一种含人源胶原蛋白创口贴制备方法与流程

1.本发明涉及医药制备技术领域，具体地说涉及一种含人源胶原蛋白创口贴制备方法。


背景技术：

2.创可贴(woundplast)又名苯扎氯铵贴，俗称杀菌弹性创可贴，是人们生活中最常用的一种外科用药，具有止血、护创作用，因此俗称“止血膏药”。创可贴主要是由一条长形的胶布，中间附以一小块浸过药物的纱条组成。具有止血，护创作用。创可贴只能用于小块的创伤应急治疗，从而起到暂时的止血，保护创面的作用。如果过久地使用它，创可贴外层的胶布不透气，会使伤口和伤口周围的皮肤发白，变软导致细菌的继发感染，会使伤口更加恶化。
3.普通创可贴其主要优点是便利和保护伤口作用，适用于小的伤口和浅表划伤；如果在使用创可贴包扎前，先对伤口进行清理和消毒处理，效果会更好；由于其结构特点的限制，对于较深创伤、动物咬伤或金属如铁器划伤，是不能适用和有效作用的。
4.现有技术中，从不同的角度出发，或者根据不同的目的，提出了很多关于创可贴的技术方案和改进措施。
5.胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，广泛分布于动物结缔组织、韧带、跟腱等，约占生物体自身总蛋白含量的30％。同时，胶原蛋白是多细胞生物细胞外基质的主要组成，参与细胞的增生、信号传递、免疫、分化和迁移等行为，对全身组织和器官具有支持、保护和营养作用。机体内的胶原蛋白约有一半分布于皮肤，占真皮和筋腱干重的70％，相当于机体体重的6％。胶原蛋白由于具有低免疫原性、可生物降解性、止血作用和促进细胞黏附与生长等，广泛应用于食品、医药、美容保健和生物材料等行业。
6.公布号cn102526796a发明名称一种基于鼠尾胶原蛋白制备的可吸收止血材料及其制备方法的发明专利申请，公开了各个材料及其重量配比为鼠尾胶原蛋白∶聚乙烯醇∶壳聚糖为1-10％∶0.2-5％∶0.2-2％，余量为水，采用冷冻干燥工艺制备。本发明所制备的止血材料主要采用鼠尾胶原蛋白制备，较传统的止血材料不可吸收、容易引起机体过敏、止血效果差等缺点，该方案所制备的止血材料具有人体内可吸收，生物相容性好；止血效果快，具有很强的亲水性；同时可激活血小板的凝聚，一旦血小板凝聚，就可形成血栓，进而促使血浆结块阻止血流。同时，胶原表面的特定区域可以与细胞表面存在的类似纤连蛋白的糖蛋白结合，可以起到防止肠粘连的功效。该技术方案中，通过利用鼠尾胶原蛋白的特性，改进现有创可贴的治疗效果。
7.公布号cn101700243b发明名称一种具备治疗功能的新型载药创可贴的发明专利申请，该创可贴的吸水垫的加工工艺采用的是多种药物/高分子混合液逐层喷涂叠加的方法，公开发明产品药物选自：纳米银，银离子，硫酸庆大霉素，煅石膏/升药合剂中的一种或者多种；和选自：丝素蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、海藻酸中的一种或者多种的高分子物质混合而成；该技术方案由于药物被包含在吸水垫的内部，能起到缓释药物的功能，延
180mmol/lnacl溶液；洗脱液2配制方法为：以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制230-280mmol/lnacl溶液。
19.优选，所述步骤s1中，洗脱液1配制方法为：以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制140-160mmol/lnacl溶液；洗脱液2配制方法为：以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制245-255mmol/lnacl溶液。
20.更优选，所述步骤s1中，洗脱液1配制方法为：以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制150mmol/lnacl溶液；洗脱液2配制方法为：以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制250mmol/lnacl溶液。
