1.本发明涉及一种植物提取技术领域，具体是一种从甜茶中同时制备甜茶苷、总氨基酸和多糖的方法。
背景技术：
2.甜茶(rubus suavissimus s.lee)是蔷薇科悬钩子属多年生落叶灌木，主要分布在广西、云南、四川和湖南等地。甜茶含有多种有效成分，主要有蛋白质、总氨基酸、维生素、甜茶多酚、总黄酮、甜茶苷、多糖、矿物质等。其中蛋白质及总氨基酸占干甜茶重量的11.8％-12.6％，且含有人体必需的8种总氨基酸，其中总氨基酸的含量在4.5％左右；甜茶苷占甜茶叶干重的1.5％左右，同时甜茶中也含有丰富的多糖。甜茶总氨基酸具有抗氧化、提高免疫力等功效，多糖则在神经保护、保肝和抗衰老方面发挥着重要作用，甜茶苷作为一种非糖类天然甜味剂，在市场上的应用前景更为广泛。
3.专利cn201810688181.x公开了从甜茶中提取茶氨酸以及同时提取甜茶苷和茶多酚的方法，该方法通过水提、水提液依次通过大孔树脂、聚酰胺树脂、离子交换树脂，收集流出液分别制得茶氨酸、甜茶苷和茶多酚3种有效成分。此发明方法实现了甜茶资源综合利用，可操作性强，成本低，污水排放量少，适于工业化生产。
4.专利cn200910244874.0公开了一种超滤膜分离甜茶多糖的方法，该方法中甜茶经过水或者含水醇提取后，浸提液通过离心、微滤膜过滤两步纯化过程后通过两种规格的超滤膜超滤，截留液进行减压浓缩使甜茶多糖与杂质分离。该方法仅从提取多糖为目的，原料没有得到合理利用，其中应用最为广泛的甜茶苷未被合理利用，造成了原料的大量浪费。
5.专利cn201510700707.8公开了一种同时制备甜茶甙和甜茶总多酚的工艺，该方法中使用大孔树脂对提取液进行富集，分段分离出黄酮、多酚及甜茶素，即可得3种产品，该方法在提取甜茶叶主要活性成分甜茶甙的同时获取甜茶多酚，提高了甜茶的综合利用。
6.综上，在目前的工艺中，鲜有看到甜茶总氨基酸、多糖的提取工艺，并且在制备甜茶苷的同时，对甜茶叶中的总氨基酸、多糖进行制备还未见报道，因此本发明提出一种从甜茶中同时制备甜茶苷、总氨基酸和多糖的方法，同时对甜茶苷、总氨基酸和多糖进行制备。
技术实现要素：
7.本发明的目的在于提供一种从甜茶中同时制备甜茶苷、总氨基酸和多糖的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种从甜茶中同时制备甜茶苷、总氨基酸和多糖的方法，方法步骤如下：
10.步骤一：酶解提取，将甜茶粗粉原料加入缓冲液中，加入酶制剂，然后进行提取，提取完成后，分离提取渣和滤液，滤液备用；
11.步骤二：总氨基酸的制备，将步骤一中的滤液通过阳离子交换树脂，收集柱流出液，然后使用水、碱醇进行洗脱，收集碱醇洗脱液，通过膜分离技术进一步纯化，制得总氨基
酸提取物；
12.步骤三：甜茶多糖的制备，将步骤二中的柱流出液和水洗脱液合并，通过活性炭柱，分别使用水、含水醇溶液洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醇沉即可制备甜茶多糖；
13.步骤四：甜茶苷的制备，将步骤三中含水醇洗脱液浓缩去醇，制成水相后通过聚酰胺树脂柱，分别使用水、含水醇洗脱，收集含水醇洗脱液并干燥，即可制得甜茶苷提取物。
14.作为本发明进一步的方案：所述步骤一中甜茶粉碎后过10-24目筛，提取条件为在恒温振荡仪中或者恒温搅拌罐中提取，原料与缓冲液的比例为1:6-10，提取温度50-65℃，提取时间1-2h，提取次数1-2次，振荡/搅拌频率为60-150次/min。
15.作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸-磷酸钠中的一种，ph为5-6.5，酶制剂为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶中的1种或2种，酶制剂的加入量为原料重量的0.5％-2％。
