促进骨形成的组合物和方法

背景技术：

1、骨形成和降解由负责骨形成的成骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞之间的生长因子信号传导严格地调控。将通过成骨细胞的骨形成与通过破骨细胞的降解相偶联近来已成为深入研究的主题；被鉴定为偶联因子的生长因子的列表不断扩大。将骨形成与骨再吸收相偶联需要成骨细胞和破骨细胞的募集以及同时其各自的祖细胞的募集。成骨细胞衍生自间充质干细胞(msc)，而破骨细胞衍生自作为髓系(myeloid-lineage)一部分的单核细胞；然而，msc或单核细胞如何从其在骨髓中的龛(niche)迁移到新骨形成部位仍然是未知的。目前对骨形成的空间和时间调控的理解提出，msc从其骨髓龛迁移至骨内膜(endosteal)表面；在此msc分化成产生新骨的成骨细胞。同时，单核细胞也从其骨髓龛中迁移至骨内膜表面；随后其在此分化成再吸收骨的破骨细胞。已知调节骨形成的生长因子包括tgfβ-、bmp-和典型wnt-配体。来自单核细胞前体的破骨细胞和骨再吸收通过mscf、opg和rank-配体的表达进行调控。同时，tgfβ-、bmp-和非典型wnt-配体的表达也调控破骨细胞活性。然而，包括tgfβ-、bmp-和wnt-配体的参与组织形成(patterning)的许多发育生长因子促进骨形成和再吸收。健康骨骼的维护需要不断的重塑，其中骨骼被连续地制造和破坏。

2、将植入物引入骨骼中引起生化级联反应，其驱动部分由巨噬细胞活性介导的促炎性应答，所述巨噬细胞衍生自髓系，并且可有助于骨骼或移植材料的降解。目前对植入物和移植材料进行选择，以使巨噬细胞应答最小化，同时使骨传导达到最佳并促进骨植入物的整合最大化。或者，作为提高骨骼整合的手段，已经采用了引入具有植入物的自体移植或者使用灭活骨组织植入物(自体移植)，来与植入物的材料性质相呼应；然而，这些途径经常是成问题的。理论上，材料可以被设计为既是自组织也是自组装的。

3、作为在创伤骨科操作中或在常规脊柱融合术操作中采用的辅助治疗方法，骨形成代表了在矫形外科手术中的持续挑战。特别地，这些辅助的骨生成疗法试图在外科手术介入部位提高健康骨骼的生长，同时减少骨骼的愈合时间。在过去的几十年中，已经进行了许多尝试，以使用多种具有成骨能力的生长因子，包括骨形态发生蛋白(bmp)。遗憾的是，旨在产生骨骼的基于bmp的疗法也带有患者的肿瘤发生的风险，尤其是那些可能经过x射线治疗或者具有初期未经检测的肿瘤的患者。进而，基于bmp的疗法无法用在具有活跃的肿瘤的患者中，这是特别遗憾的，因为这些患者在外科手术介入期间可显著得益于增加骨形成的疗法。

4、在矫形外科和骨骼愈合中，受损骨折的愈合继续表现出显著的挑战。已经报道有高达5-20％的骨折不愈合率。进展成不愈合的患者的治疗相关的发病率和成本可能相当可观。每年遇到的6,200,000例骨折中的大约10％难以愈合。存在多种帮助加速骨骼愈合的选择，其具有未经证实的疗效。髂嵴骨(iliac crest bone)移植仍被看作最可靠的方法(金标准)，但是其具有与获取部位并发症相关的显著问题。基于生长因子(包括血小板源性生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和甲状旁腺素(pth))的疗法在细胞培养研究中已经显示出初步的成功；但是，在临床应用中其疗效仍然未经证实。另外的选择，如骨形态发生蛋白-2(bmp2)和bmp7，已在加速具有骨干骨折的骨折愈合中显示取得了成功。然而，存在与使用bmp相关的风险，包括增加的感染、增加的肿瘤生长风险和增加的局部骨质溶解的风险。多种与包括bmp的治疗有关的风险还排除了对具有其他病理学的患者使用bmp。