21.在所述步骤s3中，所述胶原蛋白终溶度为3-8(g/升)，灭菌唑0.1-0.2(g/升)、苯扎溴铵0.1-0.2(g/升)、溴氯海因0.15-0.3(g/升)。优选，所述胶原蛋白终溶度为4.5-6(g/升)，灭菌唑0.12-0.18(g/升)、苯扎溴铵0.12-0.18(g/升)、溴氯海因0.18-0.22(g/升)。
22.更优选，所述胶原蛋白终溶度为5(g/升)，灭菌唑0.15(g/升)、苯扎溴铵0.15(g/升)、溴氯海因0.2(g/升)。
23.本发明技术方案的技术效果包括：重组人源胶原蛋白不仅具有一般胶原蛋白的生物学特性，如良好的生物相容性、可生物降解性、促进细胞的黏附生长、增殖与分化、良好的止血性能等。所以将人源胶原蛋白加入到创口贴中，可以起到快速止血，加速伤口愈合等功效。
24.为使本发明具体实施方式的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明的具体实施方式的实施实例，对本发明具体实施方式的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式是本发明的一部分具体实施方式，而不是全部的具体实施方式。基于所描述的本发明的具体实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所制备的所有其它具体实施方式，都属于本发明保护的范围。
附图说明
25.图1huvecs和nih-3t3细胞的mtt测试结果；
26.图2是huvecs细胞的增殖情况；
27.图3是nih-3t3细胞的生长状况趋势图；
28.图4是huvecs细胞划痕实验结果。
具体实施方案
29.以下通过具体的实施例，进一步说明本发明的技术方案。在以下具体实施例中，所述原料除特别说明，皆是市售商品，采购于相关生产企业或商业部门。
30.实施例1、重组人源胶原蛋白的制备
31.将本研究人员筛选得到的表达重组人源胶原蛋白的菌株按已优化的发酵条件进行发酵，对该菌株正常发酵结束的发酵上清液进行离心过滤处理，使用饱和度为30％的硫酸铵盐析沉淀重组人源胶原蛋白，沉淀物用超纯水复溶后，用20mmol/lpb(ph6.0)缓冲液进行超滤和洗涤，最后洗脱并转换介质，将超滤后的洗脱液上样于已用20mmol/lpb(ph6.0)缓冲液平衡处理的阳离子交换柱sphp上，以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制150mmol/lnacl溶液洗脱杂蛋白及降解的重组人源胶原蛋白，以20mmol/lpb(ph6.0)溶液配制250mmol/lnacl溶
液洗脱重组人源胶原蛋白。洗脱液经超滤系统脱盐并洗脱获得浓缩液，浓缩液再经结晶、真空冷冻干燥可制备得到重组人源胶原蛋白成品粉末。将成品粉末按方法部分中已确定的配比配制成胶原蛋白溶液。
32.实施例2、人源胶原蛋白创口贴生物相容性实验
33.一、本发明的生物相容性实验，具体采用的试验方法包括
34.(1)huvec/nih-3t3细胞培养
35.细胞复苏：1)从-80℃超低温冰箱中取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴锅中解冻，并随时晃动管子，随时观察冻存管内解冻情况，尽可能在1min内完全融化；
36.2)待冻存管内溶液完全溶解后，用酒精擦拭冻存管外壁，放入超净台内；
37.3)将冻存管中的细胞溶液转移至离心管中，加3ml含2％fbs的完全培养基，1000rpm，离心5min；
38.4)将离心好的离心管消毒后放入超净台，弃净上清，加3ml含2％fbs的完全培养基，吹打混匀制成细胞悬液后将其移至细胞培养瓶中；
39.5)标记细胞名称、姓名和日期，酒精消毒后，放入37℃、5％co2的培养箱内培养。
40.细胞传代：1)当细胞在培养瓶底生长至汇合度达90％左右时，弃去原培养液，pbs缓冲液洗涤细胞2次，吸净余液；
