专利名称：快速检测地沟油的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测地沟油的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
目前，市场上食用油的质量良莠不齐，一小部分油脂加工生产商为了节约成本、牟取暴利，违法加工提炼地沟油，或是在普通食用油中掺入地沟油来欺骗消费者，这些不法行为给食品安全带来了隐患，严重危害了消费者的健康与利益。地沟油是质量、卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛等指标严重超标的非食用油，一般分为3类一是狭义的地沟油，即将下水道中的油腻漂浮物或者将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜(通称泔水)经过简单加工、提炼出的油；二是劣质动物肉类、动物内脏、动物皮脂加工以及提炼后产出的油；三是用于油炸食品的油使用次数超过规定要求后，再被重复使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。地沟油中的重金属、毒素(如丙烯醛)等严重超标，过氧化值一般高于0. 4%，远远超过国家标准0. 15%，长期摄入会使细胞功能衰竭，诱发多种疾病，甚至致癌。日本曾发生食用过氧化值为7. 5%的劣质油脂而造成集体急性中毒事件。目前国内对地沟油的鉴别和检测主要是从感官和理化检验两个方面进行。理化检测分别检验水分含量、比重、折光率、皂化值、酸值、羰基值、过氧化值、碘值重金属、脂肪酸相对不饱和度、胆固醇、残留检测、氧化产物等指标。地沟油由于经过水洗、蒸馏、脱色、脱臭等精炼工艺后，或者与普通食用植物油掺兑之后，已经很难用常规的感官分析或者理化指标等进行区分。目前国内尚缺乏能够有效鉴别地沟油的检测方法。
发明内容
基于此，本发明依据地沟油的加工原料与普通食用油原料存在较大的差异，提供了一种快速检测地沟油的试剂盒及其检测方法。利用试剂盒对地沟油中的基因成分进行检测，通过检测结果判断地沟油的加工原料，从而达到快速检测地沟油的目的。 一种快速检测地沟油的试剂盒，包括(I) DNA提取缓冲液所述DNA提取缓冲液的组成为十六烷基三甲基溴化胺(简称CTAB)、90 110nmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(简称Tris-HCl)、15 25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(简称 EDTA2Na)、I. 3 I. 5mol/L 氯化钠(简称 NaCl)、0. 09 0. 12g/L 蛋白酶 K ；(2) Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU ；(3) PCR 反应液所述PCR反应液的组成为2. 7 3. 3mmol/L氯化镁，0. 3 0. 5 y mol/L引物，0.3 0. 5mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸；所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2、以及针对植物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4 ；(4)上样缓冲液所述上样缓冲液的组成为2. 0 3. Og/L溴酚蓝、350 450g/L蔗糖。在其中一些实施例中，所述引物还包括针对牛、羊、猪或鸡的线粒体基因序列的弓I物。在其中一个实施例中，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :5和SEQID NO :6。 在其中一个实施例中，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :7和SEQID NO :8。在其中一个实施例中，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO :9和SEQID NO :10。在其中一个实施例中，所述针对鸡线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 11和SEQID NO :12。在其中一个实施例中，所述引物还包括针对玉米的内源基因序列的引物SEQ IDN0:13和SEQ ID NO :14、针对大豆的内源基因序列的引物SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16,针对大米的内源基因序列的引物SEQ ID N0:17和SEQ IDNO :18、针对花生的内源基因序列的引物SEQ ID N0:1^PSEQ ID NO :20或针对油菜籽的内源基因序列的引物SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO :22。一种快速检测地沟油的方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤(I)制备样品DNA取离心管，每管加入20 50mL油样与等体积双蒸水，振荡仪上振荡30 60min，高速离心15 20min，弃去上层油脂，保留下层水相。再向离心管中加入20 50mL油样，继续振荡，离心，上述过程重复7 8次，所萃取油样的体积约为300 400mL。萃取到下层水相浑浊后，高速离心，弃去上层油脂，将水相转移至平面皿中，浓缩干燥，干燥浓缩过程约3 5小时；充分干燥后，向平面皿中加入2 3mL的DNA提取缓冲液，混匀后，转移悬浊液于离心管中。将离心管置于65°C放置45 60min，不时摇动，使样品充分裂解。用氯仿异戊醇体积比为24 I的混合液进行提取，离心。取上清，加入异丙醇沉淀核酸，_20°C放置2小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA ；(2) PCR扩增反应取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀,加入样品DNA,离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95°C预变性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序进行40个循环，最后72°C延伸lOmin，于4°C结束反应；(3)产物检测反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的I. 5%琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。
