一种多功能的益生菌组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种多功能的益生菌组合物及其应用。


背景技术：

2.抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea，aad)是指伴随着抗生素的使用而发生，且无法用其他原因解释的腹泻。而酒精性胃溃疡是一种常见的急性胃损伤疾病，经口摄入大量酒精会直接损害胃黏膜上皮细胞，破坏胃黏膜屏障，引起急性胃黏膜充血、糜烂甚至浅表性溃疡。酒精性胃溃疡的病理过程一般涉及炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等几个方面。
3.现有技术中，针对上述疾病的治疗或预防已有不少的解决方案，比如通过益生菌达到治疗或预防的目的。
4.如已公布的针对抗生素性腹泻的现有技术中，cn 112057479 a公开了一种能够缓解抗生素引起腹泻的益生菌组合物，包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、两歧双岐杆菌、抗性糊精、麦芽糊精、菊粉和水苏糖，其中益生菌的种类比较多而成本更高。
5.已公布的针对酒精性胃溃疡的现有技术中，与cn 110731432 a公开了一种海藻益生元护胃饮料及其制备方法，包括以下质量分数的原料：20-30份海藻酸钠、13-25份瓜尔胶提取物、5-15份海藻提取物、1-6份瓜尔胶、80-100份白砂糖、1-8份柠檬酸、5-20份浓缩山楂汁及800-1000份软水。但是其功能过于单一。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种多功能的益生菌组合物，通过调整益生菌或益生元的种类或者数量，借助多种中草药(或其提取物)辅助增强益生菌的效应，降低成本同时确保疗效，除针对抗生素性腹泻和预防酒精性胃溃疡，还可发挥抑癌/缓解炎症性肠病等效应。
7.为解决上述技术问题，本发明提供一种多功能的益生菌组合物，包括益生菌粉、益生元粉和中草药材料；其中，益生菌粉由嗜酸乳杆菌，乳双歧杆菌，副干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌组成，益生元粉包括低聚果糖粉，低聚半乳糖粉，中草药材料包括蛹虫草(提取物)，香菇(提取物)和姜黄。
8.对于各组分的含量，优选地，每15g益生菌组合物中，包括：
9.嗜酸乳杆菌22-24亿cfu，乳双歧杆菌42-44亿cfu，副干酪乳杆菌18-20亿cfu，鼠李糖乳杆菌14-16亿cfu，总菌量100亿cfu；
10.低聚果糖粉(95s)10-12g，低聚半乳糖粉(57s)1-1.5g；蛹虫草提取物0.2-0.4g，香菇提取物0.2-0.4g，姜黄0.1-0.3g。
11.更优选地，每15g益生菌组合物中，包括：
12.嗜酸乳杆菌23亿cfu，乳双歧杆菌43亿cfu，副干酪乳杆菌19亿cfu，鼠李糖乳杆菌
15亿cfu；
13.低聚果糖粉12g，低聚半乳糖粉1.33g；
14.蛹虫草提取物0.3g，香菇提取物0.3g，姜黄0.2g。
15.蛹虫草提取物，生产批号：zlsc2020111303；
16.蛹虫草提取物，生产批号：zlyt2021110402；
17.香菇提取物，生产批号：zlyt2021120101；
18.上述提取物中，蛹虫草提取物、香菇提取物采购自南京泽朗生物科技有限公司，姜黄采购自珠海雅富兴源食品工业有限公司。
19.本发明中，益生菌具体为嗜酸乳杆菌ncfm，乳双歧杆菌hn019，副干酪乳杆菌lpc37，鼠李糖乳杆菌hn001。
20.本技术中各组分的功效：
21.(1)益生菌
22.1)嗜酸乳杆菌：嗜酸乳杆菌是最常用的益生菌之一，已长期应用于多种发酵食品中，且不良反应较少。已有研究提示嗜酸乳杆菌在抗炎抗氧化方面发挥作用，可通过抑制氧化应激和降低炎症反应减轻动脉粥样硬化病变的形成；服用嗜酸乳杆菌有助于降低胆固醇水平；此外还可预防和减少与各种疾病相关的腹泻。
23.2)乳双歧杆菌：双歧杆菌是肠道内的重要细菌，目前已经发现并测序出72种双歧杆菌亚种，其中已有多种类型，包括乳双歧杆菌被证明是存在于哺乳动物消化道内的主要双歧杆菌亚种，在肠道功能乃至人体稳态方面发挥着重要作用，具有改善胃肠道功能和预防疾病的诸多功能。
