一种共载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法及应用

1.本发明属于抗肿瘤技术领域，具体涉及一种共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法及应用。


背景技术：

2.癌症严重威胁人类的生命健康，癌症已是全球第二大导致人体死亡的疾病。虽然化疗是临床上治疗癌症最有效的方法之一，但是化疗药物常在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了人体正常细胞。因此，化疗可能产生较强毒副作用进而导致不良反应。为了应对以上的问题，脂质体、聚合物胶束、脂基纳米载体、无机纳米载体等纳米药物递送系统已被开发利用。此外，蛋白质纳米颗粒因具有生物相容性好等特点，使它们成为十分有潜力的药物递送系统。
3.人重链铁蛋白(hftn)是一种外径为12nm，内径为8nm的球型笼状蛋白纳米材料。铁蛋白作为纳米载体具有低的免疫原性、可生物降解性、特异性靶向tfr1等特点。因此，铁蛋白在癌症治疗领域中发挥着重要作用。由于铁蛋白负载单一药物的抗肿瘤效果不理想，且会遇到耐药性等诸多问题。因此为了提高抗肿瘤效果和减轻药物的毒副作用，利用铁蛋白内腔同时负载两种药物，利用两种药物具有协同作用以增强抗肿瘤的效果，是一种很有前途的策略。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.为了提高治疗效果和减少耐药性的产生，临床上大多数癌症的治疗都联合使用不同机制的抗癌药物。本发明提供了一种共负载两种药物的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，此铁蛋白纳米粒通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(tfr1)的靶向性有效地递送两种药物，相比递送单一药物，本方法可进一步增强抗肿瘤疗效和减少耐药性的产生，具有很好的应用前景。
6.发明人曾尝试多种方法负载实验所需药物，其中铁蛋白装载药物的方法主要有三种：ph法、温度法和尿素法。温度法与ph法相比可以极大的减少铁蛋白的损耗并提高装载量，ph法只有极少数的药物被装载；与低浓度的尿素处理相比，温度法不仅能同时装载两种药物还可以进一步的增强负载的药物数量，因ph法只有极少数药物被装载，且蛋白损耗过大而不适合进一步的开展研究，而低浓度尿素法只能装载一种药物而不能同时装载阿霉素-熊果酸两种药物。所以本发明主要提供一种温度法制备共载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法及应用。
7.因此，本发明的目的在于提供一种共载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法及应用，在一定的溶液条件下，通过温度法负载亲/疏水两种药物。
8.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法，包括，
9.铁蛋白纳米粒共同负载亲水性和疏水性两种药物。
10.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，还包括，
11.将药物分别加入到铁蛋白溶液中，孵育后离心，分离上清液，在pbs中透析；离心过滤，得到共负载药物纳米粒。
12.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述药物为亲水性阿霉素和疏水性熊果酸两种药物。
13.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述阿霉素为阿霉素的pbs溶液；所述熊果酸为熊果酸的乙醇溶液。
14.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述铁蛋白溶液为人重链铁蛋白的tris-hcl溶液，浓度20mm，ph＝8.0。
15.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述共负载药物纳米粒中阿霉素与铁蛋白的摩尔比为50～300：1，熊果酸与铁蛋白的摩尔比为450：1。
16.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述孵育为恒温水浴锅中60℃保持4-5小时。
17.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述孵育后离心，离心转速12000rpm，离心时间10～15min。作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述在pbs中透析，透析时间为24～48h，透析温度为4℃且每6小时换一次pbs；所述离心过滤，离心条件5000
×
g，离心时间5～10min。
18.作为本发明所述共负载阿霉素和熊果酸的铁蛋白纳米粒的制备方法制备所得的共负载药物纳米粒在递送抗肿瘤药物上的应用。
19.本发明的有益效果：
20.本发明提供了一种共负载两种药物的铁蛋白载药纳米粒的制备方法及应用，此纳米粒通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(tfr1)的靶向性有效地递送两种药物，相比递送单一药物，本方法可进一步增强抗肿瘤疗效和减少耐药性的产生，并且本发明通过铁蛋白将两种药物共同装载，步骤简单，不改变铁蛋白的原有结构，与ph法相比可以极大的减少铁蛋白的损耗并提高装载量；与低浓度的尿素处理相比，不仅能同时装载两种药物还可以进一步的增强负载的药物数量，具有很好的应用前景。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
