一种耐热木糖苷酶及其应用的制作方法

：
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐热木糖苷酶及其应用。


背景技术：

2.β-木糖苷酶是一种外切酶，是木聚糖降解酶系的一种，是可以作用于较低聚合度木寡糖的非还原性末端生成木糖的一种酶类。主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解聚合度较低的木寡糖(木二糖或木三糖)为木糖。β-木糖苷酶能够与木聚糖酶等协同降解木聚糖生产木糖，在水解过程中β-木糖苷酶可以降低木聚糖水解产物的聚合度，较大程度地解除产物对木聚糖酶的抑制，是木聚糖水解过程中的限速酶。
3.β-木糖苷酶作为木聚糖酶中降解酶系的一种，在工农业残渣加工成燃料、化学和制药、医疗用品、食品和饮料、纤维饲料、造纸工业等方面都是非常重要的应用。利用β-木糖苷酶与木聚糖酶的协同水解能够高效降解木聚糖为木单糖，而木糖可以被继续转化为大宗化工原料(如乙醇、乳酸等)。在造纸工业中，β-木糖苷酶可作为生物漂白剂，已有文献报道β-木糖苷酶单独或者与木聚糖酶协同作用对麦草浆进行预处理可以明显提高漂白浆的白度。在医药工业中，还可以利用β-木糖苷酶水解去除木糖残基来制造具有重要生理功能的紫杉醇。在食品领域，β-木糖苷酶被应用于食品焙烤、低聚木糖制备、酒类酿造等方面并取得了良好的使用效果。在饲料领域中，木聚糖降解酶能够水解小麦，玉米和其他谷物中存在的半纤维素，促进营养物质的消化率，并减少氮磷的排放。单胃动物不产生植物细胞壁降解酶，如木聚糖和纤维素降解酶，导致谷物食品的利用率降低。这些酶的添加促进了能量代谢，降低了食物黏度，提高能量和蛋白质利用率，从而增加动物体质量。在环境保护方面，β-木糖苷酶的应用使许多工农业废弃物以及一些生活垃圾可以更彻底的降解，有利于环境保护，同时β-木糖苷酶的使用减少了许多有害的有机或者无机化学试剂的应用，有利于环境社会的可持续发展。
4.β-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌(包括霉菌、酵母、蕈菌)等微生物以及部分高等植物中分离得到。目前微生物发酵产β-木糖苷酶的研究主要集中于国外，所报道的β-木糖苷酶一般为胞内酶，少数真菌也能产胞外β-木糖苷酶，但其中产酶能力不高，且天然微生物所分泌的酶存在纯化过程复杂等问题。另外目前只有少部分β-木糖苷酶具有热稳定性特征，大部分已报道的β-木糖苷酶的最适温度都在40
–
60℃之间。然而有些工业生产过程需在特殊的温度下进行，例如食品烘培工艺要求生物催化剂对于温度具有较高的耐受性。为了改善工业生产工艺和降低生产成本，我们亟待挖掘热稳定性更高的β-木糖苷酶。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明将提供一种耐热性提高的木糖苷酶，并通过构建毕赤酵母工程菌进行高效表达和生产，有效的改良β-木糖苷酶的生化特性，使其更加高效表达，对满足工业生产的需求，降低生产成本具有重大意义。
6.本发明提供的技术方案之一，是一种耐热性提高的木糖苷酶突变体，具有seq id no.4所示的氨基酸序列；
7.所述木糖苷酶突变体来自一株经紫外诱变获得的曲霉菌mt021，经过诱变后，野生型曲霉菌中的木糖苷酶发生val121leu突变；
8.本发明还提供上述木糖苷酶在水解木糖苷，特别是制备木糖中的应用；
9.进一步地，所述木糖苷酶具有如下酶学性质：
10.(1)最适ph:ph 5.0-6.0酶活稳定，最适作用ph 6.0；
11.(2)最适温度：70℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为75℃；
12.(3)耐热性：该酶在温度90℃的条件下，16h后酶活力仍存留80％以上；
13.(4)酶活：50l罐发酵液酶活可达4508u/ml以上；
14.(5)相较于野生型，耐热性能提升20％以上。
15.进一步地，所述木糖苷酶突变体的编码基因a-2，具有seq id no.3所示的核苷酸序列；
16.本发明还提供包含所述突变体基因a-2的表达载体或重组菌株；
17.优选地，用于表达所述突变体的表达载体为ppic9，宿主细胞为毕赤酵母gs200。
18.优选地，所述重组菌株是将木糖苷酶突变编码基因a-2连接表达载体ppic9，并在毕赤酵母gs200中表达所得。
19.所述重组菌株的构建方法如下：
20.1、将木糖苷酶突变体的编码基因a-2进行酶切，连接至表达载体ppic9，得到重组载体；
21.2、将重组载体转化入毕赤酵母gs200中，得到新型木糖苷酶的生产菌株gs200/ppic9-a-2。
22.本发明还提供所述重组菌株在发酵生产木糖苷酶中的应用，特别是gs200/ppic9-a-2重组菌作为生产菌株发酵生产木糖苷酶中的应用。
23.具体地，采用所述重组菌发酵生产木糖苷酶的方法为：
24.种子罐培养：培养温度30-31℃，转速200-800rpm，风量2m3/h-6m3/h，通风搅拌培养，ph 5.0-5.5，溶氧20-30％，湿重增长至60-80g/l移种；
25.发酵罐培养：10-15％接种量，培养温度30-31℃，转速200-800rpm，风量2m3/h-6m3/h，通风搅拌培养，ph 5.0-5.5，第0-20h，流加碳源40-50％葡萄糖，流加速度为600-800g/h，溶氧20-30％，培养至菌体湿重160-180g/l，停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持1h；流加甲醇，流加速度为50-200g/h，控制溶氧20-30％，培养至145-155h(总发酵周期)左右发酵结束。
26.种子罐培养基(w/v)：4-5％甘油，1-2％磷酸二氢铵，0.5-1％磷酸二氢钾，0.5-1％硫酸镁，0.5-0.8％硫酸钾，0.05-0.1％硫酸钙，0.2-0.5％氢氧化钾，其余为水，ph 5.0-5.5；
