一种复合型虫草素制剂及其制备方法与在制备抗小细胞肺癌产品中的应用与流程

1.本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种复合型虫草素制剂及其制备方法与在制备抗小细胞肺癌产品中的应用。


背景技术：

2.小细胞肺癌约占支气管源性肺癌的15％-20％，小细胞肺癌确诊时，肿瘤处于局限期的患者约占30％，其余处于广泛期(当肿瘤扩散到锁骨上区以外时即为广泛期)。相较于其他类型的肺癌，小细胞肺癌有更好的化疗及放疗疗效。但因为小细胞肺癌确诊时肿瘤很可能已经广泛扩散，小细胞肺癌往往很难治愈。
3.虫草素又称冬虫夏草素、虫草菌素、蛹虫草菌素，别名3
′
－脱氧腺苷，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性；虫草素是非致突变和无毒的化合物，对小细胞肺癌细胞具有潜在的抗增殖和抗迁移作用。
4.紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的肺癌、卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。但紫杉醇有很强的副作用，包括过敏反应，神经毒性，心血管反应，肠道反应，肝脏中毒以及局部炎症反应。
5.甾体皂苷和甾体生物碱能够影响降低肿瘤细胞膜上蛋白的表达，如减少唾液酸的含量、抑制atp酶活性、下调n-乙酰基转移酶的表达，从而降低肿瘤细胞膜的流动性、抑制肿瘤细胞的代谢生长，其能降低癌细胞内的能量代谢，使癌细胞生长受阻，抑制其增殖。同时，甾体皂苷和甾体生物碱能够激活癌细胞凋亡的信号通路，促进癌细胞凋亡。但其同时也存在一些副作用例如轻微中毒，或仅有口腔黏膜、咽喉部的瘙痒，经过数小时后，可通过自身代谢完全缓解，中毒较重者可以出现上腹部疼痛，并有恶心、呕吐、腹泻等症状。若进一步加重，可表现为因呕吐、腹泻而脱水、体温升高以及瞳孔放大、怕光、耳鸣、肢体抽搐、呼吸困难、血压下降、休克，甚至死亡，所以重症患者应尽早送医院治疗。
6.因此，本发明提供了一种复合型虫草素制剂及其制备方法与在制备抗小细胞肺癌产品中的应用。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种复合型虫草素制剂。
8.本发明还要解决的技术问题是提供上述复合型虫草素制剂的制备方法。
9.本发明进一步要解决的技术问题是提供上述复合型虫草素制剂的应用。
10.为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种复合型虫草素制剂，包括如下
重量份数的组分：
11.虫草素
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65～80份
12.龙葵提取物
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10～25份
13.红豆杉提取物
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1～20份。
14.优选地，所述复合型虫草素制剂包括如下重量份数的组分：
15.虫草素
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70～75份
16.龙葵提取物
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15～22份
17.红豆杉提取物
ꢀꢀꢀꢀꢀ
3～15份。
18.进一步优选地，所述复合型虫草素制剂包括如下重量份数的组分中的任意一种：
[0019][0020]
更进一步优选地，所述复合型虫草素制剂包括如下重量份数的组分中的任意一种：
[0021][0022][0023]
其中，所述虫草素提取于野生蛹虫草和/或人工培育的北冬虫夏草。
[0024]
其中，所述虫草素的纯度为50％以上。
[0025]
其中，所述虫草素的其余组分为多糖类化合物或其他杂质；优选地，所述虫草素的其余组分主要为多糖类化合物；进一步优选地，所述虫草素的其余组分为多糖类化合物。
[0026]
其中，所述龙葵提取物中甾体化合物的含量为50％以上。
[0027]
其中，所述甾体化合物为甾体皂苷和/或甾体生物碱。
[0028]
其中，所述龙葵提取物的其余组分为多糖类化合物或其他杂质；优选地，所述龙葵提取物的其余组分主要为多糖类化合物；进一步优选地，所述龙葵提取物的其余组分为多糖类化合物。
[0029]
其中，所述红豆杉提取物提取于天然野生和/或人工培育的红豆杉。
[0030]
其中，所述红豆杉提取物中紫杉醇的含量为50％以上。
[0031]
其中，所述红豆杉提取物的其余组分为多糖类化合物或其他杂质；优选地，所述红豆杉提取物的其余组分主要为多糖类化合物；进一步优选地，所述红豆杉提取物的其余组分为多糖类化合物。
[0032]