本发明针对地沟油基质复杂，干扰因素多，且地沟油中基因降解较严重等问题，开发建立了高效的地沟油DNA的提取方法，成功地从数十份地沟油样品中提取获得了较高质量的DNA。再进一步根据地沟油中可能含有的基因成分的品种，设计特异性、专一性的引物序列进行PCR反应扩增，根据检测结果快速鉴定所提取地沟油样品中的动物源性基因成分与植物源性基因成分。本发明中的地沟油DNA提取方法增大了提取样品的体积，采用300mL以上的地沟油样品进行提取，采用双蒸水与地沟油充分混合的方式萃取地沟油中的基因成分，利用DNA提取缓冲液使地沟油中的细胞裂解，释放核酸。用氯仿、异戊醇混合溶液除去溶液中的蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的地沟油DNA。获得地沟油DNA后，筛选特异性引物对所提取地沟油中的基因组分进行检测，首先检测地沟油中的动物内源基因成分与植物内源基因成分。检测到动物内源基因后，再根据设计好的特异性的动物物种基因扩增引物，具体鉴别是牛、羊还是猪等物种的基因序列；检测到植物内源基因后，再根据设计好的大豆、玉米、花生、油菜籽等物种特异性的植物物种基因扩增引物，准确鉴别待测油样标识种类与基因成分种类是否一致。检测结果表明，提取的地沟油DNA的质量满足PCR 检测要求，采用的扩增引物特异性好、灵敏度高，可在地沟油样品中检测到动物内源基因成分与植物内源基因成分。本发明的发明人探索建立了地沟油的快速检测方法，在现有研究的基础上，改进并优化了从地沟油基因的提取到PCR检测整个过程中的提取试剂与反应条件等关键控制性因素，建立了稳定性高、快速简便的一整套地沟油检测试剂盒。本发明从基因的角度对地沟油成分进行鉴别，针对地沟油检测具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前检测方法的空白。本发明方法具有重大的推广应用价值，对于有效监管地沟油，保护广大消费者利益具有重大意义。本发明可广泛应用于油脂基因的提取、油脂品种鉴定以及开发油脂核酸快速检测试剂盒等方面，具有良好的经济与社会效益。
图I为实施例2的疑似地沟油样品中动物内源基因的PCR扩增产物电泳图谱；其中:M为DNA Marker ;P1、P2为阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/y L) ;1、2为阴性对照(玉米DNA，稀释至50ng/iiL) ;3 10 :本发明方法提取的疑似地沟油样品DNA ;11、食用大豆油样品(金龙鱼，20111209) ;12、食用玉米油样品(金龙鱼，20120309) ;13、食用花生油样品(胡姬花，20120108) ;14、食用菜籽油样品(南海油脂，20120215) ;15、食用葵花籽油样品(多力，20120318) ;CK1、CK2 :空白对照;图2为实施例2中疑似地沟油样品中植物内源基因的PCR扩增产物电泳图谱；其中M为DNA Marker ;P1、P2为阳性对照(玉米DNA，稀释至50ng/y L) ;1 8 :本发明方法提取的疑似地沟油样品DNA ;9、牛肉DNA，稀释至50ng/y L ;10、羊肉DNA，稀释至50ng/y L ；11、猪肉DNA，稀释至50ng/iiL;12、食用大豆油样品(金龙鱼，20111209) ;13、食用玉米油样品(金龙鱼，20120309) ;14、食用花生油样品(胡姬花，20120108) ;15、食用菜籽油样品(南海油脂，20120215) ;CK1、CK2 :空白对照；图3为实施例2中疑似地沟油样品中牛内源基因的PCR扩增产物电泳图谱；其中M为DNA Marker ;P1、P2为阳性对照(牛肉DNA，稀释至50ng/y L) ;1 5 :检测出含有动物内源基因的疑似地沟油样品DNA，样品编号分别为地沟油1、2、4、6、7 ;6、玉米DNA ;7、大豆DNA ;8、羊肉DNA ;9、猪肉DNA ;10、鸡肉DNA ;11、食用大豆油样品(金龙鱼，20111209) ;12、食用玉米油样品(金龙鱼，20120309) ;13、食用花生油样品(胡姬花，20120108) ;14、食用菜籽油样品(南海油脂，20120215) ;15、食用葵花籽油样品(多力，20120318) ;CK1、CK2 :空白对照。
具体实施例方式以下结合具体实施例来详细说明本发明。实施例I快速检测地沟油的试剂盒包括以下成分(可供进行50份PCR反应)
(I) DNA 提取缓冲液(IOOmL)分别称取2.00mg CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、I. 2 Img Tris. HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、0. 58g EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)和8. 18g NaCl于容量瓶中，用水定容至IOOmL,混勻。经过120°C、30min,高温消毒灭菌后,再加入10. OOmg购置的蛋白酶K(购自大连宝生物公司)；(2) Taq DNA 聚合酶(25 U I)；购置Taq DNA聚合酶25 iU共125IU (购自大连宝生物公司)；(3) PCR 反应液(1000 U I)首先制备引物，制备的引物浓度为100nmol/L。按照本领域常规方法制备引物。在DNA自动合成仪(采用美国ABI公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明书进行合成。分别合成如下引物动物基因成分通用引物，正向5’-aagacgagaagacccttggacttta-3’ (SEQ IDNO. I)；动物基因成分通用引物，反向5’-gattgcgctgttatccctagggta-3’ (SEQ IDNO. 2)；植物基因成分通用引物，正向5’-cgaaatcggtagacgctacg-3’ (SEQ ID NO. 3)；植物基因成分通用引物，反向:5，-ttccattgagtctctgcacct-3，(SEQID NO. 4)；牛线粒体基因的正向引物5’-gccatatactctccttggtgaca-3’ (SEQ ID NO. 5)；牛线粒体基因的反向引物5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’ (SEQ ID NO. 6)；羊线粒体基因的正向引物5’-tattaggcctcccccttgtt-3’ (SEQ ID NO. 7)；羊线粒体基因的反向引物5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’ (SEQ ID NO. 8)；猪线粒体基因的正向引物5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’ (SEQ IDNO. 9)；猪线粒体基因的反向引物5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(SEQID NO. 10)；鸡线粒体基因的正向引物:5，-gggacaccctcccccttaatgaca-3’(SEQ ID NO. 11)；鸡线粒体基因的反向引物:5，-ggagggctggaagaaggagtg-3’(SEQ ID NO. 12)；玉米内源基因的正向引物5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’(SEQID NO. 13)；玉米内源基因的反向引物5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’(SEQID NO. 14)；
大ii内源基因的正向引物:5，-gccctctactccacccccatcc-3’(SEQ ID NO. 15)；大豆内源基因的反向引物:5，-gcccatctgcaagcctttttgtg-3，(SEQID NO. 16)；大米内源基因的正向引物5’-ttgcgcctgaacggatat-3’ (SEQ ID NO. 17)；大米内源基因的反向引物:5，-ggagaagcactggacgagg-3’(SEQ ID NO. 18)；花生内源基因的正向引物:5，-tatgatcctcgttgtgtctatgac-3’(SEQ ID NO. 19)；花生内源基因的反向引物5’-tctccagtcttcttctctttcac-3’ (SEQ ID NO. 20)；油菜籽内源基因的正向引物5’-ccagttcttggagccgcttga-3’ (SEQ ID NO. 21)；油菜籽内源基因的反向引物5’-aagggccagtccaaatgcaga-3’ (SEQ ID NO. 22)；马铃薯内源基因的正向引物5’-tgacctggacaccacagttat-3’ (SEQ ID NO. 23)；马铃薯内源基因的反向引物5’-gtggatttcaggagttcttcga-3’ (SEQ ID NO. 24)；称取0. 285mg MgCl2,用500 ii L水溶解,经过120°C、30min,高温消毒灭菌后,分别加入0. 5iimol的一对引物和0. 5mmol的三磷酸脱氧核苷酸,用灭菌水定容至IOOOiiL;(4)上样缓冲液(IOOii I)分别称取2. 5g溴酚蓝、400g蔗糖于IL容量瓶中，用水定容、混匀。实施例2利用实施例I的试剂盒检测地沟油中的基因成分检测方法包括以下步骤(I)样品DNA的制备a疑似地沟油、食用植物油样品量取300 500mL样品；取离心管,每管加入50mL油样与50mL双蒸水,振荡仪上振荡60min, 12000r/min离心lOmin，弃去上层油脂，保留下层水相。再向离心管中加入50mL油样，继续振荡，离心，上述过程重复8次,所萃取油样的体积约为400mL。萃取到下层水相浑池后，12000r/min离心lOmin，弃去上层油脂，将水相转移至平面皿中，浓缩干燥，干燥浓缩过程约3小时；充分干燥后，向平面皿中加入2mL试剂盒中的DNA提取缓冲液，混匀后，转移悬浊液于离心管中。将离心管置于65°C放置60min，不时摇动，使样品充分裂解。用氯仿异戊醇体积比为24 I的混合液进行提取,小心的混合两相，12000r/min离心lOmin。将上清液移至一新的离心管中，加入2倍体积的预冷的异丙醇，充分混匀，_20°C放置2小时，使得异丙醇与核酸充分反应，12000r/min离心lOmin，获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室温离心12000r/min，IOmin收集DNA，尽可能除去乙醇。用IOOiU双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得样品DNA，置于-20°C保存。b动物肉类(牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉)、常见植物物种(玉米、大豆、花生、油菜籽、马铃薯)样品分别将牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、大米、玉米、大豆、花生、油菜籽、马铃薯等试验材料，使用经过120°C、30min高压消毒过的固体粉碎机或研钵粉碎制成粉样。分别称取IOOmg研磨粉碎后的样品于离心管中，加入ImL试剂盒中的DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65°C放置60min，不时摇动，使样品充分裂解。用氯仿异戊醇体积比为24 I的混合液进行提取，小心的混合两相，12000r/min离心5min。将上清液移至I. 5mL离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇,充分混勻，12000r/min离心5min,获得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室温离心12000r/min，5min收集DNA，尽可能除去乙醇。用100 u I双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得样品DNA，置于_20°C保存。、