22.图1为实施例1和例2中阿霉素(dox)和熊果酸(ua)药物被铁蛋白负载示意图；其
中，(a)添加低浓度尿素促使蛋白壳上的通道扩大，药物进入蛋白内腔，透析除去尿素和游离药物，孔道收缩将药物固定在腔内；(b)将dox和ua加入蛋白溶液中，60℃孵育4小时，蛋白通道扩大，药物进入内腔，透析去除游离药物。
23.图2为实施例1中负载药物铁蛋白和铁蛋白纳米粒子的表征；其中，(a)重组蛋白在大肠杆菌中表达，经镍柱和sec纯化得到所期望的凝胶条带表明成功的纯化出所需的蛋白；(b)低浓度尿素处理和热处理制备的样品；(c)hftn、hftn-dox/ua、hftn-dox和hftn-ua四种纳米粒子的圆二色谱图，从图上可知制备的纳米粒子均在208nm和222nm附近出现明显特征吸收峰。证明dox和ua药物封装在铁蛋白内腔中并没有影响铁蛋白的二级结构，依旧为α-螺旋；(d)四种纳米粒子的sec聚合态分析，可以得出所制备的纳米粒子仍然为24聚体，证明药物封装在蛋白笼内，热处理没有影响蛋白载体的聚合状态；(e)药物封装前后的透射电镜图像，四种纳米粒子仍然为粒径均一的笼状结构，表明dox和ua药物的装载并没有影响笼状结构的稳定性；(f)纳米粒子的dls表征，从图中可知，负载一种药物的铁蛋白纳米粒水动力直径略高于铁蛋白，负载两种药物的铁蛋白水动力直径略高于负载一种药物的铁蛋白纳米粒。
24.图3为实施例3中的药物释放，其中，(a)hftn-dox和hftn-ua的药物释放，(b)hftn-dox/ua的药物释放；
25.图4为实施例4和例5中细胞毒性实验和药物协同作用分析；其中，(a)游离药物与mcf-7细胞共同孵育24h后体外细胞活力；(b)负载药物的纳米粒与mcf-7细胞共同孵育24h后体外细胞活力；(c)在mcf-7细胞中阿霉素和熊果酸药物协同作用的药物联合指数(ci)；
26.图5为实施例6中激光共聚焦、流式细胞仪检测mcf-7细胞对fitc标记的铁蛋白摄取情况；其中，(a)mcf-7细胞与游离fitc和fitc-hftn孵育4h的荧光图像，白线代表尺寸为20μm；(b)通过流式细胞仪测量mcf-7细胞对游离fitc、fitc-hftn的摄取；(c)根据图b分析的平均荧光强度(n＝3)。
具体实施方式
27.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
28.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
29.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
30.为了提高治疗效果和减少耐药性的产生，临床上大多数癌症的治疗都联合使用不同机制的抗癌药物。本发明提供了一种共负载两种药物的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，此铁蛋白纳米粒通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(tfr1)的靶向性有效地递送两种药物，相比递送单一药物，本方法可进一步增强抗肿瘤疗效和减少耐药性的产生，具有很好的应用前景。
31.本发明实施例中所用化学试剂，若无特殊说明，均为普通市售分析纯。
32.本发明实施例所使用阿霉素和熊果酸购于：阿霉素(≥97％)采购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊果酸(≥94％)采购自萨恩化学技术(上海)有限公司；人体重链铁蛋白(hftn)购于南京思普金生物科技有限公司；mcf-7细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库获得。
33.实施例1：
34.温度法共负载阿霉素和熊果酸药物的铁蛋白纳米粒的制备：
35.将阿霉素药物用pbs溶液溶解，熊果酸药物用乙醇溶液溶解。
36.将阿霉素和熊果酸药物加入到4ml的铁蛋白溶液中，其中蛋白溶液存在于tris-hcl(20mm，ph＝8.0)中。铁蛋白与阿霉素和熊果酸的投入摩尔比分别为1：150、1：450，在60℃孵育4h后，12000rpm离心10min，分离上清液，在pbs中透析36h。透析结束后，在5000
×
g条件下离心5min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为负载了阿霉素和熊果酸药物的铁蛋白载药纳米粒(单独负载阿霉素和熊果酸药物的方法与共负载相同)。制备方法如图1所示，表征结果如图2所示。
37.经检测，每个铁蛋白纳米粒可以单独负载熊果酸药物100个，单独负载阿霉素药物90个，本发明提供的共同负载阿霉素-熊果酸药物的铁蛋白纳米粒包含熊果酸药物90个，阿霉素药物18个，高于单独负载其中一种药物。
38.实施例2：
39.1、低浓度尿素处理制备载药纳米粒过程：
40.将熊果酸药物用乙醇溶液溶解；
41.将铁蛋白溶液存在于gfc(50mm na2hpo4，150mm nacl，ph 7.0)溶液中，加入尿素其最终浓度为50mm。将混合物在4℃下孵育2h后，加入用乙醇溶解的熊果酸药物在4℃下缓慢搅拌40min，铁蛋白与熊果酸摩尔比为1：450，然后在pbs溶液中透析24h；透析结束后，将以上步骤透析袋中的蛋白液体进行离心(5000
×
g，5min)、过滤，得到我们所需的负载药物的纳米粒，制备方法如图1；
42.使用以上低浓度尿素处理过程制备共载阿霉素和熊果酸两种药物的蛋白纳米粒，经过检测发现仅有熊果酸药物，而阿霉素药却检测不到，说明只有熊果酸药物被负载。低浓度尿素处理，每个铁蛋白纳米粒负载65个熊果酸药物。
43.2、ph法处理制备载药纳米粒过程：
44.将铁蛋白溶液存在于gfc(50mm na2hpo4，150mm nacl，ph 7.0)溶液中，向其中滴加1m的hcl，调节溶液的ph在2-3之间，接着加入pbs溶解的阿霉素药物和乙醇溶解的熊果酸药物在层析柜4℃条件下缓慢搅拌40min，然后滴加1m的naoh将溶液ph重新调节到7左右，最后在pbs溶液中透析24h；透析结束后，将以上步骤透析袋中的蛋白液体进行离心(5000
×
g，5min)、过滤，得到我们所需的负载药物的纳米粒。经检测ph法两种药物装载量都仅为个位数。
45.实施例3：
46.共负载阿霉素和熊果酸两种药物的铁蛋白纳米粒体外药物释放研究：
47.将温度法制备的1ml的铁蛋白-阿霉素/熊果酸溶液置于透析袋(mwco 6-8kda)中，分别放置在ph＝5.0和ph＝7.4的pbs缓冲液中，在37℃下以100rpm的搅拌速度透析60h。在设定时间点(0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48和60h)，取出300μl透析液，并用等体积的pbs替
换。用荧光法检测dox释放量，高效液相色谱法测定ua释放量，释放结果如图3所示。从图中可以看出三种纳米粒子在ph 7.4下均保持相对较低的释放；在ph 5.0时三种纳米粒子的释放率均达到了较高水平，说明纳米粒子在此ph下是不稳定的，dox和ua可在溶酶体中持续释放，因此hftn可以作为有效的药物递送载体。
48.实施例4：
49.共负载阿霉素和熊果酸药物的铁蛋白纳米粒的体外细胞毒性研究：
50.为研究共负载阿霉素和熊果酸两种药物的铁蛋白纳米粒的体外细胞毒性，将mcf-7细胞以每孔5000个细胞的密度种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，将阿霉素和熊果酸含量分别为0.01-10μm/ml和0.05-50μm/ml的dox、ua、hftn-dox、hftn-ua、hftn-dox/ua加入相同的孔中培养24h，pbs清洗两遍后再在培养基中加入mtt孵育4h后离心，小心除去上清后加入二甲基亚砜(dmso)，在490nm处测紫外吸收，mcf-7细胞在不同浓度的阿霉素和熊果酸药物以及载药纳米粒作用下的存活率如图4所示，表明共负载阿霉素和熊果酸药物的铁蛋白纳米粒表现出更强的细胞毒性，说明由铁蛋白递送两种药物能够达到更好的治疗效果。
51.实施例5：
52.阿霉素和熊果酸药物协同作用研究：
53.为了证明铁蛋白负载dox和ua的协同作用，可以根据药物联合指数(ci)来直观表达。ci值由以下等式计算：
54.ci
x
＝da/dxa+db/dxb55.其中da和db是药物a和药物b的浓度，它们共同发挥作用以达到特定的药物效果。dxa和dxb是达到相同效果的单个药物对应物的浓度。ci值大于、等于和小于1分别反映了拮抗作用、相加作用和协同作用。药物相互作用的程度可以通过绘制ci值与抑制率(fa值)的关系图来获得。从图4我们可以看出所有数据点的ci值均小于1，说明dox和ua两种药物之间有很强的相互作用；根据拟合曲线可以看出随着药物浓度增加，fa值增加且ci值下降趋于平稳，说明抑制率增大时，药物协同作用更强但是有一定的限制不能无限增强。
56.实施例6：
57.共负载阿霉素和熊果酸两种药物的铁蛋白纳米粒体外细胞摄取研究：
58.为研究细胞对共负载阿霉素和熊果酸两种药物的铁蛋白的摄取情况，将mcf-7细胞以每孔3
×
104接种于放置了玻璃爬片的24孔板中，培养24h后，加入20μg/ml fitc标记的hftn纳米颗粒，孵育4h后用pbs清洗3遍细胞，并用4％多聚甲醛室温下固定30min；再用pbs清洗两遍，然后加入dapi进行细胞核染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，结果如图5所示，fitc标记的铁蛋白组呈现强烈的荧光，说明铁蛋白能被细胞摄取具有靶向性。
59.通过实施例1的温度法制备得到铁蛋白载药纳米粒，可以共同负载阿霉素-熊果酸两种药物。与实施例2中ph法相比，本发明温度法可以极大的减少铁蛋白的损耗并提高装载量，ph法只有极少数的两种药物被装载，基本上蛋白都积聚沉淀，无法开展后续实验；与低浓度的尿素处理相比，我方发明不仅能同时装载两种药物还可以进一步的增强负载的药物数量。总而言之本发明所提供的温度法：
①
可以装载两种药物；
②
降低蛋白的损耗；
③
进一步的增强负载的药物数量。
60.本发明提供了一种共负载两种药物的铁蛋白载药纳米粒的制备方法及应用，此纳米粒通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(tfr1)的靶向性有效地递送两种药物，相比递送单一
药物，本方法可进一步增强抗肿瘤疗效和减少耐药性的产生，且本发明通过铁蛋白将两种药物共同装载，步骤简单，保留铁蛋白的原有结构完整，具有很好的应用前景。
61.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。