1.本发明属于生物医药领域，涉及肠道病毒71型嗜神经性病毒的一种新型抑制剂。具体而言，本发明涉及阿昔替尼在制备抑制病毒药物中的应用。
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：：2.肠道病毒71型(enterovirusa71，ev-a71)为嗜神经性病毒，属于小rna病毒科肠道病毒属，是引起手足口病、咽峡炎、疱疹的主要病原体之一。手足口病是全球性疾病，在我国各地全年均有发生，发病率为每10万人37.01-205.06例，病死率为每10万人6.46-51.00例；在手足口病的实验室病原学诊断结果中，ev-a71阳性比例占44％，重症病例中ev-a71阳性占74％，死亡病例中占93％；ev-a71感染导致的手足口病常见于婴幼儿，是如今造成中国儿童死亡的重要原因。预防ev-a71感染最有效的方法是对适龄儿童接种ev-a71疫苗；尽管目前已有疫苗上市，但尚缺乏有效的免疫持久性研究数据，其免疫效力和持续时间仍有待于进一步验证。3.目前，临床上尚缺乏特效的抗ev-a71感染药物，抗ev-a71药物的研究多处于基础实验阶段，高效抗病毒药物的缺乏仍是一个亟待解决的问题。由于新药开发耗时长、费用高、风险大，从已上市药品中筛选具有抗ev-a71病毒活性的药物，将节约药物筛选过程中有关药物代谢、药物安全和毒理等方面的研究费用，降低药物研发的风险，为ev-a71感染疾病的对症治疗和新药开发提供新的思路和途径。4.阿昔替尼(axitinib)是多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，抑制vegfr1，vegfr2，vegfr3，pdgfrβ的ic50值分别为4、20、4、2nm。已获批用于细胞因子或舒尼替尼治疗转移性肾细胞癌失败后的二线治疗。阿西替尼推荐的口服剂量为5mg/次，每日两次，阿昔替尼可与食物同服或空腹服用，每日两次给药的时间间隔约为12小时，应当用一杯水送服。技术实现要素：5.本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗ev-a71病毒活性的药物。6.一方面，本发明提供了一种阿昔替尼在制备抑制病毒药物中的应用，所述的病毒是肠道病毒71型嗜神经性病毒ev-a71。7.较好的，所述的药物是抑制ev-a71病毒活性的药物。8.进一步的，所述的药物是降低ev-a71病毒活力、病毒载量或者vp1蛋白表达量的药物。9.本发明所述的阿昔替尼是pfizer公司开发的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可以抑制血管内皮细胞生长因子受体vegfr1、vegfr2、vegfr3、血小板衍生生长因子受体和c-kit。阿昔替尼为抗肿瘤药，临床上主要用于既往接受过一种酪氨酸激酶抑制剂或细胞因子治疗失败的进展期肾细胞癌(rcc)的成人患者。美国fda批准阿西替尼用于治疗晚期肾癌，治疗对其它药物没有应答的晚期肾癌(肾细胞癌)。inlyta由辉瑞公司生产并销售，为口服药丸，日服两次。肾细胞癌是一类始发于肾小管内皮细胞的肿瘤，阿西替尼可阻止对肿瘤生长和转移起作用的某些被称为激酶的蛋白发挥作用。10.阿昔替尼为白色粉末，熔点218.4℃，略溶于聚乙二醇400，微溶于甲醇或乙醇，极微溶于乙腈，几乎不溶于水。在20℃ph1.2盐酸溶液中溶解度为0.8mg/ml，ph6.8磷酸盐缓冲溶液中溶解度为0.2微克/ml，为典型的ph依赖型药物，其结构式如下：[0011][0012]阿昔替尼目前批准上市的适应症是晚期肾癌的二线治疗，也就是说晚期肾癌在索坦治疗失败后，可以选择阿昔替尼治疗。除了肾癌，这个药还被尝试用于肝癌、肉瘤、神经内分泌肿瘤等公认的对抗血管生成药物比较敏感的、肿瘤血供丰富的实体瘤中，也有一定的疗效。[0013]另一方面，本发明提供了一种阿昔替尼抑制体外细胞中ev-a71病毒的方法，所述的方法包括以下步骤：[0014]获得含有ev-a71病毒的体外培养细胞；和/或[0015]在含有ev-a71病毒的体外培养细胞的培养环境中添加阿昔替尼，并孵育。[0016]较好的，加入的阿昔替尼并使之在体外培养细胞的培养环境中均匀分布，阿昔替尼在体外培养细胞的培养环境中的终浓度不少于0.5μm，通常为1-25μm，也可以是5-25μm、10-25μm或者15-25μm，例如，0.5、0.8、1.0、1.3、2.5、3.0、5.0、7.0、8.0、10.0、12.5、15.0、18.0、20.0、22.5、25μm，等等。[0017]较好的，加入的阿昔替尼并使之在体外培养细胞的培养环境中均匀分布，孵育的时间不少于8小时；更好的，孵育的时间不少于12小时。[0018]在本发明的一个实施例中，阿昔替尼加入体外培养细胞的培养环境中后孵育的时间不少于24小时。[0019]本发明中，获得含有ev-a71病毒的体外培养细胞可以通过常规方法获得，例如将病毒颗粒置于细胞的培养环境中，或者在细胞中表达ev-a71病毒或者其核心组分。在本发明的一个实施例中，所述的细胞是体外培养的rd细胞。[0020]再一方面，本发明提供了一种阿昔替尼药物组合物，所述的偶联物含有阿昔替尼和[0021]a)与标记物连接的载体，或者[0022]b)与固体连接的衔接体。[0023]本发明的阿昔替尼药物组合物可以由阿昔替尼与药学上可接受的载体构成。[0024]可选的，本发明提供一种阿昔替尼药物组合物，其包含肠道病毒71型嗜神经性病毒抑制剂阿昔替尼或其任何药学上可接受的盐，酯或前药。药学上可接受的盐，酯或前药包括但不限于：硫酸盐，二甲基异山梨醇，20-80，环糊精(例如)，角鲨烯，第二种丙二醇，聚乙二醇(最好是低分子量，例如peg400)，聚山梨酯，泊洛沙姆，聚氧基和它们的组合。[0025]再一方面，本发明提供了一种阿昔替尼抑制ev-a71病毒的试剂盒，该试剂盒含有以阿昔替尼为有效成分、辅以药学上可接受的辅料的抗ev-a71病毒药物和盛放药物的容器。[0026]所述的容器可以是盒体、药瓶、药物胶囊或者安置药物胶囊的小格，通常一个容器中可以有至少一个或者若干个上述的胶囊或者小格构成。小格之间彼此分隔，以方便取用。可以按照每次服药的剂量在每个小格中存放药物或者匹配的成分。[0027]再一方面，本发明提供了一种阿昔替尼抑制vp1蛋白的方法，该方法包括以下步骤：[0028]a)获取vp1蛋白或者产生vp1蛋白的细胞；[0029]b)获取含有阿昔替尼成分的药剂；[0030]c)将含有阿昔替尼成分的药剂与产生vp1蛋白的细胞或者vp1蛋白接触。[0031]本发明中，用于治疗的药物不仅会因所选的特定抑制剂而异，而且还取决于使用途径，需要哪种治疗方法以及患者的年龄、体重和状况，最终将由主治医师决定。一般而言，合适的剂量可以在每天约0.005至30mg/kg体重的范围内，最好在0.05的范围内到10mg/kg/天。所需剂量可以方便地以单剂量或以适当的间隔(例如两次，20次)分次服用每天三，四或更多剂。根据治疗需要和/或预防，所需剂量也可以是，例如，每次两天，每三天一次，甚至每周一次。该组合物方便地以单位剂型给药；优选地，可以使用单位剂量。例如，可以使用含有0.5至1500mg，较好的为1至1000mg，最好的5至700mg活性成分的单位剂量。[0032]本发明的组合物通常将通过口服，肠胃外，静脉内，肌内，皮下或其他注射剂途径给药，或者颊，直肠，阴道，经皮和/或鼻腔途径和/或通过以药学上可接受的剂型吸入。取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径，本发明的药物组合物可以不同的剂量给药。该药物组合物包括但不限于那些合适的药物及其相关成分，可以通过口腔，直肠，鼻腔，局部(包括颊和舌下)，透皮，阴道或肠胃外(包括肌肉内，皮下和静脉内)给药或以吸入或吹入方式给药。[0033]本发明的药物组合物在适当的情况下可以是方便地以离散的剂量单位显示，可以通过药学领域众所周知的任何方法作为单位。制药业适合口服的组合物方便地列为独立包装的单位，例如胶囊，扁囊剂或药片，每个都包含一个预定量的活性物质。口服片剂和胶囊可能含有常规药物赋形剂，例如粘合剂，填充剂，润滑剂，崩解剂或润湿剂。可以根据本领域已知的方法对片剂进行包衣，可以将组合物配制成用于肠胃外给药的形式(例如通过注射(例如推注或连续输注)，并且可以是小剂量安瓿瓶中的单位剂型形式输注或添加在含有防腐剂的多剂量容器中。组合物可采用悬浮液，溶液或油性或水性介质中的乳化液，其中可能含有配方剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。[0034]提供以下示例以说明本发明并不局限于此，并且不应认为是对本发明的限制。以下是组合物的许多非限制性实例包含稳定的无定形杂化纳米颗粒的例子。缩写的意义如下:[0035]“i”代表病毒抑制剂阿昔替尼；“p”代表聚合物稳定和形成基质的组分；“s”代表增溶剂。[0036]可以采用的形式如下：[0037]“i+p”代表抑制剂与聚合物稳定和形成基质的组分的物理混合物，即无需进一步处理；[0038]“i+s”代表抑制剂与增溶剂的物理混合物；[0039]“i+p+s”代表抑制剂的物理混合物，包括：抑制剂、聚合物稳定剂和形成基质的组分、及增溶剂；[0040]“i/p”代表具有抑制剂的稳定，无定形杂化纳米颗粒以及聚合物稳定和形成基质的组分；[0041]“i/p+s”代表稳定的无定形杂化纳米粒子，具有15抑制剂和聚合物稳定和形成基质的组分以及添加单独的增溶剂；[0042]“i/p/s”表示稳定，无定形的杂化纳米粒子，具有抑制剂，聚合物稳定和形成基质的组分以及增溶剂。[0043]如本发明所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。[0044]术语“治疗”是指逆转，减轻，抑制或减缓这些术语适用的疾病，病症或病状或此类疾病，病症或病状的一种或多种症状的进展。[0045]除非另有说明，否则成分的所有百分比均为单位体积重量(w/v)，除非另有说明，否则w/v百分比是指最终组合物的单位体积重量百分比。[0046]如本发明所使用的，被定义为“大约”每个特定值的，与量，重量等有关的所有数值为正负10％。例如，短语“约5％w/v”应理解为“4.5％至5.5％w/v”。因此，权利要求的范围涵盖在要求保护的值的10％以内的量。[0047]术语“药学上可接受的”描述了不是生物学上或其他方面不期望的材料，即，不会引起不可接受水平的不期望的生物学作用或以有害的方式相互作用的材料。[0048]如本发明所用，术语“有效量”是指足以影响期望的生物学作用，例如有益结果的量，包括但不限于预防，减少，减轻或消除疾病或病症的体征或症状。因此，药物组合物或方法的每种活性成分的总量足以显示有意义的受试者益处。因此，“有效量”将取决于其被施用的环境。有效量可以一种或多种预防或治疗性给药方式给药。[0049]术语“前药”是指化合物，包括本发明化合物的单体和二聚体，其具有可裂解的基团并在生理条件下变为在体内具有药物活性的化合物。[0050]如本发明所用，“盐”是指保留母体化合物的生物学效力和性质并且在所施用的剂量下对生物学无害或以其他方式无害的那些盐。本发明化合物的盐可以由无机或有机酸或碱制备。[0051]本发明的化合物可以以衍生自无机或有机酸或碱的药学上可接受的盐形式使用。短语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性，刺激性，过敏反应等的盐，并且与盐类相当。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，s.m.berge等1977年在《药物科学》详细描述了药学上可接受的盐。[0052]这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而分开制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，二葡萄糖酸盐，甘油磷酸酯，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，富马酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，2-羟基乙磺酸盐(异硫氰酸盐)，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，烟酸盐，2-萘磺酸盐，草酸盐，棕榈酸酯，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸酯，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，谷氨酸盐对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。[0053]另外，碱性含氮基团可以用诸如低级烷基卤化物如甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物的季铵化剂进行季铵化。硫酸二烷基酯，如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，例如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂基氯化物，溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苄基和苯乙基溴化物等。由此获得水溶性或油溶性或分散性产物。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如盐酸，氢溴酸，苹果酸，硫酸和磷酸的无机酸，以及诸如草酸，苹果酸，马来酸，甲磺酸的有机酸，琥珀酸和柠檬酸。优选的酸加成盐是由甲磺酸，苹果酸和磷酸制备的。[0054]碱性加成盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中制备，方法是使含羧酸的部分与合适的碱，例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐，或与氨或有机伯，仲或叔胺。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子，例如锂，钠，钾，钙，镁和铝的盐等，以及无毒的季铵盐和胺阳离子，包括铵，四甲基铵，四乙基铵甲基铵，二甲基铵，三甲基铵，三乙基铵，二乙基铵和乙基铵等。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌啶，哌嗪等。[0055]如本发明所用，术语“酯”由式-oc(o)a表示1或-c(o)oa1，其中a1可以是烷基，环烷基，烯基，环烯基，炔基，环炔基，芳基，杂芳基或其他合适的取代基。[0056]如本发明所用，术语“总生存期”(os)定义为从随机化开始到因各种原因导致病人死亡之间的时间，且是按意向治疗人群(itt)计算。通常指临床试验中患者从随机化分组至因任何原因引起的死亡时间。[0057]如本发明所用，术语“客观缓解率“(orr)是指，肿瘤体积缩小达到30％(通常)并能维持最低时限要求的患者比例，为短期疗效评价指标，是完全缓解(cr)和部分缓解(pr)比例之和。通俗说法是，患者接受某种治疗后有效的人数比例，orr越高意味着使用该疗法肿瘤缩小的患者更多。客观缓解率(orr)是指肿瘤体积缩小达到预先规定值并能维持最低时限要求的患者比例。缓解期通常是指从开始出现疗效直至证实出现肿瘤进展的这段时间。[0058]如本发明所用，术语“疾病控制率“(dcr)的计算公式是dcr＝cr+pr+sd。cr和pr分别指完全缓解和部分缓解，sd(stabledisease)指病情稳定，基本已控制。[0059]如本发明所用，术语“患者”是指但不限于人或其他动物。[0060]如本发明所用，术语“逐滴”是指将一种溶液递增地添加至另一溶液的任何方法。[0061]本发明的研究表明，阿昔替尼能够有效的肠道病毒71型嗜神经性病毒的活性，阿昔替尼治疗后rd细胞的病毒减少，在rd细胞中对ev-a71的剂量依赖性抑制。本发明从已上市药品中筛选具有抗ev-a71病毒活性的药物，将节约药物筛选过程中有关药物代谢、药物安全和毒理等方面的研究费用，降低药物研发的风险，为ev-a71感染疾病的对症治疗和新药开发提供新的思路和途径。附图说明[0062]为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0063]图1.rd细胞中阿昔替尼的cc50；[0064]图2.阿昔替尼治疗后rd细胞的病毒减少；[0065]用ev-a71以0.1的moi接种用dmso或指示抑制剂(10μm)处理的rd细胞，24h后，其中，图2a为细胞裂解物中的相对病毒载量；图2b为上清液中的相对病毒载量；图2c通过tcid50测定，确定了抑制剂处理样品的病毒滴度；图2d通过蛋白质印迹分析ev-a71vp1蛋白，gapdh用作上样对照；[0066]图3.阿昔替尼在rd细胞中对ev-a71的剂量依赖性抑制；[0067]用不同指定浓度的阿昔替尼抑制剂处理的rd细胞以0.1的moi接种ev-a7124小时，以二甲基亚砜(dmso)处理的细胞为100％对照，使用rt-qpcr分析，其中，图3a为细胞裂解物中的相对病毒载量(％)；和图3b为上清液中的相对病毒载量(％)；图3c在tcid50测定中，还确定了抑制剂处理样品的病毒滴度；图3d通过蛋白质印迹分析ev-a71vp1蛋白，gapdh用作上样对照。具体实施方式[0068]以下通过实施例对本发明阿昔替尼在制备抑制肠道病毒71型嗜神经性病毒ev-a71药物中的应用的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。[0069]材料准备：获得含有ev-a71病毒的体外培养细胞可以通过常规方法获得，例如将病毒颗粒置于细胞的培养环境中，或者在细胞中表达ev-a71病毒或者其核心组分。在本发明的一个实施例中，所述的细胞是体外培养的rd细胞。[0070]实施例1[0071]阿昔替尼对rd细胞的毒性作用[0072]为了评估阿昔替尼的抗病毒作用，我们测量了rd细胞中阿昔替尼的50％细胞毒性浓度(cc50)，以排除这些抑制剂对rd细胞活力的不利影响。[0073]用指定浓度的阿昔替尼处理rd细胞，使用发光细胞活力试剂测定cc50。相应结果见图1。[0074]根据上述实验检测结果计算得出阿昔替尼(axitinib)对rd细胞的毒性结果cc50为104.0μm。[0075]实施例2[0076]阿昔替尼对ev-a71的抗病毒作用[0077]根据以上细胞毒性结果，我们首先选择10μm作为药物处理rd细胞的浓度。接下来，用moi为0.1的ev-a71感染被dmso或指定的抑制剂(10μm)处理过的rd细胞。24h后，阿昔替尼对ev-a71的抗病毒效果通过病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白vp1的表达进行测定，结果见图2a至2d：[0078]细胞裂解物(图2a)和上清液(图2b)被收获用于病毒基因拷贝数的量化；在tcid50测定中，还确定了抑制剂处理样品的病毒滴度(图2c)；(图2d)通过蛋白质印迹分析ev-a71vp1蛋白，gapdh用作上样对照；数据显示三个独立实验的平均值和sd；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。[0079]以ev-a71为100％，阿昔替尼在细胞裂解物(图2a)和上清液(图2b)中病毒基因拷贝数的相对值分别为5.14365％和17.5151％，ev-a71中的tcid50值5.01×107/ml，见下表1，阿昔替尼的tcid50值刚超过106/ml。阿昔替尼中vp1蛋白含量较少(图2d)。根据相应实验检测结果计算得出，阿昔替尼在无毒性浓度下对ev-a71感染的rd细胞有保护作用，即阿昔替尼在rd细胞上对ev-a71都有抑制作用，提示阿昔替尼具有抗ev-a71病毒活性。[0080]表1[0081]药物细胞裂解物(相对值％)上清液(相对值％)tcid50/mlev-a711001005.01×107axitinib5.1436517.51512.16×106。[0082]实施例3.[0083]阿昔替尼可以剂量依赖地抑制ev-a71感染和复制[0084]用moi为0.1的ev-a71感染被dmso或指定的抑制剂浓度处理过的rd细胞。24h后，阿昔替尼对ev-a71的抗病毒效果通过病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白vp1的表达情况进行测定，相应结果见图3a至图3d:[0085]用指定浓度的阿昔替尼抑制剂处理的rd细胞以0.1的moi接种ev-a7124小时，以二甲基亚砜(dmso)处理的细胞为100％对照，使用rt-qpcr分析发现细胞裂解物，其中，图3a细胞裂解物中，分别为1、5、10、25μm的阿昔替尼处理的rd细胞的相对病毒载量(％)分别约为60、43、12、3；图3b上清液中，分别为1、5、10、25μm的阿昔替尼处理的rd细胞的相对病毒载量(％)分别约为85、77、52、14；图3c在tcid50测定中，还确定了抑制剂处理样品的病毒滴度，为使用1、5、10、25μm的阿昔替尼的病毒滴度依次下降，dmso处理的细胞接近107，而25μm的阿昔替尼则略多于105，见表2不同浓度的axitinib和以dmso处理的细胞为100％对照表；通过蛋白质印迹分析ev-a71vp1蛋白，如图3d所示，以gapdh用作上样对照，通过蛋白质印迹分析1、5、10、25μm的阿昔替尼处理后细胞中的ev-a71vp1蛋白依次降低，当浓度为25μm时，vp1蛋白几乎检测不到(d)。数据显示三个独立实验的平均值和sd；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。****p《0.0001。[0086]表2：不同浓度的axitinib以二甲基亚砜(dmso)处理的细胞为100％为对照表[0087]axitinib细胞裂解物(相对值％)上清液(相对值％)tcid50/mldmso1001007.88×106axitinib1μm59.079284.68943.42×106axitinib5μm42.929377.17591.91×106axitinib10μm12.337752.46116.05×105axitinib25μm2.9917414.1881.91×105[0088]实验结果表明，在一定的浓度范围内，随着阿昔替尼浓度逐渐升高，病毒载量，病毒滴度和病毒结构蛋白vp1的表达逐渐下降，说明阿昔替尼可以剂量依赖地抑制ev-a71的感染和复制。[0089]实施例4[0090]针对ev-a71的抗病毒活性、细胞毒性和选择性指数[0091]本发明还评估了阿昔替尼对ev-a71感染的cc50和ec50，以及对应的选择性指数(selectivityindex,si)。[0092]实验结果表明，阿昔替尼在rd细胞中表现出较高的细胞毒性(104.0±17.58μm)，以4.54±1.17μm的半数最大有效浓度(ec50)有效抑制ev-a71感染，si(selectivityindex)为22.91，按照cc50/ec50计算。根据上述实验检测结果计算得出，阿昔替尼(阿昔替尼)在rd细胞中抗ev-a71感染的选择性指数为22.91，能够有效的抑制ev-a71病毒活性。[0093]本发明也对其他多种vegfr抑制剂作了抗病毒分析，但作用程度有差异，可能是工艺，纯度或其他多种因素的影响。[0094]以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12