16.作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中分离使用离心机，转速为3000-5000r/min。
17.作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中阳离子交换树脂选用d001、hd52、d061中的一种或两种，阳离子交换树脂预处理的方法为先用纯水洗至流出液无色，再分别使用10％盐酸浸泡4h、纯水洗至ph稳定后，5％naoh浸泡4h、纯水洗至ph值稳定即可使用，径柱比为1:4-8，上柱液的用量为4-8bv，上柱流速为0.8-1.5bv/h，水洗脱液用量为1.5-3bv，洗脱流速为1-2bv/h，上述碱醇的ph为8-9，所用的碱为氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠，醇为60％-70％的乙醇(v/v)，洗脱流速为1-2bv/h，用量为3-5bv。
18.作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中膜分离技术选用的超滤膜为集束中空纤维膜、卷式膜，截留分子量为1000-20000。
19.作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中活性炭选用颗粒活性炭、粉末状活性炭，其中粉末活性炭需与硅藻土以1:1-2混合使用，粉末状活性炭选用椰壳、果壳、木质活性炭中的一种，装柱径柱比为1:6-10，上柱流速为0.8-1.5bv/h，上柱量为5-8bv，水洗脱流速为1-2bv/h，洗脱量为2-4bv，所述含水醇中醇的体积含量为60％-75％，洗脱流速为0.8-2bv/h，洗脱量为3-6bv。
20.作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中醇沉中使用的醇为95％乙醇、无水乙醇的一种，乙醇加入至溶液中直至含有乙醇的量为75％-85％，醇沉的次数为1-3次，沉淀溶剂为75％-85％乙醇溶液，醇沉时间为8-24h。
21.作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中聚酰胺柱的径柱比为1:5-8，加水稀释上柱液直至其中含有甜茶苷浓度为1.5-4mg/ml，上柱流速为0.5-1.5bv/h，上柱量为3.5-6bv，水洗脱流速为1-2bv/h，洗脱量为1-2.5bv，所述含水醇为70％-85％乙醇溶液，洗脱流速为1-3bv/h，洗脱量为2-4bv。
22.作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中干燥方式为喷雾干燥。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.1、本发明使用纤维素酶进行水解，可以破坏植物细胞壁，促使有效成分更易进入溶剂中，提高提取效率，节约能源，降低生产成本。
25.2、本发明合理使用分离介质，提取液首先经过阳离子交换树脂进行吸附，可以大大提高氨基酸的回收率和收率。
26.3、经阳离子交换树脂吸附氨基酸后的上柱流出液及水洗脱液经过活性炭柱后，不仅可以利用活性炭的吸附作用去除农残重金属等外源性污染物，而且活性炭是一种非极性的吸附剂，作为分离材料使用时，一方面可以初步分离多糖，另一方面可以对甜茶苷进行分离。
27.4、现有技术大都使用大孔树脂柱加阴阳离子树脂柱联合其他纯化方式提取分离得到甜茶苷，步骤复杂，损耗率高，本发明仅通过活性炭柱加聚酰胺柱即可得到高含量无农残重金属的甜茶苷提取物，回收率高，步骤简单，易操作。
28.5、本发明提供了一种同时制备三种有效成分的方法，充分利用资源，整个过程不涉及有害试剂的使用，绿色环保，分离介质均可回收利用，生产周期短，工业化制备简易，所制得产品应用广泛。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.本发明实施例中，一种从甜茶中同时制备甜茶苷、总氨基酸和多糖的方法，方法步骤如下：
31.步骤一：酶解提取，将甜茶粗粉原料加入缓冲液中，加入酶制剂，然后进行提取，提取完成后，分离提取渣和滤液，滤液备用；
32.步骤二：总氨基酸的制备，将步骤一中的滤液通过阳离子交换树脂，排出柱流出液，然后使用水、碱醇进行洗脱，收集碱醇洗脱液，通过膜分离技术进一步纯化，制得总氨基酸提取物；
33.步骤三：甜茶多糖的制备，将步骤二中的柱流出液和水洗脱液合并，通过活性炭柱，分别使用水、含水醇溶液洗脱，收集水洗脱液，浓缩，醇沉即可制备甜茶多糖；
34.步骤四：甜茶苷的制备，将步骤三中含水醇洗脱液浓缩去醇，制成水相后通过聚酰胺树脂柱，分别使用水、含水醇溶液洗脱，收集含水醇洗脱液并干燥，即可制得甜茶苷提取物。
35.步骤一中甜茶粉碎后过10-24目筛，提取条件为在恒温振荡仪中或者恒温搅拌罐中提取，原料与缓冲液的比例为1:6-10，提取温度50-65℃，提取时间1-2h，提取次数1-2次，振荡/搅拌频率为60-150次/min。
36.步骤一中缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸-磷酸钠中的一种，ph为5-6.5，酶制剂为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶中的1种或2种，酶制剂的加入量为原料的0.5％-2％。
37.步骤一中分离使用离心机，转速为3000-5000r/min。
38.步骤二中阳离子交换树脂选用d001、hd52、d061中的一种或两种，阳离子交换树脂预处理的方法为先用纯水洗至流出液无色，再分别使用10％盐酸浸泡4h、纯水洗至ph稳定后，5％naoh浸泡4h、纯水洗至ph值稳定即可使用，径柱比为1:4-8，上柱液的用量为4-8bv，上柱流速为0.8-1.5bv/h，水洗脱液用量为1.5-3bv，洗脱流速为1-2bv/h，上述碱醇的ph为
8-9，所用的碱为氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠，醇为60％-70％的乙醇(v/v)，洗脱流速为1-2bv/h，用量为3-5bv。
39.步骤二中膜分离技术选用的超滤膜为集束中空纤维膜、卷式膜，截留分子量为1000-20000。
40.步骤三中活性炭选用颗粒活性炭、粉末状活性炭，其中粉末活性炭需与硅藻土以1:1-2混合使用，粉末状活性炭选用椰壳、果壳、木质活性炭中的一种，装柱径柱比为1:6-10，上柱流速为0.8-1.5bv/h，上柱量为5-8bv，水洗脱流速为1-2bv/h，洗脱量为2-4bv，所述含水醇溶液中醇的体积含量为60％-75％，洗脱流速为0.8-2bv/h，洗脱量为3-6bv。
41.步骤三中醇沉中使用的醇为95％乙醇、无水乙醇的一种，乙醇的加入至溶液中直至含有乙醇的量为75％-85％，醇沉的次数为1-3次，沉淀溶剂为75％-85％乙醇溶液，醇沉时间为8-24h。
42.步骤四中聚酰胺的径柱比为1:5-8，加水稀释上柱液直至其中含有甜茶苷浓度为1.5-4mg/ml，上柱流速为0.5-1.5bv/h，上柱量为3.5-6bv，水洗脱流速为1-2bv/h，洗脱量为1-2.5bv，所述含水醇溶液为70-85％乙醇溶液，洗脱流速为1-3bv/h，洗脱量为2-4bv。
43.步骤四中干燥方式为喷雾干燥。
44.实施例一：
45.步骤一：取粉碎过24目筛的甜茶叶50g，依次加入500ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.25g纤维素酶，调节ph为5，置于50℃恒温振荡仪中以60次/min的频率，保持1h，完成后以3000r/min离心，收集上清液。
46.步骤二：d001阳离子交换树脂以径柱比1:4装柱，预处理后备用，取步骤一种上清液以0.8bv/h流速通过阳离子交换树脂，上样量为4bv，上样完成后，先用1.5bv的纯水以1bv/h的流速进行洗脱，再使用氨水调节ph为8的60％乙醇溶液进行洗脱，流速为1bv/h，洗脱量为3bv，分别收集柱流出液、水洗脱液及碱醇洗脱液。将上述碱醇洗脱液以5000r/min离心后取上清液，上清液依次通过截留分子量为10000、1000的中空纤维膜，收集浓缩液，喷雾干燥得总氨基酸，称重为2.1g，采用茚三酮法进行测定总氨基酸含量。
47.测定结果：粉末中总氨基酸的含量为89.9％，回收率为91.25％。
48.步骤三：将步骤二中的柱流出液和水洗脱液合并后，以1.5bv/h的流速通过径柱比为1:6的经过预处理的颗粒活性炭柱，上柱量为5bv，上柱流速为0.8bv/h,吸附完成后，分别使用水和70％乙醇进行洗脱，水洗脱量为2bv，洗脱流速为1bv/h，60％乙醇洗脱量为3bv，洗脱流速为0.8bv/h，分别收集水洗脱液和60％乙醇洗脱液。将上述水洗脱液浓缩至原液体积的40％后加入95％乙醇至溶液中乙醇含量为75％，搅拌均匀后，放置12h，过滤，收集沉淀，干燥后得到1.12g粗多糖，将上述沉淀用150ml水溶解后加95％乙醇至溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后放置18h，过滤，收集沉淀，干燥得到0.76g多糖，经过苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。
49.测定结果：粉末中多糖的含量为90.25％。
50.步骤四：步骤三中70％乙醇洗脱液浓缩去醇，加水稀释至其中甜茶苷的含量为1.5mg/ml，以0.5ml/min的流速通过径柱比为1:5的聚酰胺树脂柱，上样量为3.5bv，吸附完成后，分别使用水、70％乙醇进行洗脱，水洗脱液用量为1bv，流速为1bv/min，70％乙醇用量为2bv，流速为1bv/min，收集70％乙醇洗脱液，浓缩干燥得甜茶苷0.98g，经hplc测定甜茶苷
含量。
51.测定结果：甜茶苷含量为89.26％。
52.实施例二：
53.步骤一：取粉碎过10目筛的甜茶叶1kg，依次加入10l醋酸-醋酸钠缓冲液，5g纤维素酶及6g果胶酶，调节ph为6，置于65℃恒温振荡仪中以100次/min的频率，保持1.5h，完成后以4000r/min离心，收集上清液。
54.步骤二：d061阳离子交换树脂以径柱比1:6装柱，预处理后备用，取步骤一上清液以1.5bv/h流速通过阳离子交换树脂，上样量为8bv，上样完成后，先用3bv的纯水以2bv/h的流速进行洗脱，再用ph为9的含氢氧化钠的60％乙醇溶液进行洗脱，流速为2bv/h，洗脱量为5bv，分别收集柱流出液、水洗脱液及碱醇洗脱液。将上述碱醇洗脱液以5000r/min离心后取上清液，上清液依次通过截留分子量为20000、2000的中空纤维膜，收集浓缩液，喷雾干燥得总氨基酸，称重为40.6g，采用茚三酮法进行测定总氨基酸含量。
55.测定结果：粉末中总氨基酸的含量为87.8％，回收率为93.25％。
56.步骤三：将步骤二中的柱流出液和水洗脱液合并后，以1.5bv/h的流速通过径柱比为1:8的经过预处理的粉末活性炭柱(粉末活性炭：硅藻土＝1:1)，上柱量为8bv，吸附完成后，分别使用水和70％乙醇进行洗脱，水洗脱量为4bv，洗脱流速为2bv/h，70％乙醇洗脱量为6bv，洗脱流速为1.5bv/h，分别收集水洗脱液和70％乙醇洗脱液。将上述水洗脱液浓缩至原液的40％后加入95％乙醇至溶液中乙醇含量为80％，搅拌均匀后，放置12h，过滤，收集沉淀，干燥后得到22.57g粗多糖，将上述沉淀用水溶解后加95％乙醇至溶液中乙醇浓度为85％，搅拌均匀后放置12h，过滤，收集沉淀，干燥得到20.38g多糖，经过苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。
57.测定结果：粉末中多糖的含量为92.16％。
58.步骤四：将步骤三中70％乙醇洗脱液浓缩去醇，加水稀释至溶液中含有甜茶苷为4mg/ml，以1.5ml/min的流速通过径柱比为1:8的聚酰胺树脂柱，上样量为6bv，吸附完成后，分别使用水、70％乙醇进行洗脱，水洗脱液用量为2.5bv，流速为2bv/min，70％乙醇用量为4bv，流速为3bv/min，收集70％乙醇洗脱液，浓缩干燥得甜茶苷19.38g，经hplc测定甜茶苷含量。
59.测定结果：甜茶苷含量87.79％。
60.实施例三：
61.步骤一：取粉碎过10目筛的甜茶叶500kg，依次加入4000l磷酸-磷酸钠缓冲液，5kg半纤维素、3.5kg纤维素酶，调节ph为6，置于50℃回流搅拌罐中，搅拌的速率为60次/min，保持2h，完成后以4000r/min离心，收集上清液。
62.步骤二：d001阳离子交换树脂以径柱比1:6装柱，预处理后备用，取步骤一上清液以1bv/h流速通过阳离子交换树脂，上样量为6bv，上样完成后，先用2bv的纯水以1.5bv/h的流速进行洗脱，再用ph为8.5含氨水的65％乙醇溶液进行洗脱，流速为1.5bv/h，洗脱量为4bv，分别收集柱流出液、水洗脱液及碱醇洗脱液。将上述碱醇洗脱液以4000r/min离心后取上清液，上清液依次通过截留分子量为10000、1000的中空纤维膜，收集浓缩液，喷雾干燥得总氨基酸，称重为23.58kg，采用茚三酮法进行测定总氨基酸含量。
63.测定结果：粉末中总氨基酸的含量为为90.18％，回收率为90.18％。
64.步骤三：将步骤二中的柱流出液和水洗脱液合并后，以1bv/h的流速通过径柱比为1:8的经过预处理的颗粒活性炭柱，上柱量为7bv，上柱流速为1bv/h，吸附完成后，分别使用水和70％乙醇进行洗脱，水洗脱量为3bv，洗脱流速为1.5bv/h，70％乙醇洗脱量为5bv，洗脱流速为1bv/h，分别收集水洗脱液和60％乙醇洗脱液。将上述水洗脱液浓缩至原液的40％后加入95％乙醇至溶液中乙醇含量为80％，搅拌均匀后，放置12h，过滤，收集沉淀，干燥后得到12.31kg粗多糖，将上述沉淀用水溶解后加95％乙醇至溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后放置24h，过滤，收集沉淀，干燥得到10.26kg多糖，经过苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。
65.测定结果：粉末中多糖的含量为91.34％。
66.步骤四；将步骤三中70％乙醇洗脱液浓缩去醇，加水稀释至其中甜茶苷的含量为3.1mg/ml，以1ml/min的流速通过径柱比为1:6的聚酰胺树脂柱，上样量为5bv，吸附完成后，分别使用水、70％乙醇进行洗脱，水洗脱液用量为1.5bv，流速为1.5bv/min，70％乙醇用量为3bv，流速为2bv/min，收集70％乙醇洗脱液，浓缩干燥得甜茶苷10.28kg，经hplc测定甜茶苷含量。
67.测定结果：甜茶苷含量88.87％。
68.通过实施例一到三可得，本发明可以极大限度的同时对甜茶苷、总氨基酸和多糖进行提取制备。
69.尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。