circPI4KB在诊断和治疗非酒精性脂肪性肝病以及相关药物筛选中的应用

circpi4kb在诊断和治疗非酒精性脂肪性肝病以及相关药物筛选中的应用
技术领域
1.本发明涉及非酒精性脂肪性肝病诊断治疗方法以及药物技术领域，具体涉及circpi4kb在诊断和治疗非酒精性脂肪性肝病以及相关药物筛选中的应用。


背景技术：

2.随着人民生活方式和饮食结构的改变，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)发病率逐渐增高，全球约25％的人群患有nafld。nafld的全球发病率高达25％，在中国发病率为29.2％，已成为全球和中国排名第1位的慢性肝病和重要的公共卫生问题，给患者和社会带来巨大的疾病负担和经济影响。nafld疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化和肝细胞癌。在nash发生后，可出现肝脏炎症、纤维化，导致疾病活动、进展，甚至发生肝硬化、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)。根据模型研究预测，美国、欧洲和中国与nafld相关的hcc的发病率和患病率将在2016年至2030年期间迅速增加至56％。
3.一旦患者进展到nash阶段后，nash相关疾病进展风险加快，发生肝硬化、心血管疾病、hcc和其他系统恶性肿瘤的几率均明显增高。但是，针对nafld和nash人群进展成hcc尚未有行之有效的预防措施。目前，除了通过服用他汀类药物、二甲双胍、阿司匹林等控制血脂血糖异常和预防性的抗炎治疗，或者通过减体重治疗外，临床上有效治疗nash的药物及方案非常有限，急需研发有效的nash的防治措施。可以预见，非酒精性脂肪性肝病将会成为今后我国慢性肝病的主要社会经济负担，加强对nash的基础与临床研究，寻找nash的治疗新手段与新靶点，具有重大的社会价值和临床实际需求，亟待进一步的研究和探索。


技术实现要素：

4.本发明意在提供circpi4kb在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用，以解决现有技术缺乏专门针对非酒精性脂肪性肝病的药物的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.circpi4kb在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。
7.本方案还提供了circpi4kb在制备诊断非酒精性脂肪性肝病的系统中的应用。
8.本方案还提供了circpi4kb筛选治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。
9.本技术方案的原理以及有益效果在于：
10.circrna是一类共价闭合环状rna，在炎症和肿瘤的发生发展中起重要作用。近年来nature和science等国际顶级期刊相继报道，circrna可作为细胞内的竞争性内源性rna，通过结合并吸附mirna，从而阻止mirna在3
′
非翻译区与mrna相互作用，进而干扰mirna对靶基因的调控作用。也有报道称circrna可结合mirna并增加其稳定性，还可实现对mirna的转运功能，解锁了circrna研究的新功能和新领域。针对nafld关键影响因子mirna-122，其从肝细胞内到外的转运机制，以及如何维持其在nafld患者血清中的稳定性，现有技术中尚未
见报道。发明人通过对nafld细胞模型进行研究，筛选出了若干表达量产生显著变化的候选circrna。并发现其中的circpi4kb与mirna-122的表达以及由细胞内到外的转运相关。并且，circpi4kb表达上调后，mirna-122的下游5个脂质沉积相关蛋白及其mrna的表达量上调；而抑制circpi4kb表达后，5个脂质沉积相关蛋白及其mrna的表达量下调。进一步说明了circpi4kb可以作为治疗nafld的药物作用靶点，应用在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物的实践操作中。除此之外，circpi4kb作为药物作用靶点，还可以针对该靶点进行药物筛选，以找到对circpi4kb形成抑制的适合于治疗nafld的新药。
11.除此之外，发明人还对45例和45例正常人和nafld病人的血清样本进行了测试，发现正常人和病人血清中，circpi4kb表达量存在差异，其可以作为诊断nafld的生物标志物应用在临床诊断的时间操作中。通过对样本的研究，验证了circpi4kb对nafld的诊断能力，结果表明其诊断效能曲线下面积为0.925(0.878-0.972),p＜0.001，诊断效力理想。
12.综上所述，非酒精性脂肪性肝病(nafld)目前已经成为我国第一位的慢性肝病。随着人民生活方式和饮食结构的改变，nafld的发病率逐渐升高，据文献报道我国2018年预估的脂肪肝发病率高达32.95％，其即将成为今后我国慢性肝病的主要社会经济负担。加强对nafld的基础与临床研究，寻找治疗的新手段与新靶点，具有重大的社会价值和临床实际需求。本研究体外实验调节circpi4kb导致对肝内脂质沉积的抑制作用减弱，促使nafld的发生。本研究为nafld发生的分子机制提供新的线索，并为nafld的诊断和治疗提供新的靶点。
13.进一步，circpi4kb在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用，包括抑制circpi4kb表达水平的步骤。通过抑制circpi4kb表达水平来实现对非酒精性脂肪性肝病的治疗。
14.进一步，使用shrna抑制circpi4kb表达。shrna是一种能够有效抑制环状rna表达水平的手段，且针对于shrna的设计和操作方法相对成熟，容易操作和掌握。
15.进一步，所述shrna的dna序列为：5
’‑
agaatgaggatgagcttggaa-3’。采用上述序列的shrna可以对circpi4kb的表达形成有效抑制，进而减少mirna-122从肝细胞内到外的转运，延缓肝脏脂质沉积以及nafld的发生发展。
16.进一步，circpi4kb在制备诊断非酒精性脂肪性肝病的试剂中的应用，circpi4kb的接收号为hsa_circ_0006982；诊断非酒精性脂肪性肝病的系统用于检测circpi4kb在血清、肝细胞或者肝组织中的含量。通过检测circpi4kb在血清、肝细胞或者肝组织中的含量，可以较为准确地反应肝内脂质沉积以及nafld的发展趋势的大致情况，对诊断非酒精性脂肪性肝病起到有效的指示作用。
17.进一步，诊断非酒精性脂肪性肝病的系统包括qrt-pcr试剂。
18.进一步，所述qrt-pcr试剂包括引物f和引物r；引物f的序列为：3
’‑
cagccagcaaccctaaagtg-5’；引物r的序列为：5
’‑
actgtatctcccatggccac-3’。
19.进一步，circpi4kb在血清中的诊断参考值为28.16。通过rt-qrcr检测以及2-δδct
法计算，可以获得circpi4kb在血清中的相对拷贝数。经过统计分析发现，circpi4kb在血清中的诊断参考值为28.16。小于该值，可以初步判断患者具有一定的可能性患有非酒精性脂肪性肝病，提示需要采用进一步的诊断手段，对患者是否患有非酒精性脂肪性肝病进行进一步判断。
附图说明
20.图1为实施例1的mirna-122在nafld的发生过程中的作用机制示意图。
21.图2为实施例1的nafld和健康对照相比circrna表达量变化情况火山图。
22.图3为实施例1的nash和健康对照相比circrna表达量变化情况火山图。
23.图4为实施例2的nash和nafld相比circrna表达量变化情况火山图。
24.图5为实施例1的qrt-pcr检测nafld细胞模型中差异表达的circrnas(图中数据为三次重复实验的实验结果，图中左侧箭头表示具有显著表达差异的circrnas，其中，circpi4kb的差异表达水平为0.58
±
0.11fold change；*p＜0.05、**p＜0.01)。
25.图6为实施例1的正常细胞和nafld细胞模型中circpi4kb在细胞内外表达水平统计图(图中数据为三次重复实验的实验结果；circpi4kb在细胞内的水平为：0.51
±
0.06fold change；ircpi4kb在上清液中的水平为：2.27
±
0.28fold change；*p＜0.05、**p＜0.01)。
26.图7为实施例2的roc曲线。
27.图8为实施例3的qrt-pcr检测调节circpi4kb水平后mirna-122在肝细胞内外水平变化(图中数据为三次重复实验的实验结果；mirna-122在细胞内的水平为：0.41
±
0.23fold change；mirna-122在上清液的水平为：3.78
±
0.78fold change；*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001；ns：不存在显著差异)。
28.图9为实施例3的western blot检测mirna-122的下游五个脂质代谢相关蛋白水平变化图片。
29.图10为实施例3的qrt-pcr检测mirna-122的下游五个脂质代谢相关mrna水平变化统计图(图中数据为三次重复实验的实验结果；针对ffa+circpi4kb组，hmgcr为3.53
±
0.98；fas，3.12
±
0.54；srebp2，2.78
±
0.54；agpat1，2.35
±
0.34；dgat1，2.14
±
1.11；*p＜0.05、**p＜0.01；ns：不存在显著差异)。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
31.实施例1：
32.nafld是一种由于甘油三酯和胆固醇等脂质过度沉积而诱发肝细胞变性的代谢性疾病。mirna-122占肝脏mirna总量的70％，被定义为肝脏特异性mirna。mirna-122可以通过两种途径抑制肝脏脂质沉积，分别是抑制胆固醇的合成和抑制甘油三酯的合成，对肝脏起保护性作用。其一，mirna-122通过转录后抑制胆固醇调节元件结合蛋白(srebp)、脂肪酸合成酶(fas)和甲基戊二酰辅酶a还原酶(hmgcr)的mrna翻译而减少胆固醇合成；其二，mirna-122还可通过转录后抑制甘油磷酸酰基转移酶1(agpat1)和二酰甘油酰基转移酶1(dgat1)的mrna翻译而减少甘油三酯合成，从而减少脂质沉积。综上所述，mirna-122可通过转录后抑制胆固醇和甘油三酯合成的相关mrna，减少肝脏脂质沉积，在nafld的发生中起保护性作用(图1)。mirna-122如何实现从肝细胞内到外的转运，如何维持其在nafld患者血清中的稳定性，进一步深入研究mirna-122“逃逸”有助于阐明nafld发生的机制。
33.发明人对mirna-122“逃逸”机制进行了深入研究。其中，通过对健康对照、nafld患者和nash患者肝脏组织的进行全转录组测序(包含circrna，mirna和mrna等)，利用差异表达分析共筛选到34个差异表达circrnas，参见图2-4(circrna测序火山图)。图2为nafld和健康对照相比circrna表达量变化情况；图3为nash和健康对照相比circrna表达量变化情况；图4为nash和nafld相比circrna表达量变化情况。
34.发明人对在nafld或nash中有差异表达的若干circrnas进行了进一步研究。发明人建立了nafld细胞模型，然后使用qrt-pcr对这些差异表达的circrnas进行筛选以及验证。实验结果详见图5，circc7orf44、circspecc1-2、circrbbp8、circpi4kb和circaff1-1等circrnas出现了差异表达的情况。nafld细胞模型由如下方式建立：人源肝细胞l02以5-10
×
105/ml接种，使用含有游离脂肪酸刺激(ffa)的培养基培养人源肝细胞l02 24_h，获得nafld细胞模型。含有游离脂肪酸刺激(ffa)的培养基的配方具体参见实施例3。
35.利用nafld细胞模型观察到circrna-pi4kb(circpi4kb)(hsa_circ_0006982)在肝脏细胞/肝内含量下降，细胞上清/血清中含量上升。即，在nafld细胞模型中，circpi4kb在细胞内水平下降，在细胞外水平上升。circpi4kb降低和逃逸出肝细胞是潜在的nafld发病的原因，而其分泌增多也是其作为血清标物的潜在靶点，实验结果参见图6。其他前述检测到的在nafld细胞模型和正常细胞差异表达的circrnas，并未呈现上述现象，说明circpi4kb相对于其他circrnas具有特殊功能。
36.实施例2：利用circpi4kb作为诊断标志物的效力研究
37.搜集45例和45例正常人和nafld病人的血清样本，患者情况参见表1。
38.表1：患者情况统计
[0039][0040][0041]
除了对血清、细胞和组织中的总rna的提取的具体流程如下：
[0042]
(1)收集6孔板内细胞或称量50μg研磨后的肝组织或者取200μl血清于无rna酶的ep管中，加入trizol 500μl，振荡混匀，室温孵育5分钟；
[0043]
(2)加入氯仿100μl，振荡混匀15秒，低温离心机离心15分钟，转速12000
×
g，此时ep管中的液体分三层；
[0044]
(3)吸取最上层清亮液体于另一干净的ep管中，加入250μl异丙醇，振荡混匀，室温
孵育10分钟，低温离心机离心10分钟，转速12000
×
g；
[0045]
(4)轻轻吸弃上清，加入75％乙醇(depc水配)500ml，轻微颠倒混匀，低温离心机离心5分钟，转速7500
×
g；
[0046]
(5)吸弃上清，室温干燥10-15分钟，每管加入提前60℃预热的depc水30-50μl，移液器吹打混匀，保存于-80℃冰箱。
[0047]
通过qrt-pcr的方法检测血清样本中circpi4kb的表达量。本研究采用sybr green荧光定量pcr方法检测目的基因表达水平。对mrna逆转录后的cdna进行检测，使用人源管家基因actb或者鼠源gapdh作为内参对照；采用2-δδct
计算组织/细胞目的基因mrna的相对拷贝数(以人源actb或者鼠源gapdh为参照)。利用roche罗氏lc96定量pcr仪lightcycler96system对其拷贝值进行测定。
[0048]
计算公式为：δδct＝δct
exp-δct
con
＝(ct
exp-target-ct
exp-actb/gapdh
)-(ct
con-target-ct
con-actb/gapdh
)；
[0049]
其中，ct
exp-target
：nafld病人样本的circpi4kb扩增的ct值；
[0050]
ct
con-target
：正常样本的circpi4kb扩增的ct值；
[0051]
ct
exp-actb/gapdh
：nafld病人样本的内参扩增的ct值；
[0052]
ct
con-actb/gapdh
：正常样本的内参扩增的ct值。
[0053]
采用2-δct
计算细胞/外泌体/血清中目的mirna的相对拷贝数(以u6为参照，针对mirna的一个reverse引物。)。计算公式为：δδct＝δct
exp-δct
con
＝(ct
exp-target-ct
exp-u6
)-(ct
con-target-ct
con-u6
)。其中，circpi4kb的检测是和普通mrna检测方法一致。
[0054]
其中，circpi4kb的引物序列为：
[0055]3’‑
cagccagcaaccctaaagtg-5’(即：5
’‑
gtgaaatcccaacgaccgac-3’，seq id no.1)；
[0056]5’‑
actgtatctcccatggccac-3’(seq id no.2)。
[0057]
actb的引物序列为：
[0058]3’‑
ctccatcctggcctcgctgt-5’(即：5
’‑
tgtcgctccggtcctacctc-3’，seq id no.3)；
[0059]5’‑
gctgtcaccttcaccgttcc-3’(seq id no.4)。
[0060]
反应体系以及反应条件参见表2、表3、表4和表5所示。
[0061]
表2：逆转录反应体系(20μl)(takara rr047a逆转录试剂盒)
[0062]
试剂用量5
×
primescript buffer(for real time)4μlprimescript rt enzyme mix1μlrandom 6mers(100μm)1μltotal rna100ng-1μgrnase free dh2o补齐至20μltotal20μl
[0063]
表3：逆转录反应条件
[0064]
温度时间37℃15min
id no.5所示(5
’→3’
)：
[0075]
cttggaagctcgaagtctggctgtggccatgggagatacagtagtggagcctgcccccttgaagccaacttctgagcccacttctggcccaccagggaataatggggggtccctgctaagtgtcatcacggagggggtcggggaactatcagtgattgaccctgaggtggcccagaaggcctgccaggaggtgttggagaaagtcaagcttttgcatggaggcgtggcagtctctagcagaggcaccccactggagttggtcaatggggatggtgtggacagtgagatccgttgcctagatgatccacctgcccagatcagggaggaggaagatgagatgggggccgctgtggcctcaggcacagccaaaggagcaagaagacggcggcagaacaactcagctaaacagtcttggctgctgaggctgtttgagtcaaaactgtttgacatctccatggccatttcatacctgtataactccaaggagcctggagtacaagcctacattggcaaccggctcttctgctttcgcaacgaggacgtggacttctatctgccccagttgcttaacatgtacatccacatggatgaggatgtgggtgatgccattaagccctacatagtccaccgttgccgccagagcattaacttttccctccagtgtgccctgttgcttggggcctattcttcagacatgcacatttccactcaacgacactcccgtgggaccaagctacggaagctgatcctctcagatgagctaaagccagctcacaggaagagggagctgