一种腹膜透析组合物的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种腹膜透析组合物。


背景技术：

2.腹膜透析(peritoneal dialysis,pd)是尿毒症终末期肾病(end stage of renal disease,esrd)患者主要肾脏替代疗法之一。在pd中，使用高渗溶液通过腹膜(pm)将机体多余的水分从体内清除。目前，pd溶液中最常用的渗透剂是浓度为1.5％～4.25％的葡萄糖溶液，例如来自baxter(deerfield，il，usa)的dianeal。随着透析时间延长，低浓度葡萄糖透析液很快无法引出足够的水分，需使用高浓度葡萄糖透析液作为透析液，而随着高浓度葡萄糖透析液使用次数的增加，通常在透析2年后会出现透析效率低下，使得患者无法继续单纯依靠腹膜透析而必须转为血液透析。据统计，超滤衰竭的发生率随着pd年限的延长而增加，而超滤衰竭是腹膜透析患者被迫退出腹膜透析的主要原因。预防和减缓腹膜纤维化是避免腹膜透析患者出现超滤衰竭的根本方法，是保障他们长期透析成功延长寿命的关键。
3.腹膜组织由间皮层、基底层和间皮下支持组织三层组成。其中间皮下支持组织富含微血管，间皮细胞和间皮下微血管是完成腹膜透析的最主要的细胞和结构基础。腹膜纤维化在形态学上表现为间皮细胞减少，死亡的间皮细胞被肌成纤维细胞或成纤维细胞替代，炎症细胞浸润和细胞外基质的大量堆积并伴随血管数目增加。因此，间皮细胞的死亡和腹膜炎症是引起腹膜纤维化的根本原因。目前主流观点认为导致间皮细胞死亡和腹膜炎症的因素是高浓度葡萄糖本身，以及高浓度葡萄糖诱导的细胞代谢异常和产生的自由基。因此近年来，较多的科研和临床研究致力寻求替代高浓度葡萄糖溶液的透析液，但遗憾的是都未能达到防止腹膜纤维化的效果。
4.发明专利cn109394781 a中使用葡萄糖聚合物代替葡萄糖，葡萄糖聚合物分子体积大，无法直接经由扩散作用通过腹膜壁进入腹膜内微血管并为身体所吸收，因此在腹膜腔内产生高胶体渗透压，以维持留置期的脱水及廓清效能，降低透析过程相关炎症发生，延长腹膜透析患者的透龄。以多聚葡萄糖为渗透液的艾考糊精透析液就是其中的一种。dousdampanis等人发表的《icodextrin and peritoneal dialysis:advantages and new applications》(《int urol nephrol》2018年第3期)一文中使用艾考糊精代替传统高浓度葡萄糖作腹膜透析液。艾考糊精是通过α(1-4)和α(1-6)糖苷键连接的水溶性葡萄糖聚合物，平均相对分子质量为16200da，目前市场上有百特公司生产的含7.5％的艾考糊精透析液，渗透压为285mosm/l。与人体的渗透压相等，主要是利用胶体渗透压通过腹膜上的小孔等渗地清除水分。
5.无论是含有葡萄糖的腹膜透析液，还是多聚糖的艾考糊精腹膜透析液都是通过晶体或胶体渗透压进行超滤脱水，高渗透压均可能造成腹膜间皮细胞的渗透损伤或死亡，所以目前腹膜透技术需要解决的关键问题是如何在葡萄糖或其临床使用的透析液的基础上保护腹膜细胞，特别是腹膜间皮细胞，从而防止腹膜纤维化，不发生超滤衰竭。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种能够保护腹膜细胞，进一步降低腹膜细胞死亡率的腹膜透析组合物。
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
8.一种腹膜透析组合物，包括腹膜透析液，所述的腹膜透析组合物还包括丙酮酸钠和甜菜碱。
9.甜菜碱作为渗透调节物质与丙酮酸钠联用后能够进一步降低腹膜细胞死亡率。
10.优选地，所述的丙酮酸钠在所述的腹膜透析组合物中的浓度为1～300mg/l。
11.进一步优选地，所述的丙酮酸钠在所述的腹膜透析组合物中的浓度为50～150mg/l。
12.优选地，所述的甜菜碱在所述的腹膜透析组合物中的浓度为0.01～1000mmol/l。
13.进一步优选地，所述的甜菜碱在所述的腹膜透析组合物中的浓度为1～500mmol/l。
14.本发明中所述的腹膜透析液为现有已公开的、商业化的腹透液、临床上常规使用或理论上能够用于临床的腹透液。
15.优选地，所述的腹膜透析液为葡萄糖腹透液、氨基酸腹透液、葡聚糖腹透液或艾考糊精腹透液中的一种或多种。
16.根据一些实施方式，所述的腹膜透析液为1.5％～4.25％的葡萄糖腹透液、1.5％～4.25％的氨基酸腹透液、1.5％～4.25％的葡聚糖腹透液或6％～8％的艾考糊精腹透液。
17.根据一些实施方式，每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0018][0019]
所述的腹膜透析液的ph值为4.5～6.5，
[0020]
所述的腹膜透析液基质为葡萄糖、氨基酸或葡聚糖中一种或多种。
[0021]
根据另一些实施方式，每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0022]
所述的腹膜透析液的ph值为5.0～6.0。
[0023]
例如，每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0024][0025]
所述的腹膜透析液的ph值为4.5～6.0；
[0026]
或，
[0027]
每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0028][0029]
所述的腹膜透析液的ph值为4.5～6.5；
[0030]
或，
[0031]
每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0032][0033][0034]
所述的腹膜透析液的ph值为4.5～6.5；
[0035]
或，
[0036]
每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：
[0037][0038]
所述的腹膜透析液的ph值为5.0～6.0。
[0039]
上述具体的腹膜透析液仅是作为说明，并不限制甜菜碱和丙酮酸钠只能用于这几种腹膜透析液，理论上可用的腹膜透析液与甜菜碱和丙酮酸钠联用都能够有效降低细胞焦亡，提高腹膜透析的超滤效果。
[0040]
本发明还提供如所述的腹膜透析组合物的制备方法，所述的制备方法为将所述的丙酮酸钠和甜菜碱直接与所述的腹膜透析液混合，或者将所述的丙酮酸钠和甜菜碱与所述的腹膜透析液的原料混合得到所述的腹膜透析组合物。
[0041]
本发明与现有技术相比具有如下优势：
[0042]
本发明首次将丙酮酸钠与甜菜碱等渗透调节物质联用，发现能够进一步提高腹膜透析液的细胞保护效果，在不需对商业化或临床上常用的腹透液的配方进行调整的前提下，直接向现有腹膜液中加入少量的丙酮酸钠和甜菜碱，即可有效降低细胞焦亡，提高腹膜透析的超滤效果，显著延缓腹膜透析超滤衰竭的发生时间。
附图说明
[0043]
图1为不同浓度的甜菜碱同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞光镜图；
[0044]
图2为不同浓度的甜菜碱同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞结晶紫染色图；
[0045]
图3为不同浓度的甜菜碱同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞ldh释放率的检测分析结果图；
[0046]
图4为不同浓度的甜菜碱同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的western blot检测细胞的caspase 3蛋白、gsdme蛋白以及β-actin表达电泳图；
[0047]
图5为不同浓度的丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞光镜图；
[0048]
图6为不同浓度的丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞结晶紫染色照片；
[0049]
图7为不同浓度的丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞ldh释放率的检测分析结果图；
[0050]
图8为不同浓度的丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的western blot检测细胞的caspase 3蛋白、gsdme蛋白以及β-actin表达电泳图；
[0051]
图9为甜菜碱和丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞光镜图；
[0052]
图10为甜菜碱和丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞结晶紫染色图；
[0053]
图11为甜菜碱和丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的细胞ldh释放率的检测分析结果图；
[0054]
图12为甜菜碱和丙酮酸钠同时给予细胞4.25％葡萄糖处理24小时的western blot检测细胞的caspase 3蛋白、gsdme蛋白以及β-actin表达电泳图；
[0055]
图13为小鼠腹透超滤量uf的测定结果图；
[0056]
图14为小鼠腹透后透析液中ldh含量检测分析图；
[0057]
图15为小鼠腹透后腹膜组织masson染色结果图(scale bar＝100μm)。
具体实施方式
[0058]
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0059]
发明人在前期的研究中发现商业化或临床常用的腹膜液，例如葡萄糖腹透液、氨基酸腹透液、葡聚糖腹透液或艾考糊精腹透液等，透析液基质的差异对细胞存活度影响较小，但若将体内正常产生的或外源性的晶体或胶体渗透调节物质甜菜碱加入上述腹透液中，可以为腹膜间皮细胞提供高渗保护，来帮助细胞对高渗环境进行自我调节，使得腹膜间皮细胞能够更好地适应高渗环境，减少细胞焦亡及细胞凋亡等细胞死亡，从而使得腹膜纤维化减轻，并显著延缓腹膜透析超滤衰竭的发生时间。
[0060]
随着研究的深入，发明人在大量研究之后偶然发现当甜菜碱与丙酮酸钠联用时，可以进一步提对高腹膜间皮细胞的高渗保护作用，高渗葡萄糖透析液中细胞死亡率进一步下降。因此开发了一种优化的腹膜透析液，在不需对现有商业化或临床常用的腹透液进行配方调整的前提下，直接向现有腹透液中加入少量的丙酮酸钠和渗透保护物质甜菜碱，即可有效降低细胞焦亡及细胞凋亡等细胞死亡，显著延缓腹膜透析超滤衰竭的发生时间。
[0061]
更具体地，所述的丙酮酸钠在所述的腹膜透析组合物中的浓度为1～250mg/l，例如10mg/l、20mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、90mg/l、100mg/l、110mg/l、120mg/l、130mg/l、140mg/l、150mg/l、160mg/l、170mg/l、180mg/l、190mg/l、200mg/l、210mg/l、220mg/l、230mg/l、240mg/l、250mg/l。
[0062]
更具体地，所述的腹膜透析液中的甜菜碱的浓度为0.01～1000mmol/l，例如0.01mmol/l、0.05mmol/l、1mmol/l、50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、200mmol/l、250mmol/l、300mmol/l、350mmol/l、400mmol/l、450mmol/l、500mmol/l、550mmol/l、600mmol/l、650mmol/l、700mmol/l、750mmol/l、800mmol/l、850mmol/l、900mmol/l、950mmol/l、1000mmol/l。
[0063]
下面结合具体实验来说明本发明的技术方案和技术效果。
[0064]
以下实施例中4.25％葡萄糖高渗性腹透液(baxter,6ab9796)。配方为：每100ml腹膜透析液中包括以下含量的成分：葡萄糖4.25g；氯化钠538mg；氯化钙18.3mg；氯化镁5.1mg；乳酸盐448mg；ph值约为5.2。
[0065]
实施例一：甜菜碱可缓解高渗诱导的腹膜间皮细胞焦亡
[0066]
人腹膜间皮细胞系hmrsv5：培养基是包含10％(v/v)fbs和1％青霉素/链霉素的dmem高糖培养基(hyclone，cat no：sh30022.01)中，置于37℃,5％co2培养箱中培养，观察细胞生长状态，每2天更换培养基。细胞达到90％融合后传代，用0.25％的胰酶37度消化细胞3min，终止消化后收集细胞，1000r，室温，5min，离心后用完全培养基重悬细胞并计数，铺板，六孔板，70万/孔。间皮细胞贴壁16-24h开始饥饿12h，给予细胞不同浓度的甜菜碱(0.5mm，5mm，7mm，10mm)同时给予细胞高糖(glu 236mm)处理24小时，观察到细胞在单纯给予不同甜菜碱处理后细胞生长状况良好，同时给予236mm的葡萄糖处理时，发现细胞从1mm甜菜碱开始细胞存活明显改善，而且随着剂量的增大细胞死亡逐渐减少(图1)；结晶紫染色结果提示甜菜碱处理后的细胞存活剂量依赖的增多(图2)；细胞释放到上清中的乳酸脱氢酶ldh的释放量随着甜菜碱剂量增加而降低(图3)，细胞凋亡及细胞焦亡分子caspase-3被切割活化减低，细胞焦亡分子gsdme的切割活化被显著抑制(图4)。图1～图4的结果证明甜菜碱可能在腹膜间皮细胞应对高糖高渗环境发挥保护作用。
[0067]
实施例二：
[0068]
实验步骤同实施例一，区别仅在于将甜菜碱换成丙酮酸钠。
[0069]
给予腹膜间皮细胞不同浓度的丙酮酸钠(50mg/l，70mg/l，100mg/l，150mg/l)同时给予细胞高糖(glu 236mm)处理24小时，光学显微镜观察到细胞在给予不同浓度丙酮酸钠预处理后同时给予236mm的葡萄糖处理时，发现细胞从50mg/l丙酮酸钠开始细胞存活明显改善，而且随着剂量的增大细胞死亡逐渐减少(图1)；结晶紫染色结果提示丙酮酸钠处理后的细胞存活剂量依赖的增多(图2)；细胞释放到上清中的ldh液随着丙酮酸钠剂量增加而降低(图3)，caspase 3蛋白的切割活化显著减少，同时细胞焦亡的标志蛋白gsdme的切割活化也显著降低，由此证明丙酮酸钠在腹膜间皮细胞应对高糖高渗环境发挥保护作用。
[0070]
实施例三：
[0071]
给予腹膜间皮细胞不同浓度甜菜碱(5mm，7mm)同时给予细胞高糖(glu 236mm)处理24小时，不同浓度的丙酮酸钠(70mg/l，150mg/l)同时给予细胞高糖(glu 236mm)处理24小时，以及同时给与甜菜碱和丙酮酸钠及细胞高糖(glu 236mm)处理24小时(步骤同实施例一)。光学显微镜观察在同时给予丙酮酸钠及甜菜碱预处理4.25％的葡萄糖处理腹膜间皮细胞时，发现细胞同时给予甜菜碱和丙酮酸钠预处理细胞比单纯给与丙酮酸钠及甜菜碱预处理细胞存活明显改善，而且随着剂量的增大细胞死亡逐渐减少(图9)，结晶紫染色结果提示甜菜碱处理后的细胞存活剂量依赖的增多(图10)，细胞释放到上清中的ldh随着甜菜碱剂量增加而降低(图11)，caspase 3蛋白的切割显著减少，同时细胞焦亡的标志蛋白gsdme的切割活化也显著减少(图12)，由此证明同时给予细胞适当剂量的丙酮酸钠和甜菜碱在腹膜间皮细胞应对高糖高渗环境发挥更强的保护作用。
[0072]
实施例四：
[0073]
向小鼠腹膜腔内注射高渗性腹透液(4.25％pd)构建小鼠腹膜纤维化模型，16只c57wt小鼠分为三组，对照组n＝4：每日腹腔内注射0.9％ns按体重120ml/kg+治疗剂量甜菜碱等体积的无菌生理盐水。模型组n＝6：每日腹腔内按体重120ml/kg注射4.25％的腹膜透析液+甜菜碱等体积的4.25％的腹膜透析液。甜菜碱治疗组(n＝6)：每日腹腔内注射按体重120ml/kg的4.25％腹膜透析液+甜菜碱10mm(将甜菜碱与腹膜透析液混合，混合物中甜菜碱
的终浓度为10mm)，一共持续6周。甜菜碱治疗组与单纯模型组同时处理。实验开始时各组小鼠体重无明显差异，从第一天起，每天监测小鼠体重并记录。最后有2只小鼠退出实验，模型组1只、甜菜碱治疗组1只，均为体重不明原因的大幅度下降，并且在6周时打开腹腔后发现腹水浑浊。其余小鼠饮食活动均正常，精神状态较好，体重较开始时增加。实验结束后统计体重可见，模型组体重均低于正常对照组，而甜菜碱治疗组的体重稍高于模型组，但是仍然比正常对照组低。但统计学分析均无明显的统计学差异。
[0074]
动物样本取材及标本处理、保存
[0075]
实验第6周做腹膜平衡实验，监测腹膜功能，并对小鼠组织样本进行取材。小鼠停止腹膜透析48h后，即可进行2h的腹膜平衡试验。小鼠腹肌肉注射1％戊巴比妥钠进行麻醉，按0.07ml/10g注射。
[0076]
待小鼠麻倒后，将小鼠仰卧位固定于手术台上，常规腹部消毒，铺无菌手术洞巾，操作者穿无菌手术衣，带口罩以及无菌手套。随即沿着腹白线位置用消毒的镊子剪开一小口皮肤。每只小鼠腹腔注射4.25％腹膜透析液3ml，计时器计时，透析过程中需轻柔晃动腹部。在腹腔保留1h后回抽100ul透析液于干净的600ul ep管中，置于冰上，再尾静脉取血100ul于ep管中，做好标记。在腹腔保留2h后，无菌的注射器回抽腹腔内部透析液，直到抽尽为止，读取注射器内腹膜透析液的体积，装入5ml离心管中，做好标记。同时尾静脉取血100ul。再用手术刀沿着腹白线位置打开腹腔，逐层钝性分类筋膜及肌肉，避免损伤小血管或着把由小血管破裂后渗出的血擦拭干，避免血液流入腹腔内从而影响腹透液超滤量值的计算。超滤量：无菌的纱布轻柔的蘸取腹腔内液体，并计算纱布净增加的体积。超滤量(uf)＝注射器内透析液的体积+纱布净增加的体积-3ml。
[0077]
取材：充分暴露腹壁，取腹部切口两侧壁层腹膜，放入预冷的pbs中清洗多次后，剪成小块，分别放入4％pfa中固定(pfa的体积是组织体积的10倍以上)、oct中包埋且迅速放入液氮、1.5ml ep管放入液氮用做蛋白和rna检测。观察肠系膜以及其他脏层腹膜外观，取部分脏层腹膜分装放入ep管中，做好标记，立即液氮速冻，随后尽快将液氮内的样本放入-80℃冻存。装有组织及4％pfa的管子放于4度保存。
[0078]
分离腹膜透析液：将装有腹腔保留1h、腹腔保留2h后的腹膜透析液样本的600ul离心管，置于4度离心机中，3500r，4度，10min。离心后仔细转移上清至新的600ul ep管中，立即进行指标检测或者暂时放于-20度保存。
[0079]
分离腹膜透析液中细胞：将回收后的腹膜透析液放置冰上，3500rpm，4度，10分钟，转移腹膜透析液上清，管底沉淀若有红细胞则需要破除红细胞，最后用预冷的pbs清洗细胞3次，再次低温离心，弃掉上清回收cell，并根据细胞量加入适量的蛋白提取液，提取蛋白。
[0080]
对壁层腹膜进行石蜡包埋切片，并将组织固定于oct中进行冰冻切片的制备。
[0081]
动物实验样本检测结果
[0082]
模型组与对照组相比，超滤量减少，而甜菜碱治疗组则能很好的改善腹膜功能，显著增加超滤量；提示向腹透液中加入渗透调节物质甜菜碱后，腹膜的超滤功能明显增加，增强了腹膜透析的超滤效果。模型组透析液中ldh含量明显高于正常对照组，而甜菜碱治疗组透析液中ldh含量与正常对照组相差不大，说明甜菜碱治疗组能很好的减轻ldh的释放，模型组提示细胞焦亡参与到腹膜功能改变过程，而甜菜碱能有效抵抗腹膜功能改变(图14)。组织masson染色可见：正常对照组，腹膜组织薄而且连续，模型组相对于正常组在间皮下可
见明显的胶原沉积，腹膜增厚。甜菜碱治疗组较正常组腹膜轻微增厚，但相比模型组更薄(图15)。
[0083]
实施例四显示直接在现有商业化的腹透液中加入适量的甜菜碱，能够保护腹膜细胞，改善腹膜功能，提高腹膜透析效果，实施例三显示丙酮酸钠和甜菜碱联用后，能够进一步降低腹膜间皮细胞焦亡、凋亡等细胞死亡，因此，在现有腹透液中同时加入适量的甜菜碱和丙酮酸钠，将进一步提高其细胞保护效果，进一步提高腹膜透析效果，腹膜纤维化减轻，并显著延缓腹膜透析超滤衰竭的发生时间。
[0084]
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。