多糖蛋白缀合物的制作方法

本发明属于疫苗领域，具体涉及荚膜多糖蛋白缀合物及其应用。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是一种具有荚膜包被的革兰氏阴性菌(g-)。根据荚膜多糖结构的不同，肺炎克雷伯氏菌可以分成至少77个血清型，荚膜多糖也被称为k抗原或k型。肺炎克雷伯菌主要定植于消化道、呼吸道，当机体抵抗力降低时可引起肺部感染、泌尿道感染、甚至血流感染，也是导致院内呼吸道感染最常见的细菌之一。荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，是治疗或预防肺炎克雷伯菌感染的重要保护性抗原。

2、肺炎克雷伯菌引发的感染目前已成为全球严重的公共卫生问题之一。据统计，肺炎克雷伯菌感染的病死率极高，肺炎克雷伯菌引起的血流感染的病死率为20％至30％，而肺炎克雷伯菌血症合并肺炎的病死率可达50％以上。肺炎克雷伯菌的治疗主要依靠抗生素，但近年来由于各种抗菌药物的广泛使用，产超广谱β-内酰胺酶以及碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌对几乎所有可用的β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)药物都具有抗性。在过去10年中，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯氏菌(crkp)比率在世界范围内急剧增加。因此，开发一种新型治疗或预防药物或生物制品，对耐药性肺炎克雷伯菌的防控及临床应用具有重要的意义。

3、肺炎克雷伯菌的荚膜多糖是胸腺非依赖性抗原，免疫原性低，没有免疫记忆和免疫加强作用，特别是对于免疫力弱的人群免疫效果更低，因而不能起到免疫保护作用。由于肺炎克雷伯菌荚膜多糖分子量大、结构复杂不均一以及多糖-蛋白化学偶联反应的复杂性，载体蛋白的选择、多糖-蛋白的偶联方法将直接影响结合物的免疫效果及其保护作用。本领域仍需提高肺炎克雷伯菌荚膜多糖免疫原性和保护力的新方法。

技术实现思路

1、为了解决肺炎克雷伯菌荚膜多糖免疫原性低和保护力差问题，以及肺炎克雷伯菌荚膜多糖与载体蛋白难结合及免疫原性低问题，本发明提供了一种保护哺乳动物不受肺炎克雷伯菌感染的免疫原性组合物。

2、本发明第一方面提供一种免疫原性组合物，含有式(i)和/或式(ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖和载剂：

3、[→4)-α-d-glca-(1→3)-α-d-manp-(1→3)-β-d-glcp-(1→4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1→2)]-[α-l-rhap-(1→3)]-α-d-manp-(1→]m

4、(i)，

5、[→3)-β-d-galp-(1→4)-[β-l-rhap-(1→4)-β-d-glca-(1→3)]-α-l-rhap-(1→]n

6、(ii)。

7、在一个或多个实施方案中，所述多糖的平均分子量为50-800kd，优选 100-700kd，更优选150-650kd。

8、在一个或多个实施方案中，m为50-800的数字，优选100-700，更优选 150-650；n为80-1200的数字，优选160-1100，更优选250-1000。

9、在一个或多个实施方案中，所述载剂选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。

10、在一个或多个实施方案中，所述免疫原性组合物还含有佐剂。

11、在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、cpg、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。

12、本发明还提供一种具有免疫原性的多糖蛋白缀合物，含有式(i)和/或式 (ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖以及与其缀合的载体蛋白，

13、[→4)-α-d-glca-(1→3)-α-d-manp-(1→3)-β-d-glcp-(1→4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1→2)]-[α-l-rhap-(1→3)]-α-d-manp-(1→]m

14、(i)，

15、[→3)-β-d-galp-(1→4)-[β-l-rhap-(1→4)-β-d-glca-(1→3)]-α-l-rhap-(1→]n

16、(ii)。

17、在一个或多个实施方案中，所述多糖的平均分子量为50-800kd，优选 100-700kd，更优选150-650kd。

18、在一个或多个实施方案中，m为50-800的数字，优选100-700，更优选 150-650；n为80-1200的数字，优选160-1100，更优选250-1000。

19、在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白选自crm197、tent、或tthc。

20、在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白具有seq id no:1-3中任一项所述序列，或与其具有至少70％、至少80％、至少90％序列相同性的变体。

21、在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白与多糖共价连接。

22、在一个或多个实施方案中，所述多糖与载体蛋白的重量比为0.2-3.0，例如 0.5-2.0。

23、本发明还提供制备本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物的方法，包括步骤：

24、(1)获得分子量为50-800kd的克雷伯荚膜多糖，

25、(2)通过氧化使所述多糖活化，

26、(3)将活化的多糖与载体蛋白在氰基硼氢化钠存在的条件下孵育，获得多糖蛋白缀合物。

27、在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：使用冰醋酸或盐酸或高压匀质处理克雷伯荚膜多糖使其分子量降低至约50-800kd范围内。

28、在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：使用高碘酸钠处理步骤(1) 获得的多糖，并分离活化的多糖，例如通过超滤。优选地，高碘酸钠与所述多糖的当量比为0.1-10、优选0.1-5、更优选为0.1-2。

29、在一个或多个实施方案中，步骤(3)中活化的多糖与载体蛋白的重量比为0.5-2.0。优选地，步骤(3)还包括分离多糖蛋白缀合物的过程，例如超滤或层析。在一个或多个实施方案中，氰基硼氢化钠的浓度为10-200mm，优选 50-150mm，更优选约100mm。在一个或多个实施方案中，多糖与载体蛋白孵育至少2小时，优选至少12小时，更优选16-48小时。

30、本发明还提供一种免疫原性组合物，其包含本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物以及佐剂。

31、在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。

32、在一个或多个实施方案中，所述免疫原性组合物还含有载剂。所述载剂优选选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。

33、本发明还提供一种导致被动免疫的免疫组合物，包括来自肺炎克雷伯菌的杀菌抗体，所述抗体是由本文任一实施方案所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物而获得。在一个或多个实施方案中，所述杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。

34、本发明还提供一种疫苗，其含有本文任一实施方案所述的免疫原性组合物和药学上可接受的辅料。

35、本发明还提供本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物在制备用于提供对抗肺炎克雷伯菌感染的保护的药物中的用途。

36、本发明还提供一种免疫哺乳动物对抗肺炎克雷伯菌感染的方法，该方法包括给予个体致免疫量的本文任一实施方案所述的免疫原性组合物或多糖蛋白缀合物。在一个或多个实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大兔或人。

37、本发明优点：

38、(1)提供一种免疫途径解决肺炎克雷伯菌感染及多重耐药性问题

39、(2)提供一种免疫原可诱导特异性抗肺炎克雷伯菌表面多糖抗体，从而起到预防或治疗作用，

40、(3)提供一种免疫缀合物，其中使用的载体蛋白可以有效地提高克雷伯荚膜多糖的免疫原性，诱导针对肺炎克雷伯菌荚膜多糖特异性抗体

41、(4)提供一种方法可以将肺炎克雷伯菌荚膜多糖有效地偶联到载体蛋白上，从而使得偶联物具有良好的免疫原性，可诱导良好特异性抗体。

42、(5)本发明提供一种方法将肺炎克雷伯菌荚膜多糖分子量控制在 50kd～800kd之间，制备得到的多糖蛋白缀合物，其免疫原性较高、保护力好。

43、(6)本发明制备的肺炎克雷伯菌荚膜多糖缀合物可预防相应的肺炎克雷伯菌的感染。

44、(7)本发明肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物制备的免疫抗血清或特异性多糖抗体，可以治疗肺炎克雷伯菌的感染。