在100-200 rpm，通气比为O. 3-0. 8 L/L*min，30_35°C条件下继续发酵，同时在发酵液中流加葡萄糖和碱性物质溶液(碱性物质溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等的水溶液)，使发酵液中葡萄糖含量为5-10 g/L、pH为4. 6-5. 4，整个发酵时间持续130-150 h后停止补充葡萄糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽后停止发酵，得含有D-木酮糖的发酵液。进一步的，发酵培养基组成为葡萄糖120-160 g/L，玉米浆5-10 g/L，酵母膏3-5g/L, KH2PO4 3-4 g/L, MgSO4 O. 5-1. 5 g/L, pH 5. 0-5. 5。进一步的，耐高渗酵母种子液采用下述方法制备取一接种环斜面保存的耐高渗酵母菌种，接种在种子培养基A中，在100-250 rpm、30_35°C条件下培养10-20 h，得一级种液，将所得一级种液按5-15%的接种量接种到种子培养基A中，在100-200 rpm、通气比为 O.3-0. 8 L/L*min、30-35°C条件下扩大培养12-20 h，得耐高渗酵母种液；种子培养基A组成为葡萄糖 60-80 g/L,玉米衆 5-10 g/L,酵母膏 3-5 g/L, MgSO4 O. 5-1. 5 g/L,自然 pH;
氧化葡糖杆菌种子液采用下述方法制备将一支氧化葡糖杆菌斜面上的全部菌体接种到种子培养基B中，在100-250 rpm、30-35°C条件下培养16-24 h，得一级种液，将所得一级种液按5-15%的接种量接种到种子培养基B中，在100-200 rpm、通气比为O. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C条件下扩大培养16-20 h，得氧化葡糖杆菌种液；种子培养基B组成为阿拉伯糖醇 100-120 g/L，酵母膏 5-10 g/L，碳酸钙 O. 5-1. 5 g/L, pH 5. 1-5.4。进一步的，上述方法中，含D-木酮糖发酵液的后处理过程为将发酵液经板框过滤、超滤膜超滤、活性炭脱色和离子交换除去菌体和杂质，然后浓缩、结晶得D-木酮糖，更具体的为将发酵液采用板框过滤除菌、再用截留分子量为1000-3000 Da的超滤膜过滤，然后用活性碳脱色和离子交换处理。再将离子交换后的发酵液浓缩至干物质含量为80-95%，然后降温至40-55°C，向浓缩液中加入干物质含量2_4%的D-木酮糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木酮糖。上述制得D-木酮糖为木糖醇制备的中间体，可以用上述方法制得的D-木酮糖进一步的制备木糖醇，步骤为以葡糖糖为原料，通过上述混菌发酵的方法制得的D-木酮糖进一步的采用现有技术还原为木糖醇，即得。将D-木酮糖还原为木糖醇的技术有很多，例如可以采用酵母(Candidaguilliermodii)的还原作用将D-木酮糖还原为木糖醇，也可以采用木糖异构酶(也叫葡萄糖异构酶，下同)先转化D-木酮糖为D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后将D-木糖分离、氢化得到木糖醇。上述现有技术均可用于本发明中将D-木酮糖还原为木糖醇，但是优选采用木糖异构酶转化D-木酮糖生成D-木糖，采用木糖异构酶所得木糖醇效率更高一些，更加利于工业化大生产。本发明制备木糖醇的方法优选采用混菌发酵制备D-木酮糖和采用木糖异构酶转化D-木酮糖这两者结合的方式进行，所得木糖醇产率大大提高，优选方法方案如下
一种微生物转化葡萄糖制备木糖醇的方法，以葡糖糖为原料，采用上述微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法将葡萄糖转化为D-木酮糖，采用木糖异构酶将D-木酮糖转化为D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后将D-木糖分离、氢化得到木糖醇，包括以下步骤①D-木酮糖的制备采用上述微生物混菌培养转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法制备D-木酮糖；