(2)检查DNA的纯度和含量在石英比色皿中加入50 ill按10倍稀释的DNA样品(5 U I DNA样品加水45 U I混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A26(l/A28(l值。A26tl/A280应介于I. 7 I. 9之间，低于I. 7则表明制备物中存留显著蛋白质，应重新提取DNA ’大于I. 9则表明DNA样品中含有RNA，此时应加入RNA酶进行消化。计算DNA 浓度:10 X A260 (u g/u I) 0疑似地沟油样品、食用植物油、常见肉类及植物组织DNA提取结果见表I。表I样品DNA提取结果
权利要求
1.一种快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，包括 (1)DNA提取缓冲液 所述DNA提取缓冲液的组成为15 25mg/L CTAB、90 11OnmoI/L Tris-HCl、15 25mmol/L EDTA2Na'I. 3 I. 5mol/L NaCl、0. 09 0. 12g/L 蛋白酶 K ; (2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU ; (3)PCR反应液 所述PCR反应液的组成为2. 7 3. 3mmol/L MgCl2,0. 3 0. 5iimol/L引物，0. 3 0.Smmol /T, dNTPs ； 所述引物为针对动物内源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，以及针对植物内源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4 ； (4)上样缓冲液 所述上样缓冲液的组成为2. 0 3. Og/L溴酚蓝、350 450g/L蔗糖。
2.根据权利要求I所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对牛、羊、猪或鸡的线粒体基因序列的引物。
3.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。
4.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8。
5.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10。
6.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对鸡线粒体基因序列的引物为SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 120
7.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对玉米的内源基因序列的引物SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14、针对大豆的内源基因序列的引物SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :16、针对大米的内源基因序列的引物SEQ IDN0:17和SEQ ID NO :18、针对花生的内源基因序列的引物SEQ ID N0:19和SEQ ID NO 20或针对油菜籽的内源基因序列的引物SEQ ID N0:21和SEQ ID NO :22。
8.一种快速检测地沟油的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒，包括以下步骤 (1)制备样品DNA 取20 50mL油样与等体积双蒸水，振荡离心，弃去上层油脂，再加入20 50mL油样，继续振荡离心，重复7 8次，。待下层水相浑浊后，高速离心，弃去上层油脂，得到300 400mL油样，将水相浓缩干燥3 5小时后，加入2 3mL的DNA提取缓冲液，混匀后，置于65°C放置45 60min，不时摇动，用体积比为24 I的氯仿异戊醇混合液进行提取，离心，取上清，加入异丙醇，-20°C放置2 3小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA ； (2)PCR扩增反应 取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀,加入样品DNA,离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95°C预变性5min后，按94°C 30sec, 57°C 45sec，72°C 60sec程序进行40个循环，最后72°C延伸lOmin，于4°C结束反应。
(3)产物检测反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的I. 5%琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测地沟油的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括DNA提取缓冲液、Taq DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液。本发明在现有研究的基础上，改进并优化了从地沟油基因的提取到PCR检测整个过程中的提取试剂与反应条件等关键控制性因素，建立了稳定性高、快速简便的一整套地沟油检测试剂盒。本发明从基因的角度对地沟油成分进行鉴别，针对地沟油检测具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点，弥补了当前检测方法的空白。具有重大的推广应用价值，对于有效监管地沟油，保护广大消费者利益具有重大意义。
文档编号C12Q1/68GK102758025SQ201210281698
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者侯向昶, 冼燕萍, 吴文海, 吴玉銮, 柯振华, 王斌, 罗东辉, 罗海英, 郭新东, 陈意光, 陈立伟 申请人:广州市质量监督检测研究院