专利名称：一种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法
技术领域：
本发明涉及以纳塔尔链霉菌AaiaJefl1Si1S)发酵生产纳他霉素的工艺方法，特别是一种利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸所得发酵废液来提高纳他霉素产量的生产方法。
背景技术：
纳他霉素(Natamycin)是一种二十六元多烯大环内酯类抗真菌抗生素，可以抑制各种霉菌、酵母菌的生长，也能抑制真菌毒素的产生。作为一种安全高效、无毒、广谱的抗真菌剂，已成为食品生物防腐剂研究领域的一个热点。纳他霉素主要由恰塔努加链霉菌(Streptomyces、纳塔尔链霉菌 lStreptomyces natalensis)和褐黄抱链霉菌^Streptomyces giIvosporeus)三种链霉菌经发酵过程生产的。它是通过有效地与真菌细胞膜的主要留醇-麦角固醇结合，破坏细胞膜的选择渗透性使细胞内的必需物质渗 漏而致使菌体死亡。与其他常用的化学防腐剂相比，纳他霉素具有无色无味、对产品的口感特性无影响、适用范围广、使用剂量低、专一性好、安全性高等显著的优势。1982年6月，美国FDA正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂。1997年3月，中国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。目前，国内外纳他霉素的发酵水平不一，所采用的方法也是多种多样，主要是采用诱变育种和调整发酵工艺等手段提高其产量，但是采用添加另外一种发酵废液来提高纳他霉素产量的报道并不多见；尤其未发现有公布使用高山被孢霉发酵废液来提高纳他霉素产量的报道，此方法即提高了目标产物产量，缩短了发酵周期，又实现了废物再利用，节约了能源，有利于环境保护。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法。本发明以纳塔尔链霉菌iStreptomyces发酵生产纳他霉素为基础进行的，具体方法如下
O摇瓶种子培养
无菌条件下，取纳塔尔链霉菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中，置于培养间中培养，然后将培养好的孢子刮入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养；
所述培养间培养的温度为26 30°C，培养的时间为6 9d ;
所述摇床培养的转速为150 200rmp，摇床培养的温度为26 30°C，摇床培养的时间为36 48h。所述琼脂斜面培养基为葡萄糖5. O 15. Og/L,麦芽浸粉I. O 5. Og/L,酵母浸膏
I.O 5. Og/L，蛋白胨 3. O 10. Og/L，琼脂粉 10. O 20. Og/L, pH 7. O 7. 2。所述种子培养基为葡萄糖10. O 30. 0g/L,酵母浸膏3. O 10. 0g/L,黄豆饼粉30. O 50. 0g/L, pH 7. O 7. 2。
2)摇瓶发酵培养
将种子液按5% 10%的接种量接入盛有发酵培养基的三角瓶中，培养温度26 30°C， 摇床转速为150 200rpm，发酵时间96 120h，同时在0 48h发酵时间内一次性添加高山被孢霉发酵废液10 70% (v/v), pH 7. 0 7. 2，发酵结束后得纳他霉素。所述发酵培养基为葡萄糖5. 0 15. Og/L,可溶性淀粉30. 0 50. Og/L,酵母浸膏 5. 0 10. Og/L,黄豆饼粉 20. 0 40. Og/L, pH 7. 0 7. 2。所述高山被孢霉发酵废液是本公司实验室保存的高山被孢霉菌株用作实验室摇瓶发酵产花生四烯酸产品所产生的发酵废液，或者是高山被孢霉菌株发酵产花生四烯酸工艺所产生的发酵废液。所述高山被孢霉发酵废液的最佳添加量为20% 40% (v/v)。经测定，使用本发明所阐述的方法生产所得纳他霉素的产量相对没有添加高山被孢霉发酵废液的纳他 霉素产量提高至少15%。本发明采用添加高山被孢霉发酵废液方法发酵生产纳他霉素，并在发酵初始0 48小时内一次性添加此发酵废液，纳他霉素产量稳定且相对于没有添加此发酵废液的纳他霉素产量提高至少15%，具有操作简单、发酵周期短、生产成本降低、产量有较明显提高、节能环保等优势。
图I为实施例I的发酵产物纳他霉素产量曲线。在图I中，横坐标为发酵时间(h), 纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)。图2为实施例2的发酵产物纳他霉素产量曲线。在图2中，横坐标为发酵时间(h)， 纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)。图3为实施例3的发酵产物纳他霉素产量曲线。在图3中,横坐标为发酵时间(h), 纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)。图4为对比例I的发酵产物纳他霉素产量曲线。在图I中,横坐标为发酵时间(h)， 纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做详细说明。实施例I
I)摇瓶种子培养无菌条件下，取纳塔尔链霉菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中，置于培养间中培养，再从培养间里拿出新鲜的纳塔尔链霉菌实验菌株，使用无菌接种环挑取少量孢子接种于种子培养基(葡萄糖10g/L，酵母浸膏5g/L，黄豆饼粉50g/L，pH 7. 0)的三角瓶中，摇瓶转速180rpm、28°C、培养48h。2)摇瓶发酵培养将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖 10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黄豆饼粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇瓶转速 180rpm、28°C、培养120h。在发酵培养开始后Oh时三组实验摇瓶中分别添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉发酵废液(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到3. 027g/L、3. 159g/L和2. 987g/L (参见图I)。HPLC方法如下取O. 5ml纳他霉素发酵液,加入7ml甲醇,充分摇勻后,8000rpm离心IOmin,取上清液用O. 45 m微孔滤膜过滤即得到待测液。标准品的配制精确称取IOOmg纳他霉素标准品，用甲醇溶解并定容至100ml，配制成I. Og/L的标准溶液，再稀释此标准溶液配制成不同浓度的标准溶液制成标准曲线，待检测样品时使用。HPLC条件仪器为岛津LC-15C ;流动相为甲醇水冰醋酸=60 40 5 (v/v/v)；色谱柱是岛津LC-C18 (5μπι，4· 6mmX250mm);柱温为室温；检测波长为303nm ;进样流速为