②D-木糖的制备将步骤①中的D-木酮糖配成水溶液，在木糖异构酶的作用下制得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液；
③D-木糖的提取精制利用模拟移动床装置处理步骤②中的异构糖液，将D-木酮糖和D-木糖分离得到富含D-木酮糖组分和富含D-木糖组分，将富含D-木糖组分过离子交换树脂除去杂质，然后浓缩、结晶，得D-木糖；富含D-木酮糖组分进入步骤②中套用；
④木糖醇的制备将步骤③中的D-木糖配成水溶液，在催化剂存在下进行加氢反应，得到木糖醇溶液；
⑤木糖醇的提取精制将木糖醇反应液过滤除去催化剂、过离子交换树脂除去杂质，然后浓缩、结晶，得D-木糖醇。
进一步的，D-木糖的制备具体包括以下步骤将步骤①中的D-木酮糖配成35-45%的水溶液，调节PH为8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸镁和SO2，至硫酸镁在水溶液中的浓度为43-48 mg/L、S02在水溶液中的浓度为95-120 mg/L，然后将D-木酮糖水溶液以2_4 m3/h流速流过酶异构柱，异构柱含木糖异构酶200-400公斤，反应温度55-60°C，得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液；
进一步的，D-木糖的提取精制具体包括以下步骤以钙型阳离子交换树脂作为吸附齐U，以水为洗脱剂，在50-65°C下利用模拟移动床装置处理步骤②中的异构糖液，得到富含D-木酮糖组分和富含D-木糖组分，将富含木糖组分按常规方式进行活性炭脱色、板框过滤和过离子交换树脂除去杂质，浓缩至干物质含量为75-90%以上，然后自然降温至40-60°C，向浓缩液中加入干物质含量3-5%的D-木糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，得到D-木糖；富含D-木酮糖组分进入步骤②中套用。去除杂质时使用的离子交换树脂有阳离子型离子交换树脂和阴离子型离子交换树脂，其中，阳离子型离子交换树脂优选大孔强酸苯乙烯-二乙烯苯系树脂和大孔弱酸丙烯酸-二乙烯苯系树脂，阴离子型离子交换树脂优选大孔弱碱苯乙烯系树脂和大孔强碱型苯乙烯系树脂。进一步的，木糖醇的制备具体包括以下步骤将步骤③中的D-木糖配成40-50%的水溶液，加入水溶液重量O. 3-0. 8%的雷尼镍或雷尼钌作为催化剂，在140-170°C，7. 2-8. OMpa氢气压力下进行加氢反应，反应2-4 h，得到木糖醇溶液。进一步的，木糖醇的提取精制具体包括以下步骤将木糖醇溶液按常规方式进行活性炭脱色、板框过滤和过离子交换树脂除去杂质，浓缩至干物质含量为75-90%以上，然后自然降温至40-60°C，向浓缩液中加入干物质含量2-4%的木糖醇作为晶种，然后降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，55-75°C烘干，得D-木糖醇。去除杂质时使用的离子交换树脂有阳离子型离子交换树脂和阴离子型离子交换树脂，其中，阳离子型离子交换树脂优选大孔强酸苯乙烯-二乙烯苯系树脂和大孔弱酸丙烯酸-二乙烯苯系树脂，阴离子型离子交换树脂优选大孔弱碱苯乙烯系树脂和大孔强碱型苯乙烯系树脂。本发明具有以下优点
I、将制备D-木酮糖的混菌发酵技术进行了改进，先接种耐高渗酵母进行阿拉伯糖醇发酵，然后在发酵中后期再接种氧化葡糖杆菌，解除了阿拉伯糖醇的反馈抑制，比现有技术中同时接种耐高渗酵母和氧化葡糖杆菌的方法转化效率高，提高了 D-木酮糖的产率；一步发酵即可将葡萄糖转化为D-木酮糖，比现有技术中先用耐高渗酵母制备阿拉伯糖醇，再用阿拉伯糖醇制备D-木酮糖的二步发酵法操作简单，周期短，节约了原料，降低了能耗。2、优选使用自行筛选的奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123作为耐高渗酵母，该菌株耐高渗、耐高温，在200 g/L葡萄糖和35°C条件下正常生长繁殖，能够高效转化葡萄糖生成阿拉伯糖醇，转化率可达44%，发酵液中D-木酮糖的含量可达150 g/L。3、利用混菌发酵方法制得的D-木酮糖制备木糖醇提高了生产效率，降低了成本。进一步的，优选采用木糖异构酶制备木糖醇的方法，效率进一步提高，在实际生产中更易于操作和实现。
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图I为本发明所述的微生物转化葡萄糖制备木糖醇及其中间体D-木酮糖工艺流程
