专利名称：西尼罗病毒疫苗及其生产方法
技术领域：
本发明涉及使西尼罗病毒的病毒样颗粒能够高分泌表达的人工信号肽、包含编码 包括所述信号肽的西尼罗病毒衍生蛋白的核酸的重组表达载体、具有所述载体的转化体、 使用所述转化体生产西尼罗病毒的病毒样颗粒的方法、包含由所述方法获得的病毒样颗粒 的西尼罗病毒疫苗等等。
背景技术：
西尼罗热是一种由西尼罗病毒(WNV)感染所引起的全身急性发热疾病。偶而，所 述病毒侵袭中枢神经系统并在其中生长，引起致命性脑膜炎。WNV广泛分布于非洲、中东、部 分欧洲、俄罗斯、印度、印度尼西亚等等。所述病毒通过感染环在作为载体的库蚊和作为扩 增动物的禽类(野生和驯养)之间得以保持和繁殖。在该过程期间，人、马和家畜成为偶见寄主。在1999年夏季，WNV侵袭美国纽约并在美国纽约本地化，并且从那以后已经连续 扩张。已证实，截至去年(2007)九月，在全美超过2300人受到感染，因此引起严重的公众 健康问题。目前世界上不存在人WNV疫苗。在这种情况下，开始担心病毒传播至包括日本在内的亚洲国家，并且已经需要研 制人疫苗。尽管培养Vero细胞来源的病毒钝化疫苗目前正在紧急地开发，但对于可以在生 产步骤中不采用生物安全水平3病毒的情况下以低成本安全生产的亚单位疫苗的开发存 在渐增的需求。WNV首先在1937年在非洲乌干达的西尼罗河区域得到分离，并分类为黄病毒科黄 病毒属(非专利文献1)。病毒颗粒的结构由其中衣壳蛋白(C蛋白)被结合至一个(+)链 RNA病毒基因的球形结构和围绕该球形结构的脂双分子层膜组成。该脂膜包括两类蛋白质 包膜蛋白(E蛋白)和膜蛋白(M蛋白)。M蛋白作为前体prM蛋白产生并用称为弗林蛋白 酶(furin)的蛋白酶切割成为成熟蛋白质。本发明人以前报道了 JEV VLP的生产方法，其包括将包含编码日本脑炎病毒 (JEV)的prM蛋白和E蛋白的cDNA片段的表达载体引入动物细胞中，培养所获得的转化细 胞并收获分泌在培养基中的病毒样颗粒(VLP)(专利文献1)。然而，还未曾有报道涉及WNV 亚单位疫苗的生产。专利文献1 JP-A-2004-65118非专利文献 1 :Agrawal, A. G.，L R. Petersen, J. Infect. Dis.，188 1—4 (2003)
发明内容
本发明解决的问题本发明的一个目的是提供可用作安全经济的WNV疫苗成分的WNV VLP的高分泌生 产方法，从而能够开发和稳定供应WNV疫苗。本发明的另一个目的是提供能够在动物体中 产生上述VLP的WNVDNA疫苗。
解决问题的手段发明人已经进行了广泛的研究，努力实现上述目的，并成功地通过将包含编码WNV 的prM蛋白和E蛋白的DNA片段的表达载体引入动物细胞中和在培养基中培养获得的转化 细胞而在培养基中有效地分泌VLP。而且，本发明人已经发现，出乎意料地，通过改变位于 prM蛋白上游的信号肽，VLP的形成或分泌效率与WNV的天然全长信号序列相比可以被显著 地改善。本发明已经基于这些发现进行进一步的研究并完全本发明。因此，本发明提供[1]信号肽，其包含与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序 列(a) SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列(b)上述(a)的氨基酸序列的部分氨基酸序列，其包含至少氨基酸NO 11-25所示 的氨基酸序列；[2]分离的核酸，其基本上由编码上述[1]的信号肽的碱基序列组成；[3]西尼罗病毒样颗粒表达载体，其包含核酸，所述核酸包含编码上述[1]的信号 肽和来源于西尼罗病毒的prM蛋白和E蛋白的碱基序列；[4]通过用上述[3]的载体转化获得的转化体；[5]产生西尼罗病毒样颗粒的方法，其包括培养上述[4]的转化体和回收分泌在 培养基中的病毒样颗粒；[6]通过上述[5]的方法获得的西尼罗病毒样颗粒；[7]西尼罗病毒疫苗，其包含上述[6]的颗粒作为活性成分；[8]西尼罗病毒疫苗，其包含上述[3]的载体作为活性成分；等等。发明效果通过将本发明的信号肽连接到由WNV的prM蛋白和E蛋白组成的多蛋白，在宿主 细胞中VLP的形成和胞外分泌效率可以被改善。因此，包含信号肽和编码prM蛋白和E蛋 白的核酸的分泌型表达载体可用于高度分泌或产生WNV VLP的细胞系的制备，而且，该载体 本身可用作WNV DNA疫苗。附图概述
图1显示由重组表达载体(pWPMEl_pWPME14)编码的多肽。图2显示由具有重组表达载体(pWPMEl_pWPME14)的HEK293T细胞表达和分泌的 WNV E蛋白的蛋白质印迹结果，其中左图显示通过溶解该细胞获得的蛋白质的蛋白质印迹 结果，而右图显示分泌在培养基中的蛋白质的蛋白质印迹结果。在左上图和右上图中，抗日 本脑炎病毒(JEV)抗体被用作一抗，而在左下图和右下图中，抗M蛋白多克隆抗体被用作一 抗。在图中，E、prM和M分别显示E蛋白、prM蛋白和M蛋白的位置。图3显示通过由具有重组表达载体(pWPMEl-pWPME14)的HEK293T细胞分泌在培 养基中的定量E蛋白的夹心ELISA方法的比较结果，其中402单克隆抗体被用作一抗。图 4 显示由具有重组表达载体(pWPMEl、7、9、12、pWPME388A、pffPME406A)的 HEK293T细胞表达的WNV E蛋白的蛋白质印迹结果。抗日本脑炎病毒(JEV)抗体被用作一 抗，其中E和prM分别显示E蛋白和prM蛋白的位置。