1.Oml/min ;进样量为20 μ I每次。实施例2
O摇瓶种子培养同实施例I。2)摇瓶发酵培养将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黄豆饼粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇瓶转速180rpm、28°C、培养120h。在发酵培养开始后24h时三组实验摇瓶中分别添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉发酵废液(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到2. 968g/L、3. 131g/L和3. 021g/L (参见图2)。实施例3
O摇瓶种子培养同实施例I。2)摇瓶发酵培养将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖10g/L酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黄豆饼粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇瓶转速180rpm、28°C、培养120h。在发酵培养开始后48h时三组实验摇瓶中分别添加10%、20%和70% (v/v)的高山被孢霉发酵废液(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到2. 948g/L、3. 094g/L和2. 912g/L (参见图3)。通过以上实施例可以看出，整个发酵过程只添加一次并且分别在发酵过程中Oh、24h和48h时往发酵培养基中添加10%、20%和70%不同体积的高山被孢霉发酵废液，产量比较稳定，说明发酵过程中在以上三个时间点添加以上不同体积的高山被孢霉发酵废液都可以得到较高的纳他霉素产量。对比例I
O摇瓶种子培养同实施例I。2)摇瓶发酵培养将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖10g/L，酵母浸膏7g/L，可溶性淀粉40g/L，黄豆饼粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇瓶转速180rpm、28°C、培养120h。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定达到
2.649g/L (参见图4未添加发酵液曲线)。通过对比例和实施例可以看出，添加高山被孢霉发酵废液所得纳他霉素产量比未添加的纳他霉素产量提高至少15% (参见图4)。
权利要求
1.ー种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，其特征在于包括以下步骤 1)摇瓶种子培养 无菌条件下，取纳塔尔链霉菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中，置于培养间中培养，然后将培养好的孢子刮入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养； 所述培养间培养的温度为26 30°C，培养的时间为6 9d ; 所述摇床培养的转速为150 200rmp，摇床培养的温度为26 30°C，摇床培养的时间为36 48h ； 2)摇瓶发酵培养 将种子液按5% 10%的接种量接入盛有发酵培养基的三角瓶中，培养温度26 30°C，摇床转速为150 200rpm，发酵时间96 120h，同时在O 48h发酵时间内一次性添加高山被孢霉发酵废液10 70% (v/v), pH 7. O 7. 2，发酵结束后得纳他霉素； 所述发酵培养基为葡萄糖5. O 15. Og/L,可溶性淀粉30. O 50. Og/L,酵母浸膏5.O 10. Og/L,黄豆饼粉20. O 40. Og/L，高山被孢霉发酵废液10 70%(v/v)，pH 7. O 7.2。
2.根据权利要求I所述的ー种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，其特征在于步骤I)中，所述琼脂斜面培养基为葡萄糖5. O 15. Og/L，麦芽浸粉I. O 5. Og/L，酵母浸膏 I. O 5. 0g/L，蛋白胨 3. O 10. 0g/L，琼脂粉 10. O 20. 0g/L,pH 7· O 7· 2。
3.根据权利要求I所述的ー种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，其特征在于步骤I)中，所述种子培养基为葡萄糖10. O 30. 0g/L，酵母浸膏3. O 10. 0g/L,黄豆饼粉 30. O 50. 0g/L, pH 7· O 7· 2。
4.根据权利要求I所述的ー种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，其特征在于步骤2)中，所述高山被孢霉发酵废液的最佳添加量为20% 40% (v/v)。
5.根据权利要求I所述的ー种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，其特征在于步骤2)中，所述高山被孢霉发酵废液是指高山被孢霉菌株发酵产花生四烯酸エ艺所产生的发酵废液。
全文摘要
本发明公开了一种利用高山被孢霉发酵废液提高纳他霉素产量的方法，它是一种往发酵培养基中添加高山被孢霉(Alpinemortierella)发酵废液提高纳他霉素产量的方法。包括以下步骤将纳他霉素生产菌株从斜面活化后接入种子培养基中，然后再接入到发酵培养基中发酵时间96～120h，所述发酵培养基为葡萄糖5.0～15.0g/L，可溶性淀粉30.0～50.0g/L，酵母浸膏5.0～10.0g/L，黄豆饼粉20.0～40.0g/L，高山被孢霉发酵废液10～70%(v/v)，pH7.0～7.2，其中高山被孢霉发酵废液是在0～48h发酵时间内一次性添加的，发酵结束后得纳他霉素；测得的纳他霉素产量相对没有添加高山被孢霉发酵废液的纳他霉素产量提高至少15%。采用添加高山被孢霉发酵废液的方法，具有操作简单、周期短、成本低、产量有较明显提高、节能环保等优势。
文档编号C12P19/62GK102827903SQ20121028172
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者郭江, 孙立洁, 李俊, 姚建铭, 刘洋, 卢诗瑶 申请人:武汉中科光谷绿色生物技术有限公司