图2为微生物混菌发酵生产木糖醇中间体(D-木酮糖)典型过程曲线图。保藏信息
本发明所用耐高渗酵母奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2012年6月6日，保藏编号为CGMCCNO. 6197。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。下述实施例中，所用耐高渗酵母为奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123,保藏编号CGMCC NO. 6197 ;所用氧化葡糖杆菌为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏编号CGMCC NO. 2079，已在专利CN200910024579. 4中公开。因此，本发明所用菌种满足公开充分的要求。奥默柯达酵母和氧化葡糖杆菌用斜面在4°C下进行保存，奥默柯达酵母保藏斜面培养基组成(g/L):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3，琼脂20，自然pH;氧化葡糖杆菌保藏斜面培养基组成(g/L):阿拉伯糖醇80，酵母膏5，蛋白胨3，碳酸钙1，琼月旨 20，pH 5. 2。下述实施例中，除去杂质所用的阳离子交换树脂为Amberlite IRC50与AmberliteFPC22Na的混合物，阴离子交换树脂为Amberlite FPA51与Amberlite FPA90CI的混合物，木糖异构酶，也称为葡萄糖异构酶，采用糖醇工业常用的固定化葡萄糖异构酶。实施例I
(I)培养基种子培养基A组成为葡萄糖80 g/L，玉米浆10 g/L，酵母膏3 g/L, MgSO4
0.5 g/L,自然pH ;种子培养基B组成为阿拉伯糖醇120 g/L，酵母膏10 g/L，碳酸钙I. 5g/L, pH 5. 2 ;发酵培养基组成为葡萄糖160 g/L，玉米浆10 g/L，酵母膏3 g/L, KH2PO4 3g/L, MgSO4 0. 5 g/L, pH 5· 0。
(2)种子液制备a)奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL_1123种子液从斜面上取一环菌，接种在摇瓶中(培养基A)，装液量15%，250 rpm，35°C培养16 h作为酵母摇瓶种液(即为一级种子液，下同)，然后按10%接种量将酵母摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基A)，装液量60%，通气比为O. 5 L/L*min,150 rpm，35°C扩大培养14 h作为酵母扩培种液(即耐高渗酵母种子液，下同);b)氧化葡糖杆菌种子液从一支氧化葡糖杆菌斜面上洗脱全部菌落，接种在摇瓶中(培养基B)，装液量15%，250 rpm，35°C培养16 h作为氧化葡糖杆菌摇瓶种液(即为一级种子液，下同)，然后按10%接种量将氧化葡糖杆菌摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基B)，装液量60%，通气比为O. 5 L/L*min,200 rpm，35°C扩大培养16 h作为氧化葡糖杆菌扩培种液(即为氧化葡糖杆菌种子液，下同)。(3)混菌发酵按10%接种量，先将酵母扩培种液接种在Im3发酵罐(发酵培养基)中，装液量60%，200 rpm，通气比为O. 5 L/L*min，35°C发酵培养85 h，然后按10%接种量，再将氧化葡糖杆菌扩培种液接种在发酵液中继续混菌发酵，过程中流加葡萄糖和10wt%Na2C03溶液，150 rpm，通气比为0.5 L/L*min，控制发酵液中葡萄糖含量在5 g/L, pH在5.1，发酵145 h (酵母发酵+氧化葡糖杆菌发酵共145h，下同)，停止补糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽下罐，液相检测发酵液中D-木酮糖的含量为148. 3 g/L,葡萄糖对D-木酮糖的转化率为·43. 2%。(4) D-木酮糖的提取精制将发酵液首先采用常规方式板框过滤除菌，再采用截留分子量为1000 Da的超滤膜过滤，然后进行活性碳脱色和离子交换。