图5显示通过由具有重组表达载体(pWPMEl、7、9、12、pWPME388A、pffPME406A)的 HEK293T细胞分泌在培养基中的定量E蛋白的夹心ELISA方法的比较结果，其中402单克隆 抗体被用作一抗。图6显示通过由具有重组表达载体(PWPME12)的HEK293T细胞在培养基中分泌的 蛋白质进行蔗糖密度梯度离心之后在各样品级分中定量E蛋白的夹心ELISA方法的比较结果。图7显示由具有重组表达载体(pWPME12)的HEK293T细胞分泌在培养基中的WNV 样颗粒的电子显微图像。左图显示包含于密度1. 16的样品级分中的病毒样颗粒，而右图显 示包含于密度1. 11的样品级分中的病毒样颗粒。图8显示通过由具有重组表达载体(PWPME12)的HEK293T细胞分泌在培养基中的 蛋白质进行蔗糖密度梯度离心之后在各样品级分中E蛋白的夹心ELISA方法的定量结果。 A显示使用WNY-11作为捕获抗体和WNY-11作为检测抗体获得的结果。B显示使用WNY-11 抗体作为捕获抗体和402抗体作为检测抗体获得的结果。C显示使用402抗体作为捕获抗 体和402抗体作为检测抗体获得的结果。D显示使用402抗体作为捕获抗体和WNY-11抗体 作为检测抗体获得的结果。E显示各样品级分的密度。图9显示通过使用用WNV样颗粒免疫的小鼠的血清进行的WNV血小板降低测定结 果，其中所用的血清被稀释，且血小板数为3个孔的总计。图10显示通过在无血清培养基中适应的CH0-K1 (亲株)和各克隆分泌在培养基 中的蛋白质进行蔗糖密度梯度离心之后WNV样颗粒的表达水平的蛋白质印迹比较结果，其 中抗日本脑炎病毒(JEV)抗体被用作一抗。实施本发明的最佳方式本发明提供用于高分泌生产WNV VLP的信号肽。该信号肽包括(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；(b)上述(a)的氨基酸序列的部分氨基酸序列，其包含至少氨基酸N011-25所示的 氨基酸序列；或(c)与上述(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。在本文，“基本上相同的氨基酸序列”是上述(a)或(b)的氨基酸序列，其中一个到 若干(2、3、4或5个)氨基酸被置换、缺失、添加或插入，其与WNV天然信号序列相比具有显 著高的WNV VLP分泌能力。当“基本上相同的氨基酸序列”包含氨基酸置换时，期望其在物理化学性质方面类 似于原来的氨基酸。例如，可以提到分类为同一组的氨基酸置换，诸如芳香族氨基酸(Phe、 Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、lie、Val)、极性氨基酸(Gin、Asn)、碱性氨基酸(Lys、 Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、具有小侧链的氨基酸 (Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等等。可以预测，这样的相似氨基酸的置换不改变蛋白质的表型 (即保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换的具体实例为本领域所熟知，且描述于各种文件 (参见，例如 Bowie et al.，Science, 247 :1306_1310 (1990))。当氨基酸(序列)被置换、 缺失或插入时，该置换、缺失或插入的位置不被特别限制，只要原始信号肽的WNV VLP分泌 能力被基本上保持。“基本上保持”是指与WNV的天然信号序列相比至少具有显著高的分泌 能力。
SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相应于西尼罗病毒NY99-flamingo382-99 株(Lanciotti, R. S. et al. , Science,286 :2333_2337,1999) (GenBank Accession No. AF196835)的多蛋白前体(GenBank登录号AAF20092. 2)的第99至123 (即从prM蛋白 的紧接N端之前到上游25个氨基酸残基的氨基酸)的氨基酸序列。迄今为止已经报道了 许多WNV变体，而新的突变体病毒株也将被接连地发现。因此，在这样的其它突变体WNV菌 株中相应于NY99-flaming0382-99菌株的上述特定序列的氨基酸序列也被包括在本发明 的信号肽的“基本上相同的氨基酸序列”中。除了 NY99-flaming0382-99株之外的突变体 WNV 菌株的实例包括在 Ebel，G. D. et al. ,Am. J. Trop. Med. Hyg. ,71(4) :493-500，2004 的表 I”中描述的那些等等。通过获得该表中所示的各登录号的序列和测定相应的区域，可以容 易地获得上述“基本上相同的氨基酸序列”。本发明的信号肽的氨基酸序列长度期望为最短15个氨基酸，而最长25个氨基酸。 它优选具有除了 20个氨基酸之外的长度。更优选，该信号肽的氨基酸序列长度为15-19个 或21-25个氨基酸，更优选15-18个氨基酸。因此，当“基本上相同的氨基酸序列”包含氨基酸的缺失、添加或插入时，期望其数 目范围在改变之后提供上述优选全长。当氨基酸被添加或插入时，被添加或插入的氨基酸 的种类不受特别限制，只要在添加或插入之后全长落入上述优选范围。本发明的信号肽还可以基于其氨基酸序列的信息，通过已知的肽合成方法产生， 例如固相合成法和液相合成法。鉴于该肽的使用目的，其用于从宿主细胞有效分泌WNV VLP，该肽作为通过培养包含编码多蛋白前体的核酸的表达载体的转化体而产生的该多蛋 白前体的N-端区域加以提供，其中所述核酸由包含编码该肽的碱基序列的核酸组成，所述 碱基序列被可操作地连接于编码组成目的VLP的prM蛋白和E蛋白的核酸。因此，本发明也提供基本上由编码本发明的上述信号肽的碱基序列组成的分离核 酸。在本文，“基本上由…组成”是指除了本发明的信号肽的氨基酸序列之外的氨基酸(排 除起始甲硫氨酸残基)不被包含于多蛋白前体的N端区域(除了 prM蛋白和E蛋白)，该多 蛋白前体通过适当的宿主细胞产生，所述宿主细胞具有适当的表达载体，所述表达载体包 含上述可操作地连接于编码WNV的prM蛋白和E蛋白的核酸的上述核酸。因此，除了编码 本发明信号肽的碱基序列可以包含于所述核酸的序列实例包括起始ATG密码子、促进所述 核酸连接到表达载体的启动子序列下游或编码WNV的prM蛋白的核酸上游的限制性内切酶 识别序列等等。所述核酸可以是DNA或RNA、或DNA/RNA嵌合体，优选DNA。所述核酸可以是双链 或单链。当所述核酸是双链的，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂合体。编码本发明的上述信号肽的碱基序列不受特别限制，只要它在翻译之后产生本发 明的上述信号肽的氨基酸序列的任何一个。当期望的信号肽与任一可得到的WNV株的多蛋 白前体的一部分完全相同时，编码所述氨基酸序列的碱基序列可以通过PCR方法等等和使 用来自所述病毒株的基因组RNA制备的cDNA作为模板而获得。这样的方法是有利的，因为 不仅信号肽而且编码WNV的prM蛋白和E蛋白的碱基序列可以立刻获得。取决于引物序列 的选择，编码具有不同的氨基酸序列长度的信号肽的核酸可容易地制备。另一方面，考虑到在宿主细胞中的表达效率，通常优选选择非常经常用于所用宿 主细胞的密码子。在各种生物品种中密码子的使用频率数据可以从例如在Kazusa DNAResearch nstitute 的主页(http //www, kazusa. or. jp/codon/index, html)中披露的遗 传密码使用频率数据库获得。对于根据所述宿主细胞的密码子使用频率进行的碱基序列转 换，编码信号肽的核酸的全长序列通过DNA/RNA自动合成仪进行化学合成，或者合成的部 分重叠的寡DNA短链通过PCR方法进行连接。本发明也提供WNV VLP表达载体，其包含本发明的上述信号肽和包含编码来源于 WNV的prM蛋白和E蛋白的碱基序列的核酸。在本文，“编码WNV的prM蛋白的碱基序列，，是指编码包含与SEQID NO 3所示的 氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列。“编码WNV的E蛋白的 碱基序列”是指编码包含与SEQ IDN0 5所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序 列的蛋白质的碱基序列。作为“与SEQ ID NO :3 (或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸 序列”，可以提及与SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列具有不少于约80%、 优选不少于约90%、更优选至少约95%、特别优选不少于约97%的同源性的氨基酸序列。在本文，“同源性”是指在最佳比对中与全部重叠氨基酸残基相同或类似的氨基酸 残基的比率(％)，其中两个氨基酸序列使用所述技术领域中已知的数学算法(优选地，为 了最佳比对，所述算法可以考虑在一个或两个序列上引入空位)进行比对。“类似氨基酸” 是指在它的生理化学性质方面相似的氨基酸，并且实例包括与原来的氨基酸分在同一组中 的氨基酸，例如类似于本发明的信号肽的上述的分类的分类。在本说明书和权利要求书中，氨基酸序列的同源性可以在下列条件下(期望值= 10 ；允许空位；矩阵=BL0SUM62 ；过滤=关闭)，使用同源性评分算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)力口以测 量。测定氨基酸序列同源性的其它算法例如披露于Karlin et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5873-5877 (1993)[该算法被并入 NBLAST 和 XBLAST 程序(2. 0 版本)(Altschul et al.，Nucleic Acids Res. ,25 :3389_3402 (1997))]；在Needlemanet al. ,J. Mol. Biol. ,48 444-453 (1970)中披露的算法[该算法并入GCG软件包中GAP程序]；在Myers和Miller, CABI0S，4 11-17 (1988)中披露的算法[该算法并入ALIGN程序(2. 0版本)，该ALIGN程 序是 CGC 序列比对软件包的一部分]；在 Pearson et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 2444-2448(1998)中披露的算法[该算法被并入GCG软件包中的FASTA程序]等等，并且这 些也可以被优选使用。更优选地，“与SEQ ID NO :3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列基本上相同的氨 基酸序列”是与SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列具有不少于约80%、优 选不少于约90%、更优选不少于约95%、特别优选不少于约97%的同一性的氨基酸序列。“包含与SEQ ID NO :3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸 序列的蛋白质”表示一种包含与上述的SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列 基本上相同的氨基酸序列、并且与包含SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5)所示的氨基酸序列 的蛋白质具有基本上相同的活性的蛋白质。在prM蛋白的情况下，“基本上相同的活性”是例如当其成熟为M蛋白时改变E蛋 白构象的活性等等，而E蛋白的“基本上相同的活性”是例如吸附到受感染宿主细胞、红血 球凝结活性等等。“基本上相同”是指这些活性在性质上相同。因此，上述活性的每一个优选是相当的(例如，约0. 5倍到约2倍)，但定量因素诸如活性程度和蛋白质分子量可以不 同。在本发明中使用的prM蛋白(E蛋白)包括例如这样的蛋白质，其包含(1)由SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5)显示的氨基酸序列，其中一个或更多个(优选约1_30个、更优 选约1-10个、仍更优选1-若干个(2、3、4或5个))氨基酸被缺失，(2)由SEQ ID N0:3(或 SEQ ID N0:5)显示的氨基酸序列，其中一个或更多个(优选约1-30个、更优选约1_10个、 仍更优选1-若干个(2、3、4或5个))氨基酸被添加，(3)由SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO 5) 显示的氨基酸序列，其中一个或更多个(优选约1-30个、更优选约1-10个、仍更优选1-若 干个(2、3、4或5个))氨基酸被插入，(4)由SEQ ID NO :3(或SEQ ID NO 5)显示的氨基 酸序列，其中一个或更多个(优选约1-30个、更优选约1-10个、仍更优选1-若干个(2、3、 4或5个))氨基酸被其它氨基酸置换，(5)这样的氨基酸序列的组合等等。当氨基酸序列如上所述被插入、缺失或置换时，该插入、缺失或置换的位置不被特 别限制，只要蛋白质的活性被保持。编码WNV的prM蛋白(或E蛋白)的DNA可以通过逆转录酶聚合酶链式反应(以 下缩写为“RT-PCR法”)和使用从WNV的病毒储库制备的RNA作为模板加以直接扩增。因 为prM蛋白和E蛋白在WNV基因组中被连续地编码，所以编码prM蛋白和E蛋白的DNA可以 通过设计能够扩增覆盖两者的编码区的碱基序列的引物来加以同时制备。而且，当WNV基 因组中的序列被用作编码本发明信号肽的碱基序列时，因为信号肽编码区位于紧邻prM蛋 白的编码区之前，所以三者也可以同时制备。编码prM蛋白(或E蛋白)的DNA的实例包括包含SEQ ID NO :2 (或SEQ ID NO 4)所示的碱基序列的DNA、包含在严格条件下与SEQ IDN0:2(或SEQ ID NO :4)所示的碱基 序列的互补链序列杂交的碱基序列的DNA、和编码与上述prM蛋白(或E蛋白)具有基本上 相同的活性的蛋白质的DNA等等。能够在严格条件下杂交到SEQ ID N0 :2 (或SEQ ID NO 4)所示的碱基序列的DNA 实例包括包含与SEQ ID N0:2(或SEQ ID NO :4)所示的碱基序列具有不小于约70%、优选 不小于约80%、更优选不小于约90%和特别优选不小于约95%的同源性的碱基序列的DNA寸寸。在本说明书和权利要求书中碱基序列的同源性可以在下列条件下(期望=10 ’允 许空位；过滤=开；匹配得分=1 ；错配得分=-3)使用同源性算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)进对于计 算。测定碱基序列同源性的其它算法的实例优选包括具有类似方式的上述氨基酸序列同源 性算法。根据本身已知的方法或基于它们的方法，例如描述于MolecularCloning，第二版 (J. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中的方法等等，可以进行杂 交。当使用市场上可买到的文库时，可以根据所附的使用手册中描述的方法进行杂交。优 选在高度严格条件之下进行杂交。严格条件的实例包括在45°C在6XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中进行杂交反应，然 后在65°C在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗涤一次或更多次等等。本领域普通技术人员可以通 过适当地改变杂交液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针长度、错配数、杂交反应时间、洗涤的盐浓度、洗涤温度等等而容易地调节到需要的严格程度。编码prM蛋白和E蛋白的DNA可以如上述从WNV基因组获得。通过化学合成DNA 链或通过PCR方法连接合成的部分重叠的寡DNA短链构建编码prM蛋白和E蛋白的全长的 DNA也是可能的。通过结合化学合成法或PCR法构建全长DNA的优点是如上所述，所使用的 密码子可以根据所述基因将被引入的宿主在所述基因的全长范围内进行设计。如上述克隆的DNA可不加改变地使用，或者在用限制性核酸内切酶消化或按照需 要添加接头之后再使用，取决于它的使用目的。当编码信号肽的DNA、编码prM蛋白的DNA 和编码E蛋白的DNA被单独克隆时，它们通过使用适当的限制性内切酶、连接体(linker)、 连接酶等等以上述顺序连接。然后，在根据需要将作为翻译起始密码子的ATG引入5’端侧和将作为翻译终止密 码子的TAA、TGA或TAG引入3’端侧之后，所获得的编码"信号肽-prM蛋白-E蛋白"多 蛋白前体的DNA通过使用限制性内切酶和DNA连接酶在适当的表达载体中连接到启动子下 游。使用适当的合成DNA接头，可以添加翻译起始密码子和翻译终止密码子。可选地，预先 利用PCR，它们可以分别被引入编码所述信号肽的碱基序列的5’侧和编码E蛋白的碱基序 列的3’侧。有用的表达载体包括来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒(例如pBR322、 pBR325、pUC12、pUC13)；来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如pUB110、pTP5、 PC194)；来源于酵母的质粒(例如pSH19、pSH15)；昆虫细胞表达质粒(例如pFast-Bac)； 动物细胞表达质粒(例如 pCAGGS、pA l-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；噬菌体 诸如\噬菌体；昆虫病毒载体诸如杆状病毒(例如，BmNPV, AcNPV)；动物病毒载体诸如反 转录病毒、牛痘病毒、腺病毒；等等。启动子可以是任何启动子，只要它适于用于表达所述基因的宿主。例如，当宿主是动物细胞时，包括CAG启动子、肌动蛋白启动子、SRa启动 子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(Rous肉瘤病毒)启动子、 MoMuLV(Moloney鼠白血病病毒)LTR、HSV_TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等等的可用 启动子被使用。在这些之中，CAG启动子是优选的。当宿主是杆菌属的细菌时，优选SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等等。当宿主是酵母时，优选PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等等。当宿主是昆虫细胞时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子等等。除了上述之外，有用的表达载体包括任选地包含增强子、剪接信号、polyA添加信 号、选择标记、SV40复制起点(以下有时缩写为SV40ori)等等的那些表达载体。作为选择 标记的实例，二氢叶酸还原酶基因(以下有时缩写为dhfr，氨甲喋呤(MTX)抗性)、氨苄青 霉素抗性基因(以下有时缩写为amf)、新霉素抗性基因(以下有时缩写为nec/，G418抗 性)等等可以被提到。特别地，当dhfr-缺陷中国仓鼠(CH0-dhfr_)细胞与作为选择标记 的dhfr基因结合使用时，使用无胸苷培养基，还可以选择靶基因。通过培养用包含核酸的表达载体转化宿主而获得的转化体，可以产生WNV VLP,所 述核酸包含编码本发明的信号肽、prM蛋白和E蛋白的碱基序列。例如，有用的宿主包括适于分泌表达的那些，诸如杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、 昆虫、动物细胞、动物等等。
有用的杆菌属细菌包括例如枯草杆菌MI 114、207_21等等。有用的酵母包括例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) AH22、AH22R\ NA87-11A、DKD-5D 和 20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913 和 NCYC2036，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)KM71等等。当病毒是AcNPV时，可以提到可用的昆虫细胞，包括例如草地贪夜蛾细胞 (Spodoptera frugiperda) (Sf 细胞)、来源于粉纹夜蛾(Trichoplusiani)中肠的MG1 细胞、 来源于粉纹夜蛾卵的High Five 细胞、来源于甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞、来 源于Estigmena acrea的细胞等等。当病毒是BmNPV时，有用的昆虫细胞包括家蚕(Bombyx mori)N细胞(BmN细胞)等等。有用的Sf细胞包括例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细 胞等等。有用的昆虫包括例如家蚕幼虫等等。有用的动物细胞包括例如诸如C0S-7、Vero、CH0、CH0(dhfiO、CH0-Kl、L、AtT-20、 GH3、FL、HEK293、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、P388 等等的细胞。优选 地，HEK293、CH0-K1等等被使用，但动物细胞不限于此。作为动物，具有建立的转基因系统的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、 牛)、鸡等等可以被提到。
根据宿主的种类，依照公众已知的方法，可以进行转化。例如，依照描述在Molecular&GeneralGenetics,vol. 168,111(1979)中的方法等 等，杆菌属细菌可以被转化。例如，依照描述在Methods in Enzymology, Vol. 194,182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75，1929 (1978)中的方法等等，酵母可以被转化。例如，依照描述在Bi0/TeChn0l0gy，6，47-55(1988)中的方法等等，昆虫细胞和昆 虫可以被转化。例如，依照描述在由 Shujunsha 出版的 Saibo Kogaku(CellEngineering)，extra issue 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol(New CellEngineering Experimental Protocol)，263-267 (1995)、或者 Virology, Vol. 52，456 (1973)中的方法，动物细胞可以被转化。例如，依照描述在 Development of Transgenic Animal (CMCPublishing) (2001) 中的方法，动物可以被转化。根据宿主的种类，依照已知的方法，可以培养转化体。对于采用杆菌属作为宿主的转化体的培养，例如，用于所述培养的培养基优选是 液体培养基。此外，培养基优选包含碳源、氮源、无机物等等，它们为转化体生长所需的。碳 源的实例包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等等；氮源的实例包括无机或有机物质诸如 铵盐、硝酸盐、玉米浆、胨、酪蛋白、肉膏、大豆饼、马铃薯提取物等等；而无机物的实例包括 氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等等。此外，培养基可包含酵母抽提物、维生素、生长促进因子 等等。培养基具有优选约5-约8的pH。转化体通常在约30-约40°C培养约6-约24小时。 在必要时，也可进行通风和搅拌。用于培养采用酵母作为宿主的转化体的培养基实例包括Burkholder基本培养 基、包含0.5%酪蛋白氨基酸的SD培养基等等。培养基具有优选约5-约8的pH。通常在约20-约35°C进行培养约24-约72小时。在必要时，也可进行通风和搅拌。用于培养采用昆虫细胞或昆虫作为宿主的转化体的培养基实例包括适当补充诸 如灭活10%牛血清等添加剂的格拉斯昆虫培养基等等。培养基具有优选约6. 2-约6. 4的 pH。通常在约27°C进行培养约3-约5天。在必要时，也可进行通风和搅拌。用于培养采用动物细胞作为宿主的转化体的培养基实例包括最低基础培养基 (MEM)、Dulbecco，s Modified Eagle Medium(DMEM)、RPMI1640 培养基、199 培养基等等，包 含约5-约20%的胎牛血清。培养基具有优选约6-约8的pH。通常在约30°C -约40°C培 养约15-约60小时。在必要时，也可进行通风和搅拌。当宿主是动物时，转基因动物依照常规方法从转基因受精卵获得并在一般性繁殖 体况之下进行繁殖，并获得哺乳动物乳或鸡蛋。以上述方式，WNV VLP可以在转化体培养基中分泌或细胞外分泌。而且，在本发明中，转化体可以在如上所述包含胎牛血清的培养基中培养。然而， 从去除诸如进入胎牛血清而污染细胞的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等危险因子、去除诸如 牛衍生蛋白等杂质以图简化WNVVLP纯化步骤和经济方面考虑，也优选使用包括采用无血 清顺应培养转化体的方法。如下叙实施例所描述，优选通过在无血清培养基中顺应从粘附 细胞获得非粘附细胞，因为它促进转化体的维持、传代和大量培养。分泌在培养基中(细胞外)的VLP可以通过本身已知的方法纯化。例如，VLP可 以通过过滤回收的培养基(胞外液)以除去低分子量蛋白质并对所述培养基施加蔗糖密度 梯度离心来加以制备。本发明的WNV疫苗包含作为活性成分的WNV VLP，其量足以提供免疫性。特别地， 例如，WNV疫苗可以如下所述产生，尽管不限于此。作为抗原的纯化的本发明VLP被悬浮于溶剂，诸如等渗盐溶液、缓冲液、组织培养 液等等，例如PBS (磷酸盐缓冲盐水)，以产生疫苗储液。在必要时，疫苗抗原可以用常规固 定剂固定，以同时固定其空间结构。固定剂的实例包括甲醛、苯酚、戊二醛、0 -丙内酯等等。 固定剂可以在制备疫苗储液之前被添加至抗原，或被添加到疫苗储液。然后，疫苗储液被稀释，产生疫苗溶液。疫苗储液例如用PBS稀释，以便在疫苗 中抗原的量将足以诱导抗体产生，提供免疫性例如以蛋白质含量计算l-20i!g/ml，优选 lOy g/ml。对于疫苗溶液的制备，加强疫苗耐热性的稳定剂和作为增强免疫原性的助剂的 佐剂可被添加。作为稳定剂，糖和氨基酸可以被提到。作为佐剂，矿物油、植物油、明矾、铝 化合物、膨润土、二氧化硅、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白介素等等可以被提到。疫苗溶液分配在具有适当体积的容器中，例如约0. 5-20ml小瓶，而该容器被紧密 密封并用作疫苗。这样的疫苗可以是液体，或在分配之后被冷冻干燥并用作干制品。本发明的疫苗可以与一般性疫苗相同的方法被种入对象。例如，对于一个剂量，约 0. 2-0. 5ml的疫苗可以约1-4周间隔皮下接种1-3次。接种之前干制品溶于无菌蒸馏水至 原始体积，其后被使用。由于表达载体(非病毒载体和病毒载体)_其包含本发明的上述信号肽和包含编 码WNVprM蛋白和E蛋白的碱基序列的核酸-可以在其给药至人之后在人体中高效分泌WNV VLP，它可用作所谓的DNA疫苗。这些非病毒载体和病毒载体的优选产生方法、给药方法等等为本领域普通技术人员所知，并且例如 Experimental Medicine, extra issue, basictechnique of gene therapy, Y0D0SHA,1996 ；Experimental Medicine, extraissue, Transgene&Expression Analysis Experiment Method, Y0D0SHA, 1997 ；ed.Japan Society of Gene Therapy,Gene Therapy DevelopmentResearch Handbook, NTS，1999 等等被用于参考。适于 DNA 疫苗的 非带病毒体的实例包括但不限于 pcDNA3. 1、pZeoSV、pBK-CMV(Invitrogen, Stratagene)、 pCAGGS(Gene 108，193-200 (1991))等等。代表性的病毒载体包括病毒载体，诸如重组腺病 毒、反转录病毒等等。具体而言，例如，DNA病毒诸如解毒反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、 疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、骨髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、日本血凝病毒、SV40、人类免 疫缺陷性病毒(HIV)等等和RNA病毒可以被提到。作为将本发明的DNA疫苗引入人的方法，可以提及包括直接将DNA疫苗直接引入 体内的体内方法，包括将从人取出某一细胞、将DNA疫苗在细胞外引入所述细胞并将所述 细胞返回入体内的先体外后体内的方法等等(ed. Japan Society of Gene Therapy, Gene TherapyDevelopment Research Handbook, NTS，1999)。根据体内方法,本发明的 DNA 疫苗 被溶于适当的溶剂(缓冲液诸如PBS等等、盐水、无菌水等等)、根据需要通过过滤器等过滤 杀菌、装入无菌容器以产生注射剂，其通过注射被给药于人。注射剂根据需要可包含常规载 体等等。此外，DNA疫苗也可包封入由脂双层膜制成的脂质体，并作为通过融合脂质体和钝 化日本血凝病毒(HVJ)获得的HVJ-脂质体给药(Experimental Medicine, extra issue, basic technique of gene therapy, Y0D0SHA, 1996 ；Transgene&Expression Analysis Experiment Method, Y0D0SHA，1994)。本发明的DNA疫苗可以被给药于肌肉、皮肤、鼻腔等 等。作为先体外后体内(exvivo)方法，可以提及脂转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖 法、包括使用微玻璃管直接细胞内注入DNA疫苗的方法等等。尽管本发明的DNA疫苗的剂量根据给药目标、给药方法、给药方式等而变化，它通 常是基于所述基因每一成年人约500 u g-约50mg、优选约500 u g-约lmg。通过参考非限定性的实施例在下文中更详细地进行解释本发明。
实施例实施例1表达WNV来源的突变信号肽序列、prM蛋白质和E蛋白的重组表达载体 的产牛。聚腺苷酸化的RNA从WNV(WN-NY99)提取，并使用其作为模板和15个核苷酸 多(dT)引物，使用 superscript RNase IT 逆转录酶 InvitrogenLife Technologies, Carlsbad, CA)进行反转录反应通过使用互补引物组(SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示的 碱基序列)，PCR扩增所获得的WNV cDNA的编码区。所获得的PCR产物用Bglll和Xhol消 化，并亚克隆到pBluescript质粒。使用所获得的质粒作为模板和与编码从氨基端侧缺失 一个氨基酸的信号序列的碱基序列互补的引物组(一个碱基序列选自SEQ ID N0:8-21和 一个碱基序列由SEQ ID NO 22所示)，通过PCR扩增DNA片段。该扩增的片段被亚克隆到 哺乳动物表达载体(pCAGGS)，产生14种表达具有特定长度的信号序列、prM蛋白和E蛋白 重组表达载体(pWPMEl-pWPME14)。由该获得的PCR产品编码的多肽结构被示于图1。^MM 2 H有i舌于Z7H必的长It范围6射言号肽序歹Il^li平价使用 Fugene 6 (Roche Diagnostic，Basel，Switzerland)，将在实施例 1 获得的各种重组表达载体(0.5iig)引入HEK293T细胞(2 X 105)。在48hr之后，细胞用磷酸盐缓冲盐 水(PBS)洗涤两次，用包含50mM Tris-HCl(pH 6. 8)、100mM 二硫苏糖醇、2%十二烷基硫酸 钠(SDS)、0. 溴酚蓝和10%甘油的溶解液溶解。另一方面，培养上清液被过滤(0.45i!m 孔径，Millipore，Bedford, MA)并在40，000X g进行超离心处理30min。用上述的溶解液 溶解残余物。根据常规方法，使上述获得的WNV样颗粒经受SDS-PAGE、膜转录和使用抗体进行 蛋白质印迹。具体而言，通过10% PAGE分离蛋白质，将分离的蛋白质转录到聚二氟乙烯 (PDVF)滤膜(Millipore)。作为一抗，与WNV交叉反应的抗日本脑炎病毒(JEV)抗体和抗M 蛋白多克隆抗体(IMGENEX，San Diego, CA)被使用，而作为二抗，与辣根过氧化酶偶联的抗 兔 IgG(Pierce，Rockford，IL)被使用。对于发光，ECL 试剂(AmershamPharmacia Biotech, Piscataway，NJ)被使用，并通过 LAS 1000 成像系统(Fujifilm, Tokyo, Japan)检测发光。 在重组表达载体之间WNV样颗粒的表达被示于图2中。而且，根据描述在 Kojima, A. , A. Yasuda, H. Asanuma, T. Ishikawa, K. Yasui, T. Kurata. J. Viorl 77 =8745-55(2003)中的方法，通过夹心ELISA方法，使用抗E蛋白抗原 的单克隆抗体(402)，在上述各重组表达载体之间比较分泌在培养基中的E蛋白抗原。具体而言，使用包被402抗体的微量培养板(Corning IncorporatedLife 5(^61 ^8，六(^011，嫩)，结合￡蛋白。使用与辣根过氧化酶偶联的402抗体(TMB ；DAK0 Corp.， Carpinteria, CA)作为底物，检测结合的E蛋白抗原。在各种重组表达载体之间WNV样颗 粒的分泌量的比较被示于图3中。此外，通过在紧邻重组表达载体pWPMEl和pWPME7的起始氨基酸之后添加丙氨酸 获得的重组表达载体(pWPME388A、pffPME406A)被产生，并且该表达水平通过上述方法在各 种重组表达载体之间进行比较。结果示于图4和5中。由这些结果，发现信号序列的长度 大大影响WNV样颗粒的表达和分泌。实施例3通过电子显微镜观察WNV样颗粒的图像在实施例1中获得的重组表达载体被引入HEK293T细胞，而在48hr后收集培养 基。收集的培养基被过滤(0. 45 um,Millipore)和纯化(Biomax-100滤膜，Millipore)。通 过除去分子量小于lOOkDa的蛋白质小分子获得的WNV样颗粒被施加于10-45% (w/w)蔗糖 密度梯度离心(150，000 Xg, 14hr)。样品级分1_17的密度和E蛋白抗原量根据上述ELISA 方法进行测量。结果，在密度为1. 11的样品级分9和密度为1. 16的样品级分4中观察到 E蛋白抗原的峰(图6)。ililSephadex G~25ft (Hiprep ；Amersham Pharmacia Bioteck)
述获得的两个样品级分4和9中除去低分子量混合物，并且E蛋白抗原用磷酸盐缓冲盐水 洗脱并在4°C保存。使用渡铜弗姆瓦(formar)网，用磷钨酸钠负染色所获得的纯化抗原。 用JOEL 1200Ex电子显微镜(Hitachi，Tokyo, Japan)观察该样品。结果，样品级分9被证 实具有许多直径约30nm并具有球形结构的颗粒(图7，右侧)。另一方面，在样品级分4中， 偶而看见具有各种形状并涂有染色液的颗粒(直径约25nm)(图7，左侧)。实施例4诱导WNV样颗粒中和抗体的表位分析在实施例1中获得的重组表达载体pWPMEl2被引入HEK293T细胞，并使获得的E 蛋白抗原进行蔗糖密度梯度离心，产生样品级分1-11 (图8E)。根据上述ELISA法，通过使用WNY-11抗体(WNV中和抗体)和402抗体(非中和抗体)作为捕获抗体或检测抗体，发 现具有高含量E蛋白抗原的样品级分，所述E蛋白抗原具有中和表位。结果，当WNY-11抗 体被用作捕获抗体和检测抗体时，峰在样品级分3 (密度1. 16)和样品级分5 (密度1. 11) 中可得到确认(图8A)。另一方面，当WNY-11抗体和402抗体被用作捕获抗体和/或检测 抗体时，与只使用WNY-11抗体相比，在样品级分5中E蛋白抗原的含量下降(图8B-D)。在 样品级分3中由WNY-11识别的中和表位似乎少于样品级分5中的中和表位。实施例5评价中和抗体的诱导件质使用包括在实施例4中制备的样品级分3和5在内的复数个级分，评价在小鼠中 中和抗体的诱导是否可能。具体而言，BALB/c小鼠用佐剂-偶联的WNV样颗粒(约300ng， 人日本脑炎疫苗配制重量的1/16)以7日间隔腹膜内免疫两次。从第二次免疫3周后，通 过血小板降低测定确定免疫小鼠的中和抗体滴度。结果，用纯化WNV样颗粒免疫的小鼠以 高水平表达中和抗体(图9)。实施例6转化细胞的津立(1)粘附转化细胞的建立7次传达之后的单层CH0-K1细胞在转染前一天以1 5、1 10或1 20分传 比在(p60 mm平皿上铺展，第二天，pffPME12(5ug)被引入30-40%汇合的细胞。在形成 单层之前培养2天之后，细胞以1 5、1 10或1 20分传，并在含有杀稻瘟菌素S(BS) (I0ug/ml)的选择培养基中在cpioo mm平皿中培养8天(改变培养基一次)。通过青霉素 杯碟法，取出在选择培养基中生长的24个集落，转入24孔板并进一步在选择培养基(之后 为包含BS的选择培养基)中培养。其后，通过在24孔板、6孔板和(pioo mm平皿中传代， 逐渐培养所述细胞，所获得的细胞被冷冻保藏。根据ELISA，测量在24孔板和6孔板中培养 的培养基中WNV E蛋白的量，并选择集落#_22，其显示最大产生量。然后，根据常规方法，通 过限制稀释法，亚克隆集落#_22细胞亚克隆，并选择克隆#_22. 6细胞和亚克隆#_22. 6. 6， 其根据ELISA显示最大WNV E蛋白产生水平。图10显示了通过蛋白质印迹比较在亲本细 胞和各克隆之间E蛋白抗原的表达和分泌的结果。(2)粘附转化细胞在无血清培养基中的顺应在上述(1)中冷冻保藏的粘附克隆#_22. 6细胞或亚克隆#_22. 6. 6细胞被放回包 含10 ii g/ml BS和10% FBS的F12K培养基(GIBC0)，并通过维持3_4代确认生长。以相同 的量混合含有10 u g/ml BS和10% FBS的F12K培养基和含有10 u g/ml BS的CH0-S-SFM II培养基，并在所得到的培养基(最终包含5% FBS)中培养两代，以在无血清培养基中开 始顺应。之后，在包含相同量的含有10 y g/ml BS的CH0-S-SFM II培养基(GIBC0)的培养 基中培养所述细胞，并且F12K培养基的FBS浓度和比率逐渐按半下降。当细胞甚至在没有添加胰蛋白酶-EDTA溶液的情况下通过用PBS(-)移液从培养 瓶脱附时，它们仅在CH0-S-SFM II培养基中被连续传代。当细胞的生长是优良的(生长到 约5-10X105/ml，其中通过l-2X105/ml的传代，活细胞不小于95% )并且所述细胞能够通 过移液在培养基中传代，判断它们已经在无血清培养基中顺应。所述细胞被进一步传代，并 且显示出连续3次以上以lX106/ml生长的完全顺应(完全适应(Full-Adapt))细胞和显 示出连续10次以不小于lX106/ml生长的最佳顺应(最佳适应(Best-Adapt))细胞被冷 冻保藏(#_22. 6S 和 #_22. 6. 6S 细胞)。
此外，因为粘附CH0细胞在无血清培养基中顺应处理期间显示出成为非粘附细胞 的根本的性质变化，它们具有在该处理中降低抗原蛋白产量的可能性。因此，顺应的非粘附 细胞#_22.6S被克隆和再克隆。克隆方法遵循常规方法。然而，因为顺应非粘附细胞的生 长显示出对细胞密度的高依赖性，每孔散布的细胞数目设置为3、10、30和100个。各生长 克隆优选选自具有较少的散布细胞数的孔，并通过ELISA和IFA检验蛋白质的生产量。然 而，在所选择的复数个克隆和亚克隆之间没有发现显著的差异。工业实用性本发明可以高效地分泌和产生WNV的VLP，并且可以以低成本、安全稳定地提供包 含VLP作为活性成分的WNV的亚单位疫苗。此外，本发明的WNV VLP分泌表达载体本身可 用作WNV的DNA疫苗。本申请基于在日本提交的专利申请号2007-290169 (申请日2007年11月7日)， 其内容在本文完全并入。
1权利要求
信号肽，其包含与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；(b)所述(a)的氨基酸序列的部分氨基酸序列，其包含至少氨基酸NO11-25所示的氨基酸序列。
2.分离的核酸，其基本上由编码权利要求1所述的信号肽的碱基序列组成。
3.西尼罗病毒样颗粒表达载体，其包含核酸，所述核酸包含编码权利要求1所述的信 号肽和来源于西尼罗病毒的prM蛋白和E蛋白的碱基序列。
4.通过用权利要求3所述的载体转化获得的转化体。
5.产生西尼罗病毒样颗粒的方法，其包括培养权利要求4所述的转化体和回收分泌在 培养基中的病毒样颗粒。
6.通过权利要求5所述的方法获得的西尼罗病毒样颗粒。
7.西尼罗病毒疫苗，其包含权利要求6所述的颗粒作为活性成分。
8.西尼罗病毒疫苗，其包含权利要求3所述的载体作为活性成分。
9.预防西尼罗热的方法，其包括为对象给药有效量的权利要求3所述的载体。
10.预防西尼罗热的方法，其包括为对象给药有效量的权利要求6所述的病毒样颗粒。
全文摘要
本发明提供通过改变来源于西尼罗病毒(WNV)的信号序列获得的高度分泌或产生病毒样颗粒(VLP)的信号肽、所述信号肽、包含编码prM蛋白和E蛋白的核酸的WNV VLP分泌表达载体、高度分泌或产生WNPVLP的包含所述载体的动物细胞系、包含通过所述细胞系获得的WNVVLP作为活性成分的WNV疫苗、和包含所述VLP分泌表达载体作为活性成分的WNV DNA疫苗。
文档编号A61K35/76GK101855349SQ20088011525
公开日2010年10月6日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者小岛朝人, 石川丰数, 高桥秀宗 申请人:日本国立感染症研究所;财团法人阪大微生物病研究会