27.发酵罐培养基(w/v)：4-5％甘油，1-2％磷酸二氢铵，0.5-1％磷酸二氢钾，0.5-1％硫酸镁，0.5-0.8％硫酸钾，0.05-0.1％硫酸钙，0.2-0.5％氢氧化钾，其余为水，ph 5.0-5.5。
28.有益效果：
29.1、本发明提供了一种全新的木糖苷酶突变体，该突变体具有酶活高(达到野生型的1.6倍左右)，耐热性好的特点。该突变体发酵液酶活可达4508u/ml以上；
30.2、本发明获得的木糖苷酶在温度90℃的条件下，16h后酶活力仍存留80％以上，较原始型酶活提高20％以上，说明其具有较高的耐热性。
附图说明：
31.图1菌落pcr鉴定电泳图；
32.图2木糖苷酶最适ph曲线；
33.图3木糖苷酶最适温度曲线；
34.图4木糖苷酶耐热性曲线。
具体实施方式：
35.通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。
36.本发明提供的耐热性提高的木糖苷酶突变体，来自一株经紫外诱变获得的曲霉菌mt021，将木糖苷酶突变体编码基因a-2从mt021中克隆并连接至ppic9构建重组质粒后，在毕赤酵母gs200中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。
37.在本发明中采用如下定义：
38.1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
39.使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
40.2.木糖苷酶突变体的标识
41.采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如val121leu，表示位置121的氨基酸由原始型的val替换成leu，位置的编号对应于seq id no.2中野生型木糖苷酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于seq id no.1中野生型木糖苷酶的核苷酸序列编号。
42.在本发明中，a-1表示野生型木糖苷酶的编码基因，a-2表示木糖苷酶突变体的编码基因，信息如下表。
[0043][0044]
本发明所采用的木糖苷酶酶活测定方法及酶活定义如下：
[0045]
200μl用50mmol/l的ph 7.0磷酸缓冲液配制的5mmol/l底物(pnp-x)在55℃预热3min，加入50μl适当稀释的酶液，反应10min，再加入750μl 2mol/l的碳酸钠溶液终止反应，冷却后采用分光光度法在410nm处检测产物对硝基苯酚(pnp)的量，从而以对硝基苯酚为标
准计算酶活力。
[0046]
酶活力的单位定义为：在一定条件下(如未特别说明，则为55℃，ph 7.0)，分解pnp-x每分钟生成1μmol对硝基苯酚(pnp)所需要的的酶量。
[0047]
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
[0048]
实施例1木糖苷酶基因a-2的获得
[0049]
申请人实验室保存的一株产碱性木糖苷酶的曲霉菌ld045，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热木糖苷酶活性的菌株mt021，根据木糖苷酶基因设计pcr引物，5'端加入酶切位点xho i，3'端加入酶切位点not i，通过pcr得到突变基因a-2，经过测序，其核苷酸序列为seq id no.3所示，其所编码的木糖苷酶具有seq id no.4所示的氨基酸序列。
[0050]
实施例2重组载体ppic9-a-2的构建
[0051]
分别对编码基因a-2和质粒ppic9进行xho i和not i酶切，回收产物，将回收后的a-2和ppic9按比例混合，用t4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化产物涂布在lb(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至lb液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落pcr，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确，序列大小约1.7kb。抽提重组质粒待用。
[0052]
实施例3重组质粒转化毕赤酵母
[0053]
1.毕赤酵母gs200感受态细胞的制备
[0054]
(1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5ml的ypd培养基，30℃，220rpm振荡过夜；
[0055]
(2)取0.5ml的过夜培养的菌液，接种于50ml新鲜配制的ypd培养基，30℃，220rpm振荡培养，使od
600
值达到1.3-1.5；
[0056]
(3)取上述培养液于4℃，3000rpm，离心5min；
[0057]
(4)弃去上清液，加入50ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
[0058]
(5)4℃，3000rpm，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
[0059]
(6)4℃，3000rpm，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；
[0060]
(7)4℃，3000rpm，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。
[0061]
(8)分装100μl/管至无菌ep罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。
[0062]
2.线性化质粒的转化
[0063]
抽提得到的重组质粒ppic9-a-2用sal i进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。
