负载胰岛素的ZIF-8及其响应型胰岛素给药系统和制法与应用

负载胰岛素的zif-8及其响应型胰岛素给药系统和制法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医药材料技术领域，一种负载胰岛素的zif-8及其响应型胰岛素给药系统和制法与应用，具体涉及沸石基咪唑酸酯骨架-8和温敏水凝胶在智能缓慢释放胰岛素方面的协同应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种严重的慢性疾病，对个人、家庭和社会的生活产生重大影响，胰岛素适用于各种类型糖尿病的治疗，但其注射剂量一直是棘手的问题，剂量过多甚至会危害到患者的生命，临床上一般会通过监测血糖变化合理调控胰岛素注射量；但是步骤繁琐，导致病人依从性差，所以，目前迫切需要智能有效的治疗方案控制血糖水平。
3.葡萄糖智能响应给药系统可以通过体内血糖情况调节胰岛素释放量，缓解病情，常用的葡萄糖智能响应给药系统一般为葡萄糖氧化酶和苯硼酸，当苯硼酸作为响应基团时，制备过程一般比较复杂，经常会使用有机溶剂，从而无法保证胰岛素的活性，因此以葡萄糖氧化酶作为响应“开关”的研究相继增多，现有的研究，会将葡萄糖氧化酶和沸石基咪唑酸酯骨架-8(zif-8)结合，虽然可以实现很好的生物相容性，当葡萄糖氧化酶与对酸性敏感的载药沸石基咪唑酸酯骨架-8(zif-8)结合后，可根据葡萄糖浓度调控胰岛素释放量，但是，其在正常组织内葡萄糖会有消耗，并不能控制药物释放速度，而药物释放速率同样对治疗效果有一定的影响。目前，在材料化学和医药研究领域的推动下，多重响应型给药系统已进入到一个新的发展阶段。
4.其中，沸石基咪唑酸酯骨架-8是由咪唑基和zn离子自组装而成的，具体原理如下：zn离子配位键合咪唑基上n原子形成具有正四面体结构的znn4团簇，4个或是6个znn4团簇组成zif-8晶核，晶核通过有机体连接结合在一起并逐渐生长为zif-8晶体。其制备方法很多，比如“溶剂热法”、“液相扩散法”、“模板法”、“超声波或微波法”等。
5.温度响应型原位凝胶系统由对温度敏感的聚合物组成，该类聚合物在低临界胶凝温度)以下时以液体形式存在，而在环境温度达到或高于lcgt时形成凝胶，这种“溶胶-凝胶”的转变既可以满足制剂的可注射性又能降低药物释放速度。
6.泊洛沙姆是温敏水凝胶常用的基质，由聚氧化乙烯(peo)和聚氧丙烯(ppo)组成的高分子聚合物，其在水溶液中达到临界胶束浓度时，形成由peo链组成亲水外壳、ppo链组成疏水内核的胶束，低温下呈现液体状态，具有流动性和可注射性，给药方便。当作用部位温度高于胶凝温度时，胶束间会进一步缠绕和堆砌，体系由溶液状态转化为半固体凝胶状态，可以延长药物的作用时间。


技术实现要素：

7.针对现有的葡萄糖智能响应给药系统存在的问题，本发明提供了一种负载胰岛素的zif-8及其响应型胰岛素给药系统和制法与应用。将负载胰岛素的zif-8和葡萄糖氧化酶
共包裹在温敏水凝胶中形成的响应型胰岛素给药系统具有广阔的发展前景。
8.本发明的第一个目的是制备负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8(负载胰岛素的zif-8)。
9.本发明的第二个目的是制备温敏水凝胶同时包裹葡萄糖氧化酶和负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8(负载胰岛素的zif-8)的响应型胰岛素给药系统。
10.本发明的第三个目的是研究上述响应型胰岛素给药系统在降血糖效果方面的应用。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
12.本发明的一种负载胰岛素的zif-8，为以zif-8为载体，负载有胰岛素，包封率为57％～75％，载药量为14～27％。
13.所述的负载胰岛素的zif-8，其粒径为80～500nm，粒径分布均匀，其多分散指数pdi《0.2。
14.本发明的负载胰岛素的zif-8的制备方法，为“一锅法”制备方法，具体包括以下步骤：
15.(1)称量锌盐和有机咪唑，以水作为溶剂，搅拌溶解，分别得到锌盐溶液和有机咪唑溶液；
16.(2)将胰岛素加入有机咪唑溶液中并搅拌均匀，得到含有胰岛素的有机咪唑溶液；其中，按质量比，胰岛素：有机咪唑＝(2～5)：(50～200)；更优选为4:100；
17.(3)将锌盐溶液和含有胰岛素的有机咪唑溶液混合，得到混合溶液；其中，按质量比，锌盐：有机咪唑＝1：(2～8)；更优选为1:4；
18.将混合溶液搅拌反应，直至沉淀量不在发生变化，反应完成，得到混悬液；