24.3)副干酪乳杆菌：副干酪乳酸菌是一种革兰氏阳性异型发酵乳酸菌，可以从人体肠道、口腔以及青贮饲料和各种乳制品当中分离出来，是一种兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌。研究提示，副干酪乳杆菌可平衡肠道菌群，治疗肠易激综合征患者；并对多种常见食源性致病菌具有较强抑制作用。此外也具有降血压、降胆固醇和抗肿瘤效应。
25.4)鼠李糖乳杆菌：鼠李糖乳杆菌是一种常见益生菌，具有耐胃酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。已有研究表明鼠李糖乳杆菌在人类胃肠道中具有良好的黏附及定植能力。可通过增强肠道屏障功能，提高对肠黏膜的附着力，抑制病原体的黏附，竞争性排斥病原微生物，产生抗菌素样物质，调节机体免疫系统等机制，预防和治疗各种胃肠道微生态失调相关疾病，如抗生素相关性腹泻、幽门螺旋杆菌感染、感染性腹泻和炎症性肠病等。此外还具有抑肿瘤效应。
26.(2)益生元
27.1)低聚果糖粉：低聚果糖作为典型的益生元和优良的水溶性膳食纤维，是一种符合当代健康理念的新型糖原，广泛存在于多种水果、蔬菜中。低聚果糖具有多种生物活性，在调节人体肠道菌群促进有益菌生长、促进矿物质吸收、增强人体免疫力、降低胆固醇和血糖值、调节肠道功能促进肠胃蠕动、抑制结肠癌的发生方面具有明显作用。
28.2)低聚半乳糖粉：低聚半乳糖作为一种益生元在功能性食品方面应用越来越广泛。低聚半乳糖能够在肠道内选择性增殖益生菌发酵生成短链脂肪酸，与肠道微生物协同参与生理功能机制调节，在保障肠道健康、免疫系统调节、抑制肿瘤细胞生成、改善人体矿物质吸收、改善心血管疾病等机制方面发挥重要作用。
29.(3)中草药材料
30.1)蛹虫草：蛹虫草又被称为北冬虫夏草，真菌界子囊菌亚门肉座菌目麦角菌科，该物种是虫草属的模式种，是一种虫菌结合的食药用真菌，具有丰富的营养价值和药用价值，可作为冬虫夏草的替代品之一。其主要活性成分为虫草素、虫草酸及多糖等。
31.其中虫草素的含量虽然甚低，但生物活性却极为广泛，研究发现其具有抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、调节人体免疫功能、降低血糖和血脂等效应。
32.蛹虫草多糖是蛹虫草中含量较高的活性物质之一，作为一种多糖类化合物，主要是由半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖等单糖组成。蛹虫草多糖是一种良好的免疫促进物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、增强免疫、调节血糖等功效。
33.2)香菇：香菇是侧耳科香菇属的担子菌，含有多种有效药用组分，是丰富的药用来源，可用于治疗各种疾病。近年来多项研究表明复合的香菇提取物具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤以及调节免疫功能等多项生物功能，因此可用于肿瘤的辅助治疗和免疫调节等。有研究提示其对糖尿病的辅助治疗也有作用。
34.3)姜黄：姜黄是姜科植物姜黄的根茎，多产于四川、福建、广东、江西等省。姜黄味苦、辛，性温，归肝、脾经，具有行气破淤、通经止痛的功效，因此常用于胸腹胀痛、肩臂痹痛、心痛难忍，产后血痛、闭经等多种疾病的临床治疗。姜黄素是中药姜黄中提取的一种亲脂性多酚，亦具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用。姜黄在神经炎症疾病、炎症性肠病、恶性肿瘤、风湿性疾病、感染性疾病、动脉粥样硬化和心肌梗死中表现出较好的治疗潜力。近年来已有多项研究提示，联用姜黄与益生菌或益生元可辅助调节肠道菌群，协助增强机体免疫力。
35.与现有技术相比，本发明的技术方案中，调整了益生元种类，且减少了益生菌种类数量，本发明相对于现有技术中的五联益生菌产品减少至四联益生菌产品，通过采用更少的益生菌种类同时借助多种中草药材料辅助增强益生菌的效应，降低了成本但确保了疗效；同时，通过增加与益生菌和中草药材料的联用，有助于提高防治酒精性胃溃疡的效应；此外，除针对抗生素性腹泻和预防酒精性胃溃疡，本发明还可发挥抑癌等效应。
