一种柱状跟腱修复材料及其制备方法

1.本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种柱状跟腱修复材料及其制备方法。


背景技术：

2.跟腱损伤是临床上一种较常见的运动损伤，在人体肌腱断裂损伤中居第3位。据统计，跟腱损伤的发病率18/10000，急性跟腱断裂由于医生的误诊和患者的疏忽漏诊率可高达27％。漏诊后不能得到及时恰当治疗时间大于4周以上，就发展成为陈旧性跟腱断裂。好发于运动员和从事较大工作强度的人群，已严重影响人们的工作与生活。常见的跟腱损伤有急性跟腱断裂、跟腱缺损、慢性跟腱病。对于急性跟腱断裂和跟腱缺损一般均采用手术治疗，术后造成了跟腱的粘连、疤痕挛缩等副损伤。慢性跟腱病的治疗包括理疗、药物、细胞疗法等等，但只能在一定程度上缓解疼痛，且容易复发。
3.经过多年的探索，组织工程技术的发展为解决跟腱损伤提供了新的思路，但是目前组织工程肌腱中应用较多的人工合成材料是聚乳酸和聚羟基乙酸，生物相容性较差，降解后是酸性的，其本身的成分要在体内进行完全的重塑才能被利用，跟腱损伤修复效果不佳。且跟腱是腓肠肌和比目鱼肌的延续，最终汇聚成一束椭圆形结构的结缔组织，跟腱缺损后，低生物力学强度的组织工程肌腱难以满足跟腱修复后的力学保障。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的问题是如何开发一种跟腱修复材料，提高生物相容性和生物力学强度，改善损伤修复效果。
5.为达到上述目的，本发明提供了一种柱状跟腱修复材料，包括柱状的sis支架，所述sis支架表面种植有肌腱干细胞。
6.进一步地，所述sis支架由3-6层片状sis叠放并卷曲而成。
7.进一步地，所述sis支架上所述肌腱干细胞的种植密度为1
×
10
5-1
×
107细胞/cm2。
8.相对于现有技术，本发明的柱状跟腱修复材料在形态上与正常跟腱相仿，且具有高生物力学强度，可以满足跟腱修复后的力学保障，改善损伤修复效果；修复材料以柱状sis作为生物支架，肌腱干细胞作为种子细胞，具有很好的生物相容性以及很强的成腱分化能力。进行跟腱修复时，柱状的sis支架可以与跟腱断端相连，隔绝周围软组织与跟腱断端的粘连，同时将其负载的肌腱干细胞准确地附着在断端，为肌腱干细胞的增殖和迁移提供了良好的细胞微环境，具有很好的跟腱修复效果。
9.本发明还提供一种柱状跟腱修复材料的制备方法，包括以下步骤：
10.s1、制备sis支架：收集猪小肠，经机械处理、脱细胞处理获得小肠黏膜下层，将多层sis规则叠放，冷冻干燥后卷曲成柱状并缝线固定，得到sis支架；
11.s2、肌腱干细胞分离纯化：收集大鼠跟腱，经机械处理、分离、纯化、克隆繁殖得到肌腱干细胞；
12.s3、肌腱干细胞接种：将肌腱干细胞种植到sis支架上，得到柱状跟腱修复材料。
13.相对于现有技术，本方法先分别制备sis支架和提取肌腱干细胞，sis支架由多层sis卷曲成柱状，形态上与正常跟腱相仿，缝线固定保持形状不变，且可以根据需修复部位结构进行裁剪，适用范围广，使用方便，再将一定密度的肌腱干细胞加入sis支架上共培养，肌腱干细胞可以在sis支架上存活和粘附，对于跟腱具有很好的修复效果。
14.进一步地，所述步骤s1具体包括：
15.s11、收集猪小肠，清洗后切割成小段，进行机械处理，撕去小肠的浆膜和肌层，刮去粘膜层和粘膜肌层，得到小肠黏膜下层sis，sis用pbs缓冲液浸泡清洗；
16.s12、将sis浸泡于甲醇和氯仿的混合液中4-12h，混合液中甲醇和氯仿的体积比为1:1-1:3，取出后用pbs缓冲液浸泡清洗；
17.s13、将sis浸泡于含0.02％-1.0％胰蛋白酶的0.02％-1.0％edta溶液中4-12h，取出后用pbs缓冲液浸泡清洗；
18.s14、用含0.1％-1.0％sds的0.9％氯化钠溶液浸泡sis 1-4次，每次4-12h，取出后用pbs缓冲液浸泡清洗；
19.s15、酒精浸泡sis，晾干，将脱细胞后的sis铺展于培养皿上，将3-6层sis规则叠放，冷冻干燥得到冻干的sis片；
20.s16、裁剪sis片，将sis片卷曲成柱状并缝线固定。
21.本发明方法脱细胞效果好，制得的sis生物相容性强，制备的sis支架由多层sis组成，具有高生物力学强度，可以满足跟腱修复的需要，是理想的跟腱支架材料。
22.进一步地，所述步骤s2具体包括：
23.s21、收集sd大鼠的跟腱，用pbs缓冲液浸泡清洗，将跟腱切割成组织块；
24.s22、将组织块转移至离心管，离心去除pbs缓冲液，然后加入i型胶原酶，在37℃、5％co2环境中消化2.5h-8h，过滤后得到单细胞悬液；
25.s23、单细胞悬液中释放的细胞用pbs缓冲液洗涤，离心去除多余pbs缓冲液，用完全培养基重悬后置于培养皿中；
26.s24、将细胞置于37℃、5％co2环境的细胞孵箱中，当细胞克隆繁殖至孔板面积90％时，开始传代，收集传代细胞作为肌腱干细胞。
27.进一步地，所述步骤s24中，传代密度为5000-8000细胞/cm2，收集第3代细胞作为肌腱干细胞。
28.进一步地，所述步骤s24中，收集第3代细胞作为肌腱干细胞。
29.进一步地，所述步骤s3具体包括：
30.s31、按需要裁剪sis支架，放置于培养皿中，酒精浸泡后晾干；
31.s32、sis支架用pbs缓冲液清洗后放入孔板中，每孔加入完全培养基和肌腱干细胞；
32.s33、置于37℃、5％co2环境的细胞孵箱培养2-7天，将肌腱干细胞种植在sis支架上，得到柱状跟腱修复材料。
33.可选地，所述步骤s3中，每孔加入4000-6000个肌腱干细胞。
34.本发明方法可以根据需要制备不同尺寸的柱状跟腱修复材料，适于临床使用，在sis支架上肌腱干细胞可以快速增殖，对跟腱修复效果好。
附图说明
35.图1是实施例1中制备sis支架的长度尺寸图；
36.图2是实施例1中制备sis支架的厚度尺寸图；
37.图3是实施例1中柱状跟腱修复材料的实物图；
38.图4是实施例2中sis脱细胞前后的h&e染色图像；
39.图5是实施例2中sis脱细胞前后的dapi染色图像；
40.图6是实施例2中sis脱细胞前后的扫描电镜图像；
41.图7是实施例3中sis支架的最大载荷测试结果图；
42.图8是实施例4中肌腱干细胞用流式细胞仪分析结果图；
43.图9是实施例5中肌腱干细胞种植于sis支架上的cck8增殖实验结果图；
44.图10是实施例5肌腱干细胞在sis支架上的分化标志基因检测图。
具体实施方式
45.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
46.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
47.实施例1柱状跟腱修复材料的制备
48.柱状跟腱修复材料的制备方法包括以下步骤：
49.s1、制备sis支架
50.s11、收集猪小肠，清洗后切割成5cm-10cm左右的小段，进行机械处理，撕去小肠的浆膜和肌层，刮去粘膜层和粘膜肌层，得到小肠黏膜下层sis，将sis浸泡于pbs缓冲液中，摇床上晃动洗涤3次，每次5-30min。
51.s12、将步骤s11得到的sis浸泡于甲醇和氯仿的混合液中，混合液中甲醇和氯仿的体积比为1:1-1:3，摇床上晃动4-12h，以提取结合态酯类，取出sis浸泡于pbs缓冲液中，摇床上晃动洗涤3次，每次5-30min，再重复上述步骤1次。
52.s13、将s12步骤处理过的sis浸泡于含0.02％-1.0％胰蛋白酶的0.02％-1.0％edta溶液中，摇床上晃动4-12h，取出sis浸泡于pbs缓冲液中，摇床上晃动洗涤3次，每次5-30min。
53.s14、将s13步骤处理过的sis浸泡于含0.1％-1.0％sds的0.9％氯化钠溶液，浸泡1-4次，每次4-12h，sis取出后用pbs缓冲液浸泡清洗，摇床上晃动洗涤3次，每次5-30min。
54.s15、将经过脱细胞处理的sis用75％的酒精浸泡20-60min，晾干，将脱细胞后的sis铺展于直径为15cm的玻璃皿，将3-6层sis规则叠放，放入-80℃冰箱，冷冻1-4h后进行冷冻干燥，3-5h后即可得到冻干的sis片。
55.s16、裁剪一定大小的sis片，将sis片卷曲成柱状并缝线固定，得到sis支架，常温保存。
56.sis支架的尺寸如图1和图2所示，sis支架的长度可以根据需要修补的跟腱长度进行裁切。图2中a为仅有1层sis的sis片卷曲制成的sis支架，b为2层sis的sis片卷曲制成的sis支架，c为3层sis的sis片卷曲制成的sis支架，d为4层sis的sis片卷曲制成的sis支架，将4层sis卷曲后，可以模拟正常跟腱的直径(2-3mm)，继续增加sis的层数，sis支架的厚度可以进一步增加，力学强度提高。
57.s2、肌腱干细胞分离纯化
58.s21、收集sd大鼠的跟腱，用pbs缓冲液浸泡清洗3次，每次5-30
59.min，将跟腱切割成组织块，面积约1mm3。
60.s22、用无菌注射器将组织块转移至15ml离心管，300g离心5-30min，去除多余pbs，然后加入i型胶原酶(5mg/ml；索莱宝)3ml，在37℃、5％co2环境中消化2.5h-8h，70μm细胞滤网过滤离心管，去除未消化的组织块，制备得到单细胞悬液。
61.s23、单细胞悬液中释放的细胞用pbs缓冲液洗涤，300g离心5-30min，去除多余pbs缓冲液，然后用完全培养基重悬，完全培养基为dmem+15％bi干细胞专用血清+1％双抗，重悬后置于6cm培养皿中。
62.s24、将细胞静置于37℃、5％co2环境的细胞孵箱中，当细胞克隆繁殖至孔板面积90％时，开始传代，传代密度以5000-8000/cm2为准，收集第3代细胞作为肌腱干细胞，进行下一步步骤。
63.s3、肌腱干细胞接种
64.s31、按需要裁剪步骤s1制得的sis支架，放置于6cm培养皿中，酒精浸泡后晾干，75％酒精浸泡30min，弃酒精后，在超净台晾干。
65.s32、sis支架用pbs缓冲液清洗3次，每次5-30min，清洗后将sis支架放入孔板中，每孔加入完全培养基100μl和5000个步骤s2制得的肌腱干细胞。
66.s33、孔板置于37℃、5％co2环境的细胞孵箱培养2-7天，将肌腱干细胞种植在sis支架上，得到柱状跟腱修复材料，sis支架上肌腱干细胞的种植密度为1
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106细胞/cm2。柱状跟腱修复材料的实物如图3所示。
67.在其他实施方式中，可以调整步骤s3中种植的肌腱干细胞数量，以改变sis支架上肌腱干细胞的种植密度，在每孔种植数量为4000-6000个，种植密度为1
×
10
5-1
×
107细胞/cm2。
68.本实施例制备的柱状跟腱修复材料在形态上与正常跟腱相仿，且具有高生物力学强度，可以满足跟腱修复后的力学保障，改善损伤修复效果；修复材料以柱状sis作为生物支架，肌腱干细胞作为种子细胞，具有很好的生物相容性以及很强的成腱分化能力。进行跟腱修复时，柱状的sis支架可以与跟腱断端相连，隔绝周围软组织与跟腱断端的粘连，同时将其负载的肌腱干细胞准确地附着在断端，为肌腱干细胞的增殖和迁移提供了良好的细胞微环境，具有很好的跟腱修复效果。
69.实施例2小肠粘膜下层脱细胞前后的比较
70.1、冰冻切片制作
71.取实施例1得到的脱细胞前后的sis进行比较，将脱细胞前后的sis裁剪大小约1cm
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1cm，放入包埋盒中，添加oct包埋剂至完全覆盖组织，放到冰切机里面至完全凝固，取出包埋块，置于小冻台上，放入样本头夹紧，微调样本头，修掉表面多余组织至目的位置开始
切片，设置厚度5-10μm，转动手柄切出组织，盖玻片贴起组织。
72.2、h&e染色
73.取脱细胞前后的sis冰冻玻片，苏木素染液10min，自来水冲洗10s，甩干玻片，滴加分化液数秒，出现红色立即用自来水终止，流水冲洗返蓝10min，甩干玻片。滴伊红染液1min，自来水冲洗10s，70％乙醇(10s)、80％乙醇(10s)、90％乙醇(30s)、无水乙醇i(1min)、无水乙醇ii(1min)、二甲苯i(1min)、二甲苯ii(1min)，中性树胶封片。显微镜下观察并采集图像，如图2所示，标尺200μm，图4a为sis脱细胞前图像，图4b为sis脱细胞后图像，结果表明实施例1中sis脱细胞效果好。
74.3、dapi染色
75.取5μm冰冻切片在4℃的冰丙酮中固定10min，pbs缓冲液洗3次，每次10min。在样本上滴加dapi工作液(1μg/ml)，避光，室温孵育20min。，pbs缓冲液洗3次，每次5-30min。滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片。荧光显微镜下观察并采集图像，如图5所示，标尺100μm，图5a为sis脱细胞前图像，图5b为sis脱细胞后图像，结果表明实施例1中sis脱细胞效果好。
76.4、扫描电镜
77.用5mm打孔器分别钻取脱细胞前后的sis若干，置入96孔板中，在2.5％戊二醛固定2小时，pbs缓冲液洗3次，每次10min。用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇依次脱水，每一级20min，纯叔丁醇洗三次，每次10min。-80℃冷冻1-4小时后进行冷冻干燥，喷金。扫描电镜观察并采集图像，如图6所示，标尺300μm，图6a为sis脱细胞前图像，图6b为sis脱细胞后图像，结果表明实施例1中sis脱细胞效果好。
78.实施例3sis支架的物理表征
79.本实施例测定sis支架的杨氏模量和应力水平。将1-4层规则叠放sis的sis片分别卷曲制成的4种sis支架，将跟腱和4种sis支架作为样本放到万能试验机试验台上进行测试。拉伸速率为0.1mm/min，当样本破裂时，停止测试，记录数值。得到了不同厚度sis支架的应力-应变曲线。从应力-应变曲线的线性部分计算峰值应力，得到最大应力水平。结果如图7所示，随着sis层数的增加，最大载荷逐渐增大，4层sis的sis片卷曲制成的sis支架的最大载荷与正常跟腱相仿。
80.实施例4肌腱干细胞鉴定
81.取实施例1得到的第三代肌腱干细胞进行鉴定，肌腱干细胞用pbs清洗后，胰酶(0.25％trypsin-edta gibco)消化，400g离心5-30min，重悬于500μl冰冷pbs中(含10％胎牛血清)，取1ugfitc、pe、af647、pe-cy7标记的抗大鼠抗体和同型对照igg，4℃孵育1小时。
82.使用流式细胞仪(beckman cytoflex)分析，每个样本计数约5
×
104，数据处理采用flowjo_v10.8.0。本实施例所用抗体为anti-cd29(bd,562153)、anti-cd44(bd,550974)、anti-cd90(bd,551401)、anti-cd34(santa cruz biotechology sc-7324)、anti-cd31(proteintech,fitc-65058)。结果如图8所示，超过90％以上的肌腱源性细胞间充质干细胞标记物cd44、cd29和成纤维母细胞标记物cd90阳性，造血干细胞标记物cd34和内皮细胞标记物cd31均为阴性，从而证实没有受到造血细胞和内皮细胞的污染。
83.实施例5评估柱状跟腱修复材料的体外生物活性
84.1、tdscs的增殖评估
85.将sis支架放入孔板中，每孔加入完全培养基100μl和5000个肌腱干细胞，在37℃下孵育2h，作为实验组；空白孔板中加入完全培养基100μl和5000个肌腱干细胞，在37℃下孵育2h，作为空白组；鼠尾胶原(sigma)放入孔板中，每孔加入完全培养基100μl和5000个肌腱干细胞，在37℃下孵育2h，作为对照组。
86.使用酶标仪测量450nm处的吸光度，检测1、2、3、4天后实验组、空白组和对照组的tdscs增殖状况。结果如图9所示，实验结果表明肌腱干细胞在sis支架上的增殖效果最好。
87.2、rna水平检测成肌腱分化相关基因
88.在14天时，提取上述实验组和空白组的rna，并反转录为cdna，通过qrt-pcr检测分化标志基因(scx、tnc、tnmd)在mrna水平的表达。结果如图10所示，实验结果表明肌腱干细胞在sis支架上具有很好的增殖效果和体外生物活性。
89.虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。