再浓缩至干物质含量为80%，然后降温至40°C，向浓缩液中加入干物质含量2%的D-木酮糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木酮糖。(5)酶转化将精制D-木酮糖配成35-45%的水溶液，调节pH为8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸镁和SO2,至硫酸镁在水溶液中的浓度为48 mg/L、SO2在水溶液中的浓度为95 mg/L ,D-木酮糖水溶液以2 m3/h流速流过酶异构柱,异构柱含木糖异构酶300公斤,反应温度60°C，得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液；(液相检测含有D-木酮糖43. 5%和D-木糖 55. 2%,寡糖 I. 3%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模拟移动床装置处理异构糖液，分离D-木酮糖和D-木糖；以钙型阳离子交换树脂作为吸附剂，以水为洗脱剂，在65°C下连续进料、进水、出料，得到富含D-木酮糖组分(D-木酮糖纯度91. 1%，浓度25. 56%)和富含D-木糖(D-木糖纯度95. 3%，浓度29. 65%)组分；将富含木糖组分以常规方式过离子交换树脂，去除杂质，然后浓缩至干物质含量为80%，自然降温至50°C，向浓缩液中加入相对干物质含量3%的木糖晶种，自然降温至室温，离心，得到结晶D-木糖；富含木酮糖组分返到步骤(5)进行酶异构。(7)氢化将结晶木糖配成45%溶液，以溶液重量O. 3 %加入雷尼镍，在150°C，8.0Mpa氢气压力下，进行加氢反应，反应时间3 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制将木糖醇溶液按常规方式进行活性炭脱色、板框过滤和过离子交换树脂去除杂质，浓缩至干物质含量为84%，然后自然降温至40°C，向浓缩液中加入相对干物质含量4%的木糖醇作为晶种，然后自然降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，65 °C烘干，得D-木糖醇。实施例2
(I)培养基种子培养基A组成为葡萄糖70 g/L，玉米浆8 g/L，酵母膏4. 5 g/L, MgSO40.9g/L,自然pH ;种子培养基B组成为阿拉伯糖醇110 g/L,酵母膏7 g/L,碳酸|丐I. 2 g/L，pH 5. I ;发酵培养基组成为葡萄糖150 g/L，玉米浆8 g/L，酵母膏4 g/L, KH2PO4 3. 5 g/L, MgSO4 O. 9 g/L, pH 5· 3。(2)种子液制备a)奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123种子液从斜面上取一环菌，接种在摇瓶中(培养基A)，装液量15%，180 rpm，33°C培养18 h作为酵母摇瓶种液，然后按15%接种量将酵母摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基A)，装液量60%，通气比为O. 8 L/L min, 100 rpm,33°C扩大培养12 h作为酵母扩培种液；b)氧化葡糖杆菌种液从一支氧化葡糖杆菌斜面上洗脱全部菌落，接种在摇瓶中(培养基B)，装液量15%，100 rpm, 33°C培养20 h作为氧化葡糖杆菌摇瓶种液，然后按15%接种量将氧化葡糖杆菌摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基B)，装液量60%，通气比为O. 8 L/L*min, 100rpm，33°C扩大培养16 h作为氧化葡糖杆菌扩培种液。(3)混菌发酵按10%接种量，先将酵母扩培种液接种在Im3发酵罐(发酵培养基)中，装液量60%，200 rpm，通气比为0.3 L/L*min，33°C发酵培养75 h，然后按5%接种量，再将氧化葡糖杆菌扩培种液接种在发酵液中继续发酵，通气比为O. 8 L/L-min, 100 rpm，过程 中流加葡萄糖和10wt%Na0H溶液，控制发酵液中葡萄糖含量在8 g/L，pH在4. 6，发酵150 h，停止补糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽下罐，液相检测发酵液中D-木酮糖的含量为153. 2g/L,葡萄糖对D-木酮糖的转化率为44. 3%。(4) D-木酮糖的提取精制将发酵液首先采用常规方式板框过滤除菌，再采用截留分子量为2000 Da的超滤膜过滤，然后进行活性碳脱色和离子交换。再浓缩至干物质含量为90%，然后降温至48°C，向浓缩液中干物质含量3%的D-木酮糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木酮糖。(5)酶转化将精制D-木酮糖配成35%的水溶液，调节pH为8.0，再向水溶液中加入硫酸镁和SO2，至硫酸镁在水溶液中的浓度为43 mg/L、SO2在水溶液中的浓度为110 mg/L，D-木酮糖水溶液以3 m3/h流速流过酶异构柱，异构柱含木糖异构酶200公斤，反应温度58 0C，得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液(含有D-木酮糖45. 2%和D-木糖53. 4%，寡糖
1.4%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模拟移动床装置处理异构糖液，分离D-木酮糖和D-木糖；以钙型阳离子交换树脂作为吸附剂，以水为洗脱剂，在58°C下连续进料、进水、出料，得到富含D-木酮糖组分(D-木酮糖92. 0%，浓度26. 46%)和富含D-木糖(D-木糖96. 3%，浓度29. 32%)组分；将富含木糖组分以常规方式过离子交换树脂，去除杂质，然后浓缩至干物质含量为90%，自然降温至60°C，向浓缩液中加入相对干物质含量4%的木糖晶种，自然降温至室温，离心，得到结晶D-木糖；富含木酮糖组分返到步骤(5)进行酶异构。(7)氢化将结晶木糖配成40%溶液，以溶液重量O. 5%加入雷尼钌，在140°C，7. 6Mpa氢气压力下，进行加氢反应，反应时间2 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制将木糖醇溶液按常规方式进行活性炭脱色、板框过滤和过离子交换树脂去除杂质，浓缩至干物质含量为75%，然后自然降温至50°C，向浓缩液中加入干物质含量2%的木糖醇作为晶种，然后自然降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，55 °C烘干，得D-木糖醇。实施例3(I)培养基种子培养基A为葡萄糖60 g/L,玉米浆5 g/L,酵母膏5 g/L, MgSO4 I. 5g/L,自然pH ;种子培养基B组成为阿拉伯糖醇100 g/L,酵母膏5 g/L,碳酸I丐O. 5 g/L,pH
5.4;发酵培养基组成为葡萄糖120 g/L，玉米浆5 g/L，酵母膏5 g/L, KH2PO4 4 g/L, MgSO4
I.5 g/L, pH 5. 5。(2)种子液制备a)奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL_1123种子液从斜面上取一环菌，接种在摇瓶中(培养基A)，装液量15%，100 rpm，30°C培养20 h作为酵母摇瓶种液，然后按5%接种量将酵母摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基A)，装液量60%，通气比为O. 3 L/L*min,200 rpm，30°C扩大培养20 h作为酵母扩培种液；b)氧化葡糖杆菌种子液从一支氧化葡糖杆菌斜面上洗脱全部菌落，接种在摇瓶中(培养基B)，装液量15%，180 rpm，3(TC培养24 h作为氧化葡糖杆菌摇瓶种液，然后按5%接种量将氧化葡糖杆菌摇瓶种液接种在100 L发酵罐种液中(培养基B)，装液量60%，通气比为O. 3 L/L*min,200rpm，3(TC扩大培养20 h作为氧化葡糖杆菌扩培种液。 (3)混菌发酵按5%接种量，先将酵母扩培种液接种在Im3发酵罐(发酵培养基)中，装液量60%，100 rpm，通气比为O. 8 L/L*min，30°C发酵培养65 h，然后按15%接种量，再将氧化葡糖杆菌扩培种液接种在发酵液中继续发酵，过程中流加葡萄糖和10wt%K0H溶液，通气比为O. 3 L/L.min，100 rpm，控制发酵液葡萄糖含量在10 g/L和pH在5. 0，发酵130 h，停止补糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽下罐，液相检测发酵液中D-木酮糖的含量为136. 3g/L,葡萄糖对D-木酮糖的转化率为41. 2%。(4) D-木酮糖的提取精制将发酵液首先采用常规方式板框过滤除菌，再采用截留分子量为3000 Da的超滤膜过滤，然后进行活性碳脱色和离子交换。再浓缩至干物质含量为95%，然后降温至55°C，向浓缩液中加入干物质含量4%的D-木酮糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木酮糖。(5)酶转化将精制D-木酮糖配成40%的水溶液，调节pH为8. 2，再向水溶液中加入硫酸镁和SO2，至硫酸镁在水溶液中的浓度为45 mg/L、SO2在水溶液中的浓度为120 mg/L, D-木酮糖水溶液以4 m3/h流速流过酶异构柱,异构柱含木糖异构酶400公斤,反应温度55 0C，得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液(含有D-木酮糖48. 5%和D-木糖50. 1%，寡糖
I.4%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模拟移动床装置处理异构糖液，分离D-木酮糖和D-木糖；以钙型阳离子交换树脂作为吸附剂，以水为洗脱剂，在50°C下连续进料、进水、出料，得到富含D-木酮糖组分(D-木酮糖89. 3%，浓度26. 34%)和富含D-木糖(D-木糖92. 0%，浓度28. 33%)组分；将富含木糖组分以常规方式过离子交换树脂，去除杂质，然后浓缩至干物质含量为75%，自然降温至40°C，向浓缩液中加入相对干物质含量5%的木糖晶种，自然降温至室温，离心，得到结晶D-木糖；富含木酮糖组分返到步骤(5)进行酶异构。(7)氢化将结晶木糖配成42%溶液，以溶液重量O. 8%加入雷尼镍，在170°C，7. 2Mpa氢气压力下，进行加氢反应，反应时间4 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制将木糖醇溶液按常规方式进行活性炭脱色、板框过滤和过离子交换树脂去除杂质，浓缩至干物质含量为90%，然后自然降温至60°C，向浓缩液中加入干物质含量3%的木糖醇作为晶种，然后自然降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，75 °C烘干，得D-木糖醇。
比较例
(I)培养基组成和种液制备方法同实施例I。(2)混菌发酵各按10%接种量，将酵母扩培种液和氧化葡糖杆菌扩培种液同时接种在Im3发酵罐(发酵培养基)中，装液量60%，200 rpm，通气比为0.5 L/L*min，35°C发酵培养85 h，待葡萄糖降到5 g/L以下，补糖，控制发酵液葡萄糖含量在5 g/L左右和pH在
5.1，发酵145 h，停止补糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽下罐，液相检测发酵液中D-木酮糖的含量为36. I g/L，葡萄糖对D-木酮糖的转化率为11. 5 %。( 3 )其他步骤条件同实施例I。从上述实施例和比较例可以看出，本发明方法木酮糖产量和转化率大大提高，更加利于生物发酵制备木糖醇的工业化应用。 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
权利要求
1.一种微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，以葡萄糖为原料，通过可转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母和可转化阿拉伯糖醇为D-木酮糖的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵培养得D-木酮糖发酵液,发酵液经进一步处理得D-木酮糖，其特征是，混菌发酵包括以下步骤首先，分别制备耐高渗酵母种液和氧化葡糖杆菌种液，然后先将耐高渗酵母种液接种到含葡萄糖的发酵培养基中进行发酵培养，将葡萄糖转化为阿拉伯糖醇，在耐高渗酵母发酵中后期再将氧化葡糖杆菌种液接种到发酵液中混菌发酵，同时控制发酵液中葡萄糖含量为5-10 g/L,继续发酵将阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，得含有D-木酮糖的发酵液。
