一种β-木糖苷酶及其应用的制作方法

专利名称：一种β-木糖苷酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传酶工程技术领域，具体涉及ー种￠-木糖苷酶及其应用。
背景技术：
0 -木糖苷酶(0-xylosidase, EC 3. 2. I. 37),是ー种木聚糖裂解酶。可与木聚糖 酶协同作用，将木聚糖彻底分解，是木聚糖降解的关键酶之一。￠-木糖苷酶主要以外切方 式作用于木ニ糖或低聚木糖的非还原端木糖苷键并释放出木糖，因此在整个协同水解过程 中可以降低木聚糖的水解产物从而可以较大程度的解除产物对木聚糖酶的抑制，是木聚糖 水解过程中的限速酶。￠-木糖苷酶在将单糖或こ醇连接到木糖単元或从木糖単元中切割 下来的葡基转移反应中也是有效的。￠-木糖苷酶还可以作用于萜类、留体等甙元与木糖形 成的糖苷键，释放出甙元。^ -木糖苷酶的水解反应和葡基转移反应在降解和利用农业废物中具有重要经济 价值，例如在木糖、木糖寡聚物和木糖醇的产生过程中(这些物质在食品、蜜饯和药物中作 为增甜剂，特别是作为糖替代品是有用的)。并且，此酶或其产物可以用作面包改进剂并可 用于啤酒酿制エ业中。在造纸エ业的纸浆漂白中，￠-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以 有效提高漂白性能；在医药行业中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可产生在医药行业 具有重要应用价值的中间转化产物。因此对于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有广泛而重要 的用途。研究发现，不同来源的￠-木糖苷酶存在作用效果上的差异，因此，筛选出不同来 源的￠-木糖苷酶，除了可以研究其酶学特性以外，还可以为研究糖苷水解酶家族特征及 酶的体外定向改造提供理论上的指导。并可为エ业生产性能优良的纤维素及半纤维素水解 酶提供新型酶制剂。

发明内容
本发明的目的是提供ー种P -木糖苷酶及其应用，即ー种具有エ业应用价值的新 型￠-木糖苷酶，从而弥补现有技术的不足。本发明ー个方面涉及ー种木糖苷酶，包括有a)序列为 SEQ ID NO 1 的酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有a中所述 酶的活性的，由a衍生的酶。编码上述木糖苷酶的核苷酸，其ー种序列为SEQ ID NO :2。本发明还提供用于表达上述木糖苷酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ IDNO 2 的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。本发明还涉及携帯有表达上述木糖苷酶的重组表达质粒的重组菌。本发明的木糖苷酶用于制备木ニ糖。本发明提供的重组菌所产P -木糖苷酶主要为胞外酶，发酵进行到第5天时，发酵液酶量达到24. 78U/ml。其最适温度为50°C，最适pH为6. 6。本发明筛选出的木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产木二糖，具有工业生产应用价值。而且筛选出的β_木糖苷酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达木糖苷酶的重组菌。


图I :本发明的β -木糖苷酶基因DNA电泳图谱；图2 :本发明的质粒pGm_x449的构建图；
图3 :本发明木糖苷酶在不同温度下的相对活力；图4 :本发明木糖苷酶在不同pH值下的相对活力。图5 :本发明木糖苷酶在不同温度下的热稳定性。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。一、本发明的木糖苷酶的分离I、纸状葡萄穗霉菌总DNA提取(I)将纸状葡萄穗霉菌(购自中国微生物菌种保管委员会普通微生物中心，CGMCC3. 5365)用CMC液体培养基在30°C，200rpm,摇床培养48h ；(2)用无菌纱布过滤得菌丝体，将菌丝体在液氮中磨成粉末。(3)与提取方法参考试剂盒Fungal DNA kit (购自OMEGA bio-tek)。2、β-木糖苷酶基因的克隆和筛选根据纸状葡萄穗霉菌全基因组分析得到的β -木糖苷酶基因序列即SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，设计一对寡核苷酸引物Pl和Ρ2，其序列为Pl:5/ -CCATTACGTAAGAATGCTGACCTCTCTTGTACTCCTG-3'P2:5/ -CTAGTCTAGATTATGCAACCTCACGGGCCGTC-3'取实施例I提取的基因组DNA溶液I. 5 μ I作为模版扩增β -木糖苷酶基因。 反应混合物(50 μ I)如下dd H20,34 μ I ；K0D buffer,5 μ I ；MgCl2 buffer,2 μ I ；dNTP Μ χ、4μ I ；P1 引物、I. 0μ I ；Ρ2 引物、I. O μ I ;基因组 DNA、1.5y I ；K0DU μ I。反应程序如下第一阶段变性95°C，3min ;第二阶段变性94°C，30s，退火58°C，30s，延伸68°C 3min，共进行25个循环；第三阶段延伸72°C，10min。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图I。PCR产物用SnaB I和Xba I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒PGm连接，转化感受太大肠杆菌(E. coli)DH5 α后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37°C培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4ml LB液体培养集中进行培养(含Amp)，14-16小时后，提取质粒鉴定和测序。将重组质粒pGm-x449转入表达宿主黑曲霉Gl，含有该重组质粒的重组菌株为 Gl-pGm_x449。其中的酶切及连接反应均参照表1。表1酶切体系及连接体系
权利要求
1.ー种β-木糖苷酶，包括有 a)序列为SEQID NO 1的酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸用于编码权利要求I所述的木糖苷酶。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的序列为SEQID Ν0:2。
4.一种用于表达权利要求I所述的木糖苷酶的重组表达质粒,是将序列为SEQ IDNO 2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5.ー种重组菌，其特征在于所述的重组菌携带有权利要求4所述的重组表达质粒。
6.权利要求I所述的木糖苷酶的应用，其特征在于，所述的木糖苷酶用于制备木ニ糖。
全文摘要
本发明涉及一种β-木糖苷酶及其应用，包括有a)序列为SEQ ID NO1的酶；)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明筛选出的β-木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产木二糖，具有工业生产应用价值。而且筛选出的β-木糖苷酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达木糖苷酶的重组菌。
文档编号C12P19/14GK102827819SQ201210281598
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者王华明, 于海玲 申请人:天津工业生物技术研究所