[0064]
(1)将100μl感受态细胞移出至一新的无菌ep管中，加入10μl线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
[0065]
(2)转化杯置于冰浴中5-10min，保持低温。
[0066]
(3)电穿孔转化电击条件：1500v，200ω，25μf，放电时间5ms左右，一次电击。
[0067]
(4)电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1mol/l的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
[0068]
(5)在超净工作台上无菌操作涂布md培养基(1.34％ynb；4
×
10-5
％生物素；2％葡萄糖平板)，100-200μl/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；
[0069]
(6)在md平板上筛选得到两株重组菌，经菌落pcr得到目的序列，测序比对显示为目的基因a-2的核苷酸序列，即所得菌株为含有ppic9-a-2的重组菌，分别命名为t-1，t-2。
[0070]
实施例4含有重组质粒ppic9-a-2的酵母菌的诱导表达
[0071]
bmgy培养基配方(w/v)：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，10％0.1mol/l ph 6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4
×
10-5
％生物素，1％甘油，其余为水。
[0072]
bmmy培养基配方(w/v)：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，10％0.1mol/l ph 6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ynb，4
×
10-5
％生物素，0.5％甲醇，其余为水。
[0073]
将重组菌t-1、t-2，以及用实施例2-3同样方法以野生型基因a-1构建的重组菌株ppic9-a-1，分别接种于装有30ml bmgy培养基的三角瓶中，30℃，220rpm培养至od
600
为10左右，离心收集菌体，用30ml的bmmy诱导培养基重悬菌体，并在30℃，220rpm，ph 5.0，等条件下继续培养48h，发酵液离心后测定上清中的木糖苷酶酶活。
[0074]
结果如下表，可见，经过诱变获得的木糖苷酶突变体，其发酵液酶活达到原始型木糖苷酶的1.6倍左右。
[0075] 木糖苷酶酶活(u/ml)ppic9-a-1512t-1815t-2829
[0076]
实施例5重组菌t-2发酵性能验证
[0077]
种子罐培养：培养温度30℃，转速300rpm，风量2.5m3/h，通风搅拌培养，ph5.0，溶氧25％，湿重增长至75g/l移种；
[0078]
发酵罐培养：按发酵液体积12％进行接种，培养温度30℃，转速300rpm，风量2.5m3/h，通风搅拌培养，ph 5.0，第0-20h，流加碳源45％葡萄糖，流加速度为700g/h，溶氧25％，培养20h至菌体湿重170g/l；停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持1h；流加甲醇，流加速度为150g/h，控制溶氧25％，培养至150h左右发酵结束。
[0079]
种子罐培养基配方(w/v)：4.5％甘油，1.5％磷酸二氢铵，0.7％磷酸二氢钾，0.7％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.07％硫酸钙，0.3％氢氧化钾，其余为水，ph 5.0；
[0080]
发酵罐培养基配方(w/v)：4.5％甘油，1.5％磷酸二氢铵，0.6％磷酸二氢钾，0.6％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.06％硫酸钙，0.3％氢氧化钾，其余为水，ph 5.0。
[0081]
采用以上发酵方法进行50l放大发酵罐验证实验，总发酵周期150h，其3批次的发酵产酶情况，发酵液平均产酶水平为4508u/ml，下表说明菌株不仅高产木糖苷酶而且其发酵性能以及其所产的木糖苷酶的酶活均具有显著的稳定性。
[0082]
3批次高产木糖苷酶菌株的发酵产酶情况
[0083]
批次发酵周期(h)发酵活力(u/ml)115048262150457031504128
[0084]
实施例6木糖苷酶的酶学性质
[0085]
(1)最适作用ph
[0086]
用实施例5发酵方法所得t-2发酵液上清液为样品，以测得的木糖苷酶最高酶活为基准，55℃条件下测定不同ph下的酶活力。由图2可知，该木糖苷酶在ph范围5.0-6.0酶活稳定，最适作用ph 6.0。
[0087]
(2)最适作用温度
[0088]
用实施例5发酵方法所得t-2发酵液上清液为样品，ph 7.0条件下测定不同温度下的酶活，以测得的木糖苷酶最高酶活为基准，计算相对酶活，结果如图3所示，t-2所产木糖苷酶70℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为75℃。
[0089]
(3)耐热性
[0090]
分别用实施例5发酵方法发酵ppic9-a-1和t-2所得发酵液上清液为样品，分别以其测得的木糖苷酶最高酶活为100％基准，两个样品分别在90℃的条件下进行保温处理，每隔2h，测酶活，计算剩余酶活，从图4中可以看出，t-2在16h后，该酶相对活性仍存留80％以上，与原始基因a-1构建的重组菌ppic9-a-1所产木糖苷酶相比，耐热性有很大提高，说明该重组菌t-2所产木糖苷酶具有良好的耐热性。
[0091]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。