2.根据权利要求I所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，其特征是所述可转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母为奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123CGMCC NO. 6197 ;所述可转化阿拉伯糖醇为D-木酮糖的氧化葡糖杆菌为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-IO CGMCC No. 2709。
3.根据权利要求I或2所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，其特征是 耐高渗酵母种液采用下述方法制备取一接种环斜面保存的耐高渗酵母菌种，接种在种子培养基A中，在100-250 rpm、30_35°C条件下培养10-20 h，得一级种液，将所得一级种液按5-15%的接种量接种到种子培养基A中，在100-200 rpm、通气比为0. 3-0. 8 L/L min、30-35°C条件下扩大培养12-20 h，得耐高渗酵母种液；种子培养基A组成为葡萄糖 60-80 g/L，玉米浆 5-10 g/L，酵母膏 3-5 g/L, MgSO4 0. 5-1. 5 g/L，自然 pH; 氧化葡糖杆菌种液采用下述方法制备将一支氧化葡糖杆菌斜面上的全部菌体接种到种子培养基B中，在100-250 rpm、30-35°C条件下培养16-24 h，得一级种液，将所得一级种液按5-15%的接种量接种到种子培养基B中，在100-200 rpm、通气比为0. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C条件下扩大培养16-20 h，得氧化葡糖杆菌种液；种子培养基B组成为阿拉伯糖醇100-120 g/L，酵母膏 5-10 g/L，碳酸钙 0. 5-1. 5 g/L, pH 5. 1-5.4。
4.根据权利要求I或2所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，其特征是混菌发酵具体包括以下步骤首先，分别制备耐高渗酵母种液和氧化葡糖杆菌种液，然后按5-15%的接种量，先将耐高渗酵母种液接种到含有葡糖糖的发酵培养基中，在100-200 rpm、通气比为0.3-0. 8 L/L*min、30-35°C条件下发酵培养65-85 h，将葡萄糖转化为阿拉伯糖醇；然后再将氧化葡糖杆菌种液按5-15%的接种量接种到发酵液中，在100-200 rpm、通气比为0. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C条件下混菌发酵；发酵过程中流加葡萄糖和碱性物质溶液，使发酵液中葡萄糖含量为5-10 g/L、pH为4. 6-5. 4，整个发酵时间持续130-150 h后停止补充葡萄糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗尽后停止发酵，得含有D-木酮糖的发酵液； 所述发酵培养基组成为葡萄糖120-160 g/L，玉米浆5-10 g/L，酵母膏3-5 g/L,KH2PO4 3-4 g/L, MgSO4 0. 5-1. 5 g/L, pH 5. 0-5. 5。
5.根据权利要求I或2所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，其特征是D-木酮糖发酵液的后处理过程为将发酵液首先采用常规方式板框过滤除菌，再采用截留分子量为1000-3000 Da的超滤膜过滤，然后进行活性碳脱色和离子交换，再将发酵液浓缩至干物质含量为80-95%，然后降温至40-55°C，向浓缩液中加入干物质含量2_4%的D-木酮糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木酮糖。