附图说明
36.图1为模型构建中抗生素处理组和生理盐水组小鼠体重增长的变化图；
37.图2为小鼠抗生素性腹泻模型构建中抗生素处理组和生理盐水组第一天至第五天的粪便的变化图；
38.图3为模型构建中抗生素处理组和生理盐水组的腹泻评分情况图；
39.图4为模型构建成功后应用生理盐水组和应用复合粉末组中小鼠处理过程中粪便的变化图；
40.图5为抗生素造模期间，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠体重变化量图；
41.图6为抗生素造模期间，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠第一至第五天粪便变化情况图；
42.图7为抗生素造模期间，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠腹泻评分情况图；
43.图8为本发明的复合粉末处理期间，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠第六至第九天粪便情况图；
44.图9为不同处理后，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠胃部溃疡程度图；
45.图10为不同处理后，a1组(持续应用生理盐水组)、a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)、b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)以及b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)4组小鼠血清mda检测结果图；
46.图11为不同浓度本发明的复合粉末的处理液处理24小时对hct116细胞的生长抑制曲线；
47.图12为不同浓度本发明的复合粉末的处理液处理48小时对mc38细胞的生长抑曲线。
具体实施方式
48.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
49.一种多功能的益生菌组合物，每15g益生菌组合物中，包括：
50.嗜酸乳杆菌22-24亿cfu，乳双歧杆菌42-44亿cfu，副干酪乳杆菌18-20亿cfu，鼠李糖乳杆菌14-16亿cfu，总菌量100亿cfu；
51.低聚果糖粉(95s)10-12g，低聚半乳糖粉(57s)1-1.5g；蛹虫草提取物0.2-0.4g，香菇提取物0.2-0.4g，姜黄0.1-0.3g。
52.本发明的优选实施例如下：
53.每15g益生菌组合物中，包括：
54.嗜酸乳杆菌23亿cfu，乳双歧杆菌43亿cfu，副干酪乳杆菌19亿cfu，鼠李糖乳杆菌15亿cfu；
55.低聚果糖粉12g，低聚半乳糖粉1.33g；
56.蛹虫草提取物0.3g，香菇提取物0.3g，姜黄0.2g。
57.实验验证：
58.整体的效应：
59.针对抗生素性腹泻的治疗和酒精性胃溃疡的预防：
60.(1)针对抗生素性腹泻：将小鼠分为a、b两组，采用生理盐水(a)或头孢呋辛(0.26g/kg)联合左氧氟沙星(0.20g/kg)(b)连续灌胃5天，构建并验证抗生素相关腹泻稳定的小鼠模型；明确建模成功后，将a、b两组小鼠分别随机再各分为两组(a1,a2,b1,b2)，采用生理盐水(a1,b1)或本发明的益生菌组合物的复合粉末(a2,b2)连续灌胃4天。期间观察小鼠的粪便情况、腹泻评分和体重变化，可见：
61.1)抗生素灌胃造模期间b组(抗生素组)小鼠表现为精神萎靡，与a组(生理盐水组)相比饮水量增加、饮食量减少、排便次数增加，体重增加明显较低(图1)。灌胃5天后b组(抗生素组)小鼠均出现腹泻现象，粪便逐渐变软，粪便大多数颜色明显变浅、粪便稀软，偶尔出现松散无定型，严重者可见肛门处有粪便黏附(图2)；腹泻评分可见b组(抗生素组)腹泻评分与a组(生理盐水组)相比显著增高(图3)。
62.2)使用生理盐水(a1,b1)或本发明的复合粉末(a2,b2)分别连续灌胃处理四天后，
①