19.(4)将混悬液进行固液分离，将沉淀水洗，干燥，得到负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8。
20.所述的步骤(1)中，作为优选，锌盐溶液中，锌盐的质量浓度为1.7～5.0mg/ml；作为优选，有机咪唑溶液中，有机咪唑的质量浓度为3.3～40mg/ml。
21.所述的步骤(1)中，有机咪唑优选为2-甲基咪唑，锌盐优选为硝酸锌。
22.所述的步骤(1)中，搅拌时间优选为10～20min。
23.所述的步骤(3)中，作为优选，将锌盐溶液滴加至含有胰岛素的有机咪唑溶液中，滴加速度为0.5～1ml/s。
24.所述的步骤(3)中，优选地，搅拌转速为300～500r/min，搅拌时间为0.5～3h。
25.所述的步骤(4)中，固液分离优选为离心分离，更优选为在7000r/min下转速离心10～15min。
26.所述的步骤(4)中，干燥优选为冷冻干燥。
27.本发明的一种响应型胰岛素给药系统，包括负载胰岛素的zif-8、葡萄糖氧化酶、凝胶基质和辅料。
28.进一步的，按质量比，负载胰岛素的zif-8中胰岛素：葡萄糖氧化酶：凝胶基质：辅料＝(0.2～2.0)：(1～5)：(230～290)：(5～20)。
29.所述的凝胶基质优选为泊洛沙姆，更优选为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的混合物，最优选为，按质量比，泊洛沙姆407：泊洛沙姆188＝22：3。其中，泊洛沙姆188中，peo所占
质量百分比达到80％，泊洛沙姆407中peo所占的质量百分比为70％。
30.所述的辅料优选为羟丙基甲基纤维素。
31.本发明的响应型胰岛素给药系统的制备方法，为“冷溶法”，包括以下步骤：
32.按照响应型胰岛素给药系统的物料配比，称量负载胰岛素的zif-8、葡萄糖氧化酶、温敏水凝胶溶液和辅料溶液，以水作为溶剂，进行搅拌，直至温敏水凝胶分散均匀，再置于1～5℃放置至温敏水凝胶充分溶胀，得到响应型胰岛素给药系统。
33.作为优选，温敏水凝胶溶液为质量浓度为1～25％的泊洛沙姆水溶液。
34.作为优选，辅料溶液为质量浓度为1～5％的辅料溶液。
35.所述的充分溶胀的时间优选为12～24h。
36.本发明的响应型胰岛素给药系统在用于制备降血糖药物的应用。
37.本发明的响应型胰岛素给药系统在用于制备注射型降血糖药物的应用。
38.本发明具有以下优点：
39.(1)本发明提供了一种对ph敏感的沸石基咪唑酸酯骨架-8，负载胰岛素后，粒径分布均匀，多分散指数(pdi)小于0.2，并且具有良好的物理稳定性。还因为本发明沸石基咪唑酸酯骨架-8包裹胰岛素的机制与仿生矿化相同，生物大分子通过分子间氢键和疏水相互作用增加金属阳离子和有机配体的局部浓度，有助于沸石基咪唑酸酯骨架-8在生物大分子周围的形成，同时将药物包裹在骨架中，具有保护胰岛素活性和响应性释放药物的优势。
40.(2)本发明选择生物相容性和降解性良好的泊洛沙姆作为凝胶基质，凝胶基质和辅料形成温敏水凝胶，通过“冷溶法”成功制备响应型胰岛素给药系统。制备的响应型胰岛素给药系统具有葡萄糖和温度双重响应性质，体外释放实验和体内降血糖效果研究结果证明，本发明中的响应型胰岛素给药系统可用于智能调控胰岛素的释放，在糖尿病治疗方面具有较大的应用前景，并且本发明制备条件温和，原料安全绿色无污染，zif-8凭借坚固的外壳避免胰岛素结构受到破坏，从而保持其生物活性，温敏水凝胶的加入为制剂提供了优良的缓释作用，体内外实验证明该给药系统对葡萄糖敏感，同时可以延长胰岛素在体内作用时间。
41.(3)本发明采用的辅料羟丙基甲基纤维素属于多糖衍生物，由于聚合物链中氢键或范德华力等相互作用而产生“溶胶-凝胶”的转变过程。
42.(4)温敏水凝胶作为一种药物载体，可负载多种药物，利用温敏水凝胶同时包裹负载胰岛素的zif-8与葡萄糖氧化酶制备响应型胰岛素给药系统。一方面，可以根据体内血糖水平调控胰岛素释放量避免低血糖风险，另一方面，温敏水凝胶可以减缓药物释放速度，延长药物作用时间，同时，温敏水凝胶在室温下的流动性满足了皮下注射给药方式的要求。
附图说明
43.图1为本发明实例2中沸石基咪唑酸酯骨架-8在负载胰岛素前后的透射电镜显微镜图，a：空白沸石基咪唑酸酯骨架-8，b：负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8。
44.图2为本发明实例3中负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8的体外稳定性。
45.图3为本发明实例5中基于mof的响应型胰岛素给药系统在不同环境中性状的图片，a：室温下，b：37℃。
46.图4为本发明实例5中基于mof的响应型胰岛素给药系统在室温下的可注射性。
47.图5为本发明实例6中基于mof的响应型胰岛素给药系统在不同释放介质中的体外释放曲线。
48.图6为本发明实例7中基于mof的响应型胰岛素给药系统在体内调节血糖水平曲线。
具体实施方式
49.通过以下具体实例对本发明的上述内容进行详细说明，但并不表示实施例对本发明的限制。
50.实例1
51.分别称取100mg 2-甲基咪唑和25mg六水合硝酸锌(质量比例为4:1)，再分别溶解至10ml水中溶解并在室温下搅拌15min，得到六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液；
52.另称取4mg的胰岛素至2-甲基咪唑溶液中溶解并搅拌15min，得到含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液；以不同的加入方式和加入顺序混合含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液和六水合硝酸锌溶液后，以400r/min的速度搅拌1h，以7000rpm的转速离心15min，收集沉淀，水洗三次后，冷冻干燥，即得负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8。
53.测定不同加入顺序和方式对负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8粒径、pdi和产率的影响，结果见表1。改变含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液和六水合硝酸锌溶液混合顺序后，发现粒径的大小发生明显的改变；为提高产率和保持分布均匀的负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8，最终确定混合方式为六水合硝酸锌溶液逐滴加入含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液中。
54.表1
[0055][0056]
实例2
[0057]
负载胰岛素/空白的沸石基咪唑酸酯骨架-8的制备
[0058]
分别称取100mg 2-甲基咪唑和25mg六水合硝酸锌适量(质量比例为4:1)，再分别溶解至10ml水中溶解并在室温下搅拌15min，得到六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液；
[0059]
另称取4mg的胰岛素至2-甲基咪唑溶液中溶解并搅拌15min，得到含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液；
[0060]
将六水合硝酸锌溶液逐滴加入含有胰岛素的2-甲基咪唑溶液中，以400r/min的速度搅拌1h，以7000rpm的转速离心15min，收集沉淀，水洗三次后，冷冻干燥，即得负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8。在不加入胰岛素的情况下以相同制备工艺制得空白沸石基咪唑酸酯骨架-8。
[0061]
分别用水将空白/负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8稀释至70μg/ml，滴在有碳膜的铜网上，沉降一段时间后除去多余液体，晾干，放入样品架上，送入样品室内观察其形
态并拍照。结果如图1，两者均呈现菱形十二面体，分散均匀，空白zif-8粒径为130nm，负载胰岛素的zif-8粒径为270nm，说明药物的载入对zif-8的形貌几乎没有影响，其中粒径的增大可能与胰岛素本身空间结构较大有关。
[0062]
实例3
[0063]
负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8的体外稳定性
[0064]
将负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8分别置于4℃和室温环境中，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60h测定粒径和pdi考察制剂的体外稳定性。结果如图2所示，载药制剂的粒径和pdi在4℃和室温条件下存放60h均无明显变化，可以保持较好的稳定性。
[0065]
实例4
[0066]
一种响应型胰岛素给药系统的制备方法，包括以下步骤：
[0067]
称取不同质量泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和20mg羟丙基甲基纤维素至西林瓶中，加入1ml的去离子水，另加入4.7mg负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8(按胰岛素计为1mg)和葡萄糖氧化酶(3mg)搅拌至基质分散均匀，于4℃冰箱放置过夜使其充分溶胀，得均匀分布的乳白色液体，即为响应型胰岛素给药系统。采用试管倒置法测定其胶凝温度(t
sol-gel
)和胶凝时间(t)。结果如表2所示，在相同条件下，胶凝温度会随着泊洛沙姆407质量的增加而降低，随着泊洛沙姆188质量的增加而增加，而胶凝时间没有规律性变化。
[0068]
表2
[0069][0070]
实例5
[0071]
一种响应型胰岛素给药系统的制备
[0072]
称取220mg泊洛沙姆407、30mg泊洛沙姆188和20mg羟丙基甲基纤维素至西林瓶中，加入1ml的去离子水，另加入4.7mg负载胰岛素的沸石基咪唑酸酯骨架-8(按胰岛素计为1mg)和葡萄糖氧化酶(3mg)搅拌至基质分散均匀，于4℃冰箱放置过夜使其充分溶胀，得均匀分布的乳白色液体，即为响应型胰岛素给药系统。
[0073]
响应型胰岛素给药系统在不同环境中的性状如图3所示，其在室温环境中具有流动性，而在37℃环境中呈现半固体状态。
[0074]
为了其的注射性，将凝胶溶液在室温(25℃)下加入一次性胰岛素注射器中，去除气泡，观察凝胶溶液是否能顺利通过注射器针头。如图4所示，在室温下，凝胶溶液可以在20秒内轻松通过29g针头。
[0075]
实例6
[0076]
响应型胰岛素给药系统的体外释放实验
[0077]
采用无膜法在含有不同葡萄糖浓度的磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中考察温敏凝胶制剂的体外药物释放行为，分别精密量取1ml制剂置于样品瓶中，胶凝后加入15ml释放介质，置37℃恒温振荡器中，振荡速度为100r
·
min-1
，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、84、96、108h取出释放液2ml，并补充等量同温的释放介质。取出的释放液过滤后用hplc法测定胰岛素浓度，计算累计释放量。
[0078]
根据图5可知该凝胶制剂具有葡萄糖敏感性质，胰岛素累计释放量随着葡萄糖的浓度增加而增多，同时释放时间长达96h。
[0079]
实例7
[0080]
响应型胰岛素给药系统的体内降血糖效果研究
[0081]
腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，随机分为以下五组(n＝5)，(1)模型组，(2)zif-8@gel组，(3)胰岛素溶液组，(4)ins@zif-8+gox组，(5)ins@zif-8/gox-gel组，另随机选择5只健康大鼠作为空白对照组(6)healthy组。分组后皮下注射给药，给药剂量为4u
·
kg-1
，其中模型组与空白对照组注射等体积的pbs。首先在给药前用血糖仪测定各组大鼠血糖值后，立即皮下注射给药，并于给药后的2、4、6、8、10、12、24h尾静脉采血，并用血糖仪测量血糖值。
[0082]
如图6可知，在没有凝胶包裹作用下，ins@zif-8+gox组注射2h之后为正常血糖，并且正常血糖水平持续了约3h，而胰岛素溶液组在注射之后血糖快速下降，在3h时血糖迅速回升至高血糖，以上结果说明响应型胰岛素给药系统具有明显的缓释作用，维持正常血糖时间是胰岛素溶液组的3.5倍，是ins@zif-8+gox组的2.5倍，同时能够避免出现低血糖现象。
[0083]
对比例1
[0084]
一种负载胰岛素的zif-8的制备方法，采用“浸渍法”方法对胰岛素进行负载，即首先合成空白zif-8并浸泡在胰岛素溶液中。胰岛素的载药量为3.24％，包封率为63.14％。
[0085]
由于胰岛素属于大分子药物，与小分子药物相比，不易于通过zif-8的空隙进入空腔中，说明在制备方法中，“一锅法”更适合zif-8对胰岛素的负载。
[0086]
对比例2
[0087]
一种负载胰岛素的zif-8的制备方法，同实施例1，不同之处在于，将胰岛素加入硝酸锌溶液中，再加入2-甲基咪唑溶液，则胰岛素在硝酸锌溶液中无法完全溶解，无法对胰岛素进行有效负载。
[0088]
对比例3
[0089]
一种负载胰岛素的zif-8的制备方法，同实施例1，不同之处在于，搅拌速率为1000r/min，则在搅拌合成过程中就产生了沉淀，说明此时得到的负载胰岛素的zif-8粒径较大，为微米级。