5、当处理复杂的矫形问题比如脊柱融合、骨折愈合和管理骨折不愈合时，作为矫形外科手术中的辅助，提高骨形成而不提高肿瘤生长风险的治疗能力是目前商业可用的生物制剂的限制。

6、在创伤骨科领域中，尤其是具有大的缺损和不愈合的开放性骨折，自体/同种异体骨移植是第一位的治疗选择。然而，作为最可靠方法使用以实现骨形成的自体获取骨移植，具有感染和供体部位疼痛的风险。当少见地使用其他同种异体骨移植替代物时，其显示出较差的愈合。对于脊柱外科手术而言，当使用这些移植选择以实现融合时，存在相同的限制。

7、来自尸体源的皮质骨和松质骨适合填充空间，并且主要是骨传导的，而没有显著的骨诱导能力。因此，用生物制剂，如pdgf、vegf和bmp来提高愈合或脊柱融合的速度，并且其应用增加了治疗费用。然而，这些生物疗法在一系列细胞表型的发育期间刺激了增殖，这代表了固有的不可接受的肿瘤风险。

8、脱钙骨基质和磷酸钙替代物在促进骨骼愈合中并未显示出高的疗效，并且由于制造成本还具有与之相关的相当高的成本。

9、重组bmp2(rhbmp2)是由medtronic商业开发的植入物，被称为infuse，其分为小型(对15mg/cm3的植入物，4.2mg bmp2与2个胶原海绵)、中型(对15mg/cm3的植入物，8.4mgbmp2与4个胶原海绵)、大型(对15mg/cm3的植入物，12mg bmp2与6个胶原海绵)以及大型-ii(对15mg/cm3的植入物，12mg bmp2与1个胶原海绵)。对脊椎和颌面部应用而言，所有规格的infuse植入物均得到批准，而对骨折而言，仅有大型-ii植入物得到了批准。infuse植入物通过以无菌盐水重组粉末状bmp2，然后将bmp2-盐水溶液加入胶原海绵中来施用；在此之后将植入物在外科手术介入期间进行局部递送。

10、重组bmp7(rhbmp7或op1)是由stryker商业开发的植入物，目前由olympus拥有，被称为op1。op1植入物分为op1-油灰(op1-putty)(20ml小瓶中含有粉末状牛软骨和3.3mgbmp7)或op1-植入物(1g粉末状牛软骨和3.3mg bmp7)。op1-油灰被批准用于脊柱融合外科手术，而op1-植入物被批准用于治疗骨折和骨折未愈合的外科手术。op1-油灰或op1-植入物通过首先以无菌盐水重组粉末状bmp7、然后将bmp7-盐水溶液加入胶原植入物中来施用；在此之后在外科手术介入期间将植入物进行局部递送。

11、阿片样生长因子受体(ogfr或ζ-阿片样受体)是非典型的核周阿片样受体，其不与典型的μ-、κ-和δ-阿片样受体(分别为oprm、oprk和oprd)共享结构同源性，并且与典型的阿片样受体相比其以更低的效率与原生阿片样配体结合。阿片样生长因子(ogf或met-5脑啡肽；met5)是ogfr的原生配体。met5衍生自激素原(pro-hormone)脑啡肽原(pro-enkephalin)(penk)和较少程度的阿片促黑激素皮质素原(pro-opiomelanocortin)(pomc)，其首先通过激素原转化酶(pcsk1和pcsk2)然后通过羧肽酶e或d(cpe或cpd；脑啡肽转化酶)还原，以形成5个拷贝的met-5脑啡肽。在先的工作确认了met5在成骨细胞和骨祖细胞中的表达(rosen等人，proc natl acad sci 88(9):3705-9，1991；rosen等人，j boneminer res.13(10):1515-20，1998；elhassan等人，j bone and miner res.，13(1):88-95，1998；cheng等人，mol biol cell.20(1):319-27，2009)。此外，kuis等人确认了在外周血和脾脏的单核细胞中的met5(kuis等人，j clin invest.88(3):817-24，1991)。然而，这些研究者无法确认ogfr信号传导在髓系间充质中的功能重要性。elhassan等人(j bone andminer res，13(1):88-95；1998)公开了met5在骨骼和关节组织中的存在。然而，met5与骨形成之间没有可表明的的联系。