与b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)相比，b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)小鼠粪便逐渐成型，变硬，而b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)小鼠四天后的粪便依旧很软、颜色浅，偶尔出现松散无定型(图4)，提示应用复合粉末可改善抗生素性腹泻；
②
与a1组(持续应用生理盐水组)相比，a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)粪便性状无明显变化(图4)，排便次数无明显增加，提示本发明的复合粉末对小鼠粪便性状和排便习惯无明显影响，不易引起腹泻等不良反应。
63.(2)针对酒精性胃溃疡：将小鼠分为a、b两组，采用生理盐水(a)或头孢呋辛(0.26g/kg)联合左氧氟沙星(0.20g/kg)(b)灌胃连续5天，构建并验证抗生素相关腹泻稳定的小鼠模型；明确建模成功后，将a、b两组小鼠分别随机分为两组(a1,a2,b1,b2)，采用生理盐水(a1,b1)或本发明的益生菌组合物的复合粉末(a2,b2)连续灌胃4天；期间观察小鼠的粪便情况、腹泻评分和体重变化。第9天用无水乙醇0.2ml灌胃，1h后取血检测mda，随后处死小鼠取胃组织，观察胃黏膜的改变并进行病理组织学分析。
64.1)抗生素灌胃造模期间，与a1/a2组(生理盐水组)相比，b1/b2组(抗生素组)小鼠表现为精神萎靡，饮水量增加、饮食量减少、排便次数增加，体重增加明显较低(图5)。灌胃5天后b1/b2组(抗生素组)小鼠均出现腹泻现象，粪便逐渐变软，粪便大多数颜色明显变浅、粪便稀软，偶尔出现松散无定型，严重者可见肛门处有粪便黏附(图6)；腹泻评分可见b1/b2组(抗生素组)腹泻评分与a1/a2组(生理盐水组)相比显著增高(图7)。
65.2)采用生理盐水(a1,b1)或本发明的益生菌组合物的复合粉末(a2,b2)连续灌胃4天。灌胃处理四天后，
①
与b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)相比，b2组(抗生素造模后应用复合粉末组)小鼠粪便逐渐成型，变硬，而b1组(抗生素造模后应用生理盐水组)小鼠四天后的粪便依旧很软、颜色浅，偶尔出现松散无定型(图8)；
②
与a1组(持续应用生理盐水组)相比，a2组(生理盐水处理后应用复合粉末组)粪便性状无明显变化，排便次数无明显增加(图8)。
66.3)无水乙醇灌胃处理后，取血检测mda，随后处死小鼠取胃组织，观察胃黏膜的改变并进行病理组织学分析。可见应用本发明的益生菌组合物的复合粉末进行预防性治疗的小鼠(a2,b2组)，大体上显示的溃疡程度低于生理盐水处理组(a1,b1)(图9)，且mda值低于生理盐水处理组(a1,b1)(图10)。
67.针对肠癌细胞的生长抑制效应
68.体外实验验证本发明的益生菌组合物的复合粉末对人源和鼠源结直肠癌细胞hct116和mc38的生长抑制效应
69.1.复合粉末处理液的配制
70.(1)取0.1g本发明的益生菌组合物的复合粉末加入20ml脑心浸出培养基中，厌氧培养箱培养48h后，离心机1000g转速离心10分钟，取上清液以0.22um滤过膜过滤获得复合
粉末培养液(主要为细菌培养上清液)；
71.(2)以取5g本发明的益生菌组合物的复合粉末溶解于20ml pbs中，完全溶解后以0.22um滤过膜过滤获得复合粉末溶解液；
72.(3)将复合粉末培养液与复合粉末溶解液按照1:1的体积比例混合配制成复合粉末处理液。
73.2.复合粉末处理液对结直肠癌细胞的生长抑制效应。
74.以不同体积比(0，5％，10％，15％，20％，30％)复合粉末处理液分别处理人源和鼠源结直肠癌细胞hct116和mc38 24或48小时，可见随复合粉末处理液浓度增加，对结直肠癌细胞生长抑制效应逐渐增强(图11-12)，因此可制备成胶囊靶向运送至直肠对直肠癌进行治疗。
75.结论：本发明的复合粉末处理可改善抗生素性腹泻情况，并对酒精性胃溃疡起预防作用，此外，还可抑制结直肠癌细胞的生长。
76.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。