6.一种微生物转化葡萄糖制备木糖醇的方法，以葡糖糖为原料，通过混菌发酵将葡萄糖转化为D-木酮糖，再通过酶异构将D-木酮糖转化为D-木糖，然后D-木糖加氢还原为木糖醇，其特征是采用权利要求1-6中任一项所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法将葡萄糖转化为D-木酮糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是采用木糖异构酶将D-木酮糖转化为D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后将D-木糖分离、氢化得到木糖醇。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征是包括以下步骤 (I )D-木酮糖的制备采用权利要求I或2所述的微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法制备D-木酮糖； (2)D-木糖的制备将步骤(I)中的D-木酮糖配成水溶液，在木糖异构酶的作用下制得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液；· (3)D-木糖的提取精制利用模拟移动床装置处理步骤(2)中的异构糖液，将D-木酮糖和D-木糖分离得到富含D-木酮糖组分和富含D-木糖组分，将富含D-木糖组分过离子交换树脂除去杂质，然后浓缩、结晶，得D-木糖；富含D-木酮糖组分进入步骤(2)套用； (4)木糖醇的制备将步骤(3)的D-木糖配成水溶液，在催化剂存在下进行加氢反应，得到木糖醇溶液； (5)木糖醇的提取精制将木糖醇溶液过滤除去催化剂、过离子交换树脂除去杂质，然后浓缩、结晶，得D-木糖醇。
9.根据权利要求8所述的微生物转化葡萄糖制备木糖醇的方法，其特征是 D-木糖的制备具体包括以下步骤将步骤(I)中的D-木酮糖配成35-45%的水溶液，调节PH为8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸镁和SO2,至硫酸镁在水溶液中的浓度为43-48mg/L、S02在水溶液中的浓度为95-120 mg/L，然后将D-木酮糖水溶液在55_60°C下、以2_4m3/h的流速流过填充有木糖异构酶的酶异构柱，得含有D-木酮糖和D-木糖的异构糖液； D-木糖的提取精制具体包括以下步骤以钙型阳离子交换树脂作为吸附剂，以水为洗脱剂，在50-65°C下利用模拟移动床装置处理步骤(2冲的异构糖液，得到富含D-木酮糖组分和富含D-木糖组分，将富含木糖组分依次进行活性炭脱色、板框过滤除菌和离子交换树脂除杂，然后将其浓缩至干物质含量为75-90%，然后降温至40-60°C，向浓缩液中加入干物质含量3-5%的D-木糖作为晶种，再自然降温至室温进行结晶，结晶后离心，得到D-木糖；富含D-木酮糖组分进入步骤(2)套用； 木糖醇的制备具体包括以下步骤将步骤(3)中的D-木糖配成40-50%的水溶液，然后加入水溶液重量0. 3-0. 8%的雷尼镍或雷尼钌作为催化剂，在140-170°C，7. 2-8. 0 MPa氢气压力下进行加氢反应，反应2-4 h，得到木糖醇溶液； 木糖醇的提取精制具体包括以下步骤将木糖醇溶液进行活性炭脱色、板框过滤除菌和离子交换树脂除杂，然后将其浓缩至干物质含量为75-90%，然后自然降温至40-60°C，向浓缩液中加入干物质含量2-4%的木糖醇作为晶种，然后自然降温至室温进行结晶，结晶后将晶体离心，55-70°C烘干，得D-木糖醇。
10.一种转化葡萄糖为阿拉伯糖醇的耐高渗酵母菌种，其特征是所述菌种为奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123 CGMCC NO. 6197。
全文摘要
本发明公开了一种微生物转化葡萄糖制备D-木酮糖的方法，首先，以葡萄糖为原料，分别制备耐高渗酵母种液和氧化葡糖杆菌种液，然后先接种耐高渗酵母种液进行阿拉伯糖醇发酵，中后期接入氧化葡糖杆菌种液混菌发酵，同时控制发酵液中葡萄糖含量为5-10g/L，将阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，该方法解除了阿拉伯糖醇反馈抑制，提高了葡萄糖生产D-木酮糖的效率。本发明还公开了一种微生物转化葡萄糖制备木糖醇的方法，首先通过上述方法将葡萄糖转化为D-木酮糖，再通过酶异构把D-木酮糖转化为D-木糖，经提取精制，D-木糖催化加氢获得木糖醇，该方法提高了木糖醇生产效率，降低了生物法制备木糖醇生产成本。
文档编号C12P39/00GK102796797SQ20121028196
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者张全景, 付吉明, 王乔隆, 郑秀宁, 刘敏, 庄祎 申请人:山东天力药业有限公司