技术实现思路

1、本文已经确认了阿片样生长因子信号传导的抑制促进了骨形成和/或降低了骨损坏。不意在受到任何具体理论的限制，据信，通过阿片样生长因子受体(ogfr)抑制阿片样生长因子信号传导有效促进了骨形成和/或减少了骨损坏。本文已经证明，通过向期望骨形成的部位直接局部施用阿片样生长因子(ogfr)信号传导通路的抑制剂，阿片样生长因子信号传导的抑制在动物中促进骨形成。还证明了需要向期望骨形成的部位直接施用阿片样生长因子(ogfr)信号传导通路抑制剂，以促进msc分化成为成骨细胞，并防止单核细胞分化成破骨细胞，这导致矿物质化的增加并提高在骨骼受伤或外科手术部位处的骨形成。

2、因此，本发明涉及通过向需要其的动物将有效量的促进骨形成和/或降低骨损坏的阿片样生长因子受体的拮抗剂直接施用于期望骨形成的部位，用于促进骨形成或降低骨损坏的方法。

3、在一方面，本方法中采用的ogfr拮抗剂阻断阿片样生长因子与ogfr的结合。

4、在一些实施方式中，阻断阿片样生长因子(met5)与ogfr结合的ogfr拮抗剂是纳洛酮或者其功能性衍生物、纳曲酮或者其功能性衍生物、或者它们的组合。

5、在其他的实施方式中，ogfr拮抗剂衍生自氧吗啡酮并且结合至ogfr，其包括：纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、纳洛肼、左洛啡烷、纳美芬、cyprodime、塞克罗酚、环佐辛、奥昔啡烷、ly113878、mr2266、二丙诺啡、win 44,441-3、纳曲吲哚(naltindole)或norbinaltorphimine。

6、仍在其他的实施方式中，ogfr拮抗剂衍生自顺-3,4-二甲基-4-苯基哌啶并结合至ogfr，其包括：ly99335、ly25506、ly117413或ly255582。

7、在一些实施方式中，ogfr拮抗剂衍生自met5-脑啡肽或者亮氨酸-脑啡肽的肽，结合至ogfr，并且最低限度地包括以下的氨基酸序列作为靶向ogfr的手段：对衍生自met5-脑啡肽的那些而言为tyr-gly-gly-phe-met(seq id no:1)，或者对衍生自亮氨酸-脑啡肽的那些而言为tyr-gly-gly-phe-leu(seq id no:2)。

8、仍在其他实施方式中，ogfr拮抗剂衍生自肽拮抗剂ici174864(n,n-二烯丙基-tyr-aib-aib-phe-leu-oh,seq id no:3；aib＝氨基异丁基酸)或者生长激素抑制素类似物ctp(d-phe-cys-tyr-d-trp-lys-thr-pen-thr-nh2，seq id no:4)。

9、在另一方面，本方法中采用的ogfr拮抗剂是一种扰乱在ogfr:251qsaldyfmfavrcrhqrrqlvhfawehfrprckfvwgpqdk lrrfkpssl(seq id no:5)中发现的核定位序列的分子。

10、仍在另一方面，本方法中采用的ogfr拮抗剂是直接针对ogfr基因并有效扰乱ogfr基因表达的小-发夹(sh)-rna或者小-干扰(si)-rna。

11、在另一方面，本公开提供用于促进间充质干细胞(msc)募集至骨中受伤或外科手术介入的局部部位，以促进愈合同时抑制破骨细胞驱动的骨降解(或者再吸收)的方法。该方法是基于施用一定量的ogfr拮抗剂以促进骨形成，同时抑制骨降解。受伤(injury)可以为，例如，骨折或外科手术介入。在一些实施方式中，将ogfr拮抗剂局部地施用于受伤部位或者外科手术介入的部位。