41.2)吸取1ml0.25％胰蛋白酶至细胞培养瓶，使其均匀覆盖细胞面，37℃消化2min左右；
42.3)用手轻拍细胞培养瓶底，待细胞形态变圆时，加入1ml含2％fbs的完全培养基，终止消化；
43.4)轻轻吹打瓶底面使细胞脱落，制成细胞悬液，转移至离心管中，1000rpm，离心5min；
44.5)弃去上清液，根据细胞浓度加入适量含2％fbs的完全培养基，吹打混匀制成细胞悬液，将细胞由1瓶传至2瓶或3瓶进行传代，37℃，5％co2培养箱内培养。
45.细胞冻存：1)将细胞生长状态良好，且生长汇合度达80％的细胞进行冻存，弃去培养瓶中原培养液，pbs缓冲液洗涤细胞2次，尽量吸干余液；
46.2)向培养瓶中加入1ml0.25％胰蛋白酶，37℃消化2min左右；
47.3)轻拍细胞培养瓶底，待细胞形态变圆时，加入1ml含2％fbs的完全培养基，终止消化；
48.4)轻轻地吹打瓶底面使细胞脱落，制成细胞悬液，转移至离心管中，1000rpm，离心5min；
49.5)弃去上清液，根据细胞浓度加入适量的细胞冻存液，吹打混匀，转移到冻存
50.管中，标记细胞的名字，冻存人姓名，冻存时间；
51.6)将冻存管放入梯度降温冻存盒中，并置于-80℃冰箱长期保存。
52.(2)mtt检测止血棉浸泡液对细胞黏附的影响
53.将复苏后并传代培养3～4次的状态良好的huvecs/nih-3t3细胞用移液器除去培养基，并用无菌pbs溶液洗涤两次，加入1ml胰酶溶液，注意消化液要完全覆盖细胞表面，37℃消化1-3min，消化结束后，小心除净胰酶溶液，加入2ml新鲜细胞培养液，轻微敲打培养瓶的侧壁，尽量使附着的细胞脱落下来，将瓶壁上细胞吹打入细胞悬液中，后补加1ml细胞培
养基。通过细胞计数板计算细胞的密度，使用完全培养基溶液调整至合适的细胞浓度。将调整好浓度的细胞悬液加入到无菌96孔板内，每孔100ul，实验组补加100％止血棉浸泡液100ul，对照组补加普通培养基100ul，置于37℃的co2浓度为5％的培养箱内培养8h，待细胞黏附完全后，除去培养基，并用无菌pbs溶液将未黏附的细胞清洗掉，随后补加200ul的普通细胞培养液。然后向细胞培养液内加入20ulmtt溶液，co2培养箱内继续培养5h，小心吸去孔内培养液，每孔加入150uldmso，酶标仪内震荡30s，在570nm处测量吸光度值。
54.(3)mtt检测止血棉浸泡液对细胞增殖的影响
55.参照上述细胞铺板的方法，将细胞移植于96孔培养板内的各个孔中，置于37℃的含有co2浓度为5％的培养箱内培养8h，待细胞完全黏附，去除培养基，使用pbs溶液洗涤两次，实验组加入50％浓度的止血棉浸泡液，对照组加入普通细胞培养液，将其置于37℃的含有co2浓度为5％的培养箱内，分别培养1d，3d，5d，7d后，使用mtt法检测细胞的增殖情况。
56.(4)细胞划痕实验检测止血棉对细胞修复能力的影响
57.取处于对数增殖期的huvecs，用pbs溶液轻轻洗涤细胞2-3遍，加入适量胰蛋白酶，于37℃消化1-3min，用移液枪吸取除去胰蛋白酶。再加入dmem完全培养基，重新悬浮细胞，用移液枪轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，并调整细胞密度为1
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105个/ml。取一个6孔板，在培养板背面每孔画两条平行线，为实验结果的观察做好标记。用移液枪吸取上述准备好的细胞悬液，加入到已做好标记线的6孔板中，2ml/孔，放入37℃、5％co2条件下培养，待细胞完全贴壁后，用无菌枪头垂直标记线轻轻画出一条划痕，再用无菌pbs轻轻冲洗洗去被划掉的细胞，分别加入含50％止血棉浸泡液的培养基、5％牛骨胶原蛋白溶液的培养基(从北京万佳购买的牛骨胶原蛋白)、普通培养基，放入37℃培养箱中培养，分别在培养0h、24h、36h和48h四个时间点时，从培养箱中取出6孔板，于倒置显微镜下进行观察、拍照，比较不同时间点细胞的迁移距离。
58.二、本发明的生物相容性实验的结果与讨论
59.1黏附实验
60.mtt法又称四唑盐比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
61.细胞黏附是生物体与生物材料相互作用的第一阶段，对随后细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等阶段都非常关键。黏附分为非特异性黏附与特异性黏附。
62.含重组人源胶原蛋白海绵浸泡液对细胞黏附的影响可以通过mtt法进行测试。图1为huvecs和nih-3t3细胞的mtt测试结果，从图中可以看出：在考察细胞黏附作用的8h内，50％止血棉浸泡液组(实验组)和普通培养基组(对照组)作用的细胞均可进行黏附，并且对照组和实验组细胞的吸光度值极其相近，说明海绵浸提液对考察的细胞的黏附不产生影响，表现出较好的相容性。
63.2增殖实验
64.mtt比色法是可以用于检测细胞存活和生长状况的一种简便方法，运用这一方法
可以测定止血棉浸泡液对huvecs细胞和nih-3t3细胞增殖的影响。huvecs细胞和nih-3t3细胞的种植密度均为4
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105/cm2。通过考察细胞在含重组人源胶原蛋白止血棉浸泡液内培养ld、、3d、5d和7d的生长状况来研究细胞的增殖情况，并与对照组(空白培养基)进行对比，如图2(huvecs细胞)和图3(nih-3t3细胞)。通过两种细胞的培养实验，几乎可以得到相同的结论：50％浸泡液培养细胞的实验组和普通培养基培养的细胞增殖趋势相同，第1～3d细胞增殖比较缓慢，第3d～7d细胞增殖速率的幅度明显增大。图2为huvecs细胞的增殖情况，可以发现，第1～3d是huvecs细胞对浸提液的适应阶段，此时实验组测试出细胞的吸光度值比对照组的偏低，第3d后实验组细胞开始进入快速生长期，达到第7d时实验组的细胞浓度超过了对照组。产生以上结果原因可能是由于huvecs细胞的生长速率较快，对照组细胞接种至第5d后，细胞已经长满整个培养皿底部，此时部分细胞开始出现凋亡现象，因此，培养至第7d时细胞的浓度略微下降；但是，50％浓度的止血棉浸泡液培养的huvecs细胞的实验组，由于存在着前期的适应阶段，生长周期较长，所以培养至第7d时细胞仍能进行增殖生长，未发生凋亡现象。所以，能够在第7d的时候实验组细胞的数量多于对照组。图3为nih-3t3细胞的生长状况趋势图，可以看出，nih-3t3细胞对50％浓度的止血棉浸泡液不存在适应阶段，考察细胞增殖的7d作用时间内，对照组和实验组的吸光度极其相近。总之，由huvecs细胞和nih-3t3细胞在50％浓度止血棉浸泡液培养内的增殖情况得出：含重组人源胶原蛋白的止血棉浸泡液对细胞的增殖不会产生较大影响，细胞毒性低，具有良好的生物相容性。图2给出了huvecs细胞的增殖情况和测试结果。图3给出了nih-3t3细胞的增殖情况和测试数据。
65.3细胞划痕实验
66.细胞划痕实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，非常适合研究细胞与胞外基质(ecm)，细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移，是研究细胞迁移的体外实验中最直接的方法。图4为huvecs细胞的划痕实验结果，从图中可以看出：在huvecs细胞培养24h后，止血棉浸泡液组和牛骨胶原蛋白溶液组均表现出比正常对照组更快的愈合速度，且在细胞培养36h后，止血棉浸泡液组和牛骨胶原蛋白溶液组均表现出比正常对照组更加显著的愈合速度，且在细胞培养48h后，止血棉浸泡液组和牛骨胶原蛋白溶液组均完全愈合。图4的实验结果表明5％牛骨胶原蛋白溶液、止血棉浸泡液具有促进细胞迁移的功能，从而表现出促进伤口愈合的效果，且止血棉浸泡液的效果比牛骨胶原蛋白溶液效果更佳。
67.以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。