其中，本发明中三种组分相辅相成，共同作用；具体地，所述虫草素是rna合成抑制剂，可选择性的抑制rna合成，继而影响蛋白质合成，具有抗肿瘤作用，虫草具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；所述龙葵提取物中甾体化合物能够减低肿瘤细胞的膜流动性及膜蛋白水平，也能够调节信号传导通路促进细胞凋亡；所述红豆杉提取物中紫衫醇能够促进围观蛋白异二聚体聚合成微管，结合到微管上促进微管稳定，抑制其动态变化，从而干扰纺丝体的形成，染色体无法分离，有丝分裂停滞在中期。
[0033]
其中，所述复合型虫草素制剂的剂型为粉剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂和口服液中的任意一种。
[0034]
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述复合型虫草素制剂的制备方法。
[0035]
其中，所述制备方法为按照配方称取各组分，混合后，溶于水，制成液体组合物制剂。
[0036]
其中，所述制备方法或者为按照配方称取各组分，混合后，加入制剂成型所需辅料，制备药物制剂的常规方法制成。
[0037]
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述复合型虫草素制剂在制备抗小细胞肺癌产品中的应用。
[0038]
其中，所述产品为功能性食品、药品和保健品添加剂中的任意一种。
[0039]
其中，所述产品可作为功能性食品用单独食用，也可作为药物以及保健品。
[0040]
本发明中，所述纯度和含量均为质量百分比。
[0041]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0042]
(1)与传统的抗小细胞肺癌中药组合相比，本发明所提供的复合型虫草素制剂更容易被人体所吸收，其原因在于所用的提取物都是该药物抗癌的活性成分，其余为小分子量的糖类，重均分子量大概在800以下，不需要代谢，可直接被人体吸收。
[0043]
(2)本发明所提供的三种提取物是经过严格的筛选，所用的三种药物成分是相辅相成的，从癌细胞的合成过程中的基因编码的识别以及合成，都会有抑制作用，从而遏制小细胞癌症的增生。
[0044]
(3)本发明提供的复合型虫草素制剂对早期癌症的治疗以及后期化疗过程中的协助治疗都有明显的效果。
[0045]
(4)本发明提供的复合型虫草素制剂既能够增强治疗小细胞肺癌的药效，又能减少其副作用。
附图说明
[0046]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0047]
图1经0.01％吖啶橙荧光染料染色的斑马鱼实验中荧光显微镜下斑马鱼卵中h69
细胞的脑转移情况。
[0048]
图2为斑马鱼实验中加入滤光片后荧光显微镜下斑马鱼卵中h69细胞的尾转移情况。
具体实施方式
[0049]
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0050]
下述实施例中，所述虫草素的纯度为95.5％，多糖类化合物的含量为4.5％，其主要为重均分子量在720～180的寡糖。
[0051]
下述实施例中，所述龙葵提取物中龙葵素的提取过程参考文献(马铃薯中龙葵素的提取方法)主要是茄碱，茄碱的含量为83.8％，糖类化合物的含量为16.2％，其主要为重均分子量在720～180的寡糖。
[0052]
下述实施例中，所述红豆杉提取物中紫杉醇的含量为82.3％，多糖类化合物的含量为17.7％，其主要为重均分子量在720～180的寡糖。
[0053]
本发明所用的实验小鼠购自南京农业大学实验动物中心，lewis肺癌细胞株购自南京农业大学实验动物中心，小鼠cd4单克隆抗体、cd8单克隆抗体购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；tnf-α、il-2、il-7elisa试剂盒，英国abcam公司。
[0054]
本发明采用的气阴两虚型lewis肺癌小鼠模型，制备方法参考文献(加味龟鹿二仙胶汤对气阴两虚lewis荷瘤小鼠化疗的减毒增效作用，中药材，2014,37(8):1434-1437)进行。
[0055]
本发明中动物饲养环境：spf级，室温为(20.0℃～22.5℃)，相对湿度为(54.4～68.4)％rh，群笼饲养，10只/笼。
[0056]
本发明通过以下指标进行检测：
[0057]
1.观察小鼠一般情况：给药后每日观察各组小鼠的大便、毛色等一般状况。
[0058]
2.体重下降率＝(第1天体重-第22天体重)/第1天体重
×
100％。
[0059]
3.抑瘤率计算：在第22天，通过颈脱位法处死小鼠，分离肿瘤。
[0060]
肿瘤抑瘤率＝(模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量
×
100％。
[0061]
实施例1
[0062]
(1)配制复合型虫草素制剂
[0063]
按照虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物的质量为750mg：30mg：220mg称取各组合物，混合后溶于生理盐1l水中。
[0064]
(2)设置4组小鼠进行灌胃实验。每组小鼠雌雄小鼠各5只。分别对用高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型组。高剂量组的小鼠使用剂量为80mg/kg，中剂量组的小鼠使用剂量为50mg/kg，低剂量组小鼠使用剂量为20mg/kg。模型组为等体积生理盐水。每日2次。持续22日。检测方法参照上述方法。
[0065]
实验结果如表1-表2所示：
[0066]
表1
[0067]
组别体重下降率(％)粪便硬度便血/潜血脱毛
模型组23正常正常正常高剂量组3正常正常正常中剂量组6正常正常正常低剂量组10正常正常正常
[0068]
表2
[0069]
组别瘤质量/g抑瘤率/％模型组3.56
±
0.45-高剂量组0.62
±
0.3682.5％中剂量组1.26
±
0.4164.6％低剂量组2.04
±
0.4542.7％
[0070]
实施例2
[0071]
参照实施例1，仅更改复合型虫草素制剂中各组分的配比：虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物的质量700mg：150mg：150mg，按高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组和空白对照组进行灌胃实验，结果如表3～表4所示。
[0072]
表3
[0073]
组别体重下降率(％)粪便硬度便血/潜血脱毛空白对照组0正常正常正常模型组22.9％正常正常正常高剂量组2.6％正常正常正常中剂量组5.4％正常正常正常低剂量组9.3％正常正常正常
[0074]
表4
[0075]
组瘤质量/g抑瘤率/％空白对照组0-模型组3.61
±
0.12-高剂量组0.55
±
0.6584.7％中剂量组1.22
±
0.1766.2％低剂量组2.01
±
0.4444.3％
[0076]
实施例3
[0077]
建立小细胞肺癌细胞株h69的斑马鱼脑转移和尾转移模型
[0078]
试验方法：
[0079]
1.鱼系杂交及后代培养
[0080]
将鱼系tg(flk-gfp)的雌雄鱼1:1放入同一交配盒中，插上隔板，将两条鱼隔开，饲养水温28℃，光照14l:10d，ph值6.5-7.5，第二天早上9点换水，拔板，让两条鱼交配，产卵，1-2个小时后収卵。将收到的卵分盘，50颗左右一皿，放入28℃培养，在收卵当天晚上每皿加入300μl左右ptu，抑制黑色素形成。每天换一次水，换水时注意加入ptu。2dpf(days post-fertilization)时挑荧光，留下表达flk-gfp的胚胎，即全身血管表达绿色荧光的胚胎，将未表达荧光的胚胎处死(冰上10min)，将flk-gfp胚胎从卵壳中剥离出来。
[0081]
2.细胞传代及培养tfrfp-b16-f10细胞
[0082]
将t25细胞培养瓶中的细胞用1ml pbs缓冲液洗一遍，弃去缓冲液，重复一次。加入1ml 37℃预热胰酶，消化2min或待显微镜下发现细胞全部变圆，加入等量完全培养液终止消化，用移液枪轻轻地将消化好的细胞吹打下来，移入15ml离心管中，室温下1000r/min离心5min，弃去上清液，用1ml完全培养液轻轻吹打细胞，混匀，吸取部分细胞悬液至新的细胞培养瓶中，加入4ml新鲜培养液，轻轻摇匀，置于37℃，5％co2培养箱培养。
[0083]
3.高致瘤性细胞培养h69细胞
[0084]
准备好fibrinogen,thrombin。置于冰上溶解30min，t7 buffer以及e3胚胎培养基、胰酶等置于37℃水浴锅预热；枪头以及培养板放置于超净工作台内紫外灭菌，一般uv照射30min。将tfrfp-b16-f10细胞用pbs润洗一次，加入1ml胰酶消化2min(37℃)，尔后2ml e3胚胎培养基中和，1600r/min，离心2min，得沉淀，弃上清。沉淀以1ml培养基重悬。
[0085]
4.细胞显微注射
[0086]
使用显微注射仪，将约200个h69细胞注射到2dpf(受精后的两天)斑马鱼卵周间隙处，等到3dpf使用荧光显微镜观察斑马鱼卵中h69细胞的脑转移和尾转移情况。统计结果包括脑转移和尾转移的数量之和。
[0087]
如表5所示，设置分组control(生理盐水)、cispt组(0.9mg cispt)和虫草素制剂组(10mg虫草素制剂，0.25mg/ml)，观察0-3dpt期间h69细胞脑转移和尾转移行为。
[0088]
其中，虫草素制剂组为按照虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物的质量比70：15：15称取各组分，混合后溶于生理盐1l水中，浓度为0.25mg虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物/ml水。
[0089]
实验结果：
[0090]
表5
[0091][0092]
如图1和图2以及表5所示，顺铂组和虫草素制剂组均能有效抑制h69细胞在斑马鱼中的脑转移和尾转移，但虫草素制剂组的效果明显优于顺铂组。.
[0093]
对比例1
[0094]
同实施例2，仅更改复合型虫草素制剂中各组分的配比，分别在高剂量组下测定其抑瘤率，结果如表6所示。
[0095]
表6
[0096]
虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物的质量瘤质量/g抑瘤率/％模型组3.61
±
0.12-150mg：700mg：150mg0.99
±
0.4672.6％150mg：150mg：700mg0.85
±
0.3876.5％
[0097]
对比例2
[0098]
同实施例2，仅更改复合型虫草素制剂中各组分的配比，分别在高剂量组下测定其抑瘤率，结果如表7和表8所示。
[0099]
表7
[0100][0101]
表8
[0102][0103]
从上述实施例和对比例可以看出，本发明在同时采用虫草素、红豆杉提取物、龙葵提取物(质量比为750mg：30mg：220mg，或700mg：150mg：150mg)时，三者间存在协同作用，不仅可以减少肿瘤药物的副反应，还可以大幅度提高抑瘤率。
[0104]
实施例4：毒性试验
[0105]
(1)急性毒性试验
[0106]
实验方法：设6个实验组和1个对照组，分别对应复合型虫草素制剂(虫草素750mg：红豆杉提取物30mg：龙葵提取物220mg)/鼠体重的15g/kg、12g/kg、9g/kg、6g/kg、3g/kg和0k/kg。溶于生理盐水制成灌胃液。每组10只小鼠进行灌胃实验。24h灌胃两次，灌胃前动物禁食过夜，自由饮水。灌胃后给予正常饮食，观察14天，记录中毒特征和死亡情况。
[0107]
实验现象：15g/kg复合型虫草素制剂单次喂养会造成小鼠死亡率为20％，其余小组均无死亡情况。15g/kg复合型虫草素制剂所对应的组小鼠会出现水样便稀，食欲不振的情况。其余小鼠均大便正常，并且活跃度及进食情况高于对照组。
[0108]
实验结果：复合型虫草素制剂对小鼠经口单次剂量给药量最小致死量(mld)为15g/kg(相当于人等效剂量2.38g/kg)，最大药物耐受量(mid)》12g/kg(相当于人体剂量的
2.14g/kg)。复合型虫草素制剂的ld50大于15g/kg，远远高于oecd急性相关原则所规定的2000mg/kg。因此复合型虫草素制剂严重急性中毒的危险性。
[0109]
(2)慢性毒性实验
[0110]
实验方法：连续三个月给与复合型虫草素制剂于小鼠，观察小鼠产生的毒性反应及其严重程度，主要毒性靶器官及损害情况。
[0111]
设置复合型虫草素制剂高剂量组(80mg/kg，拟临床用量的20倍)，中剂量组(40mg/kg，拟临床用量的10倍)，低剂量组(20mg/kg，拟临床用量的5倍)，对照组(生理盐水)。灌胃给药，每日一次，给药13周。
[0112]
实验结果：在给药期间，小鼠外观特征、行为活动、粪便性状以及摄食量并未见明显异常。长期给与虫草素对大叔体重无影响。小鼠的血液指标没有显著变化，高中剂量复合型虫草素制剂可导致大叔血清中的ast及显著降低，因asy值低于只是肝功能正常，所以血清的ast也正常，并不会对小鼠的肝肾功能造成的毒害作用。
[0113]
本发明提供了一种复合型虫草素制剂及其制备方法与在制备抗小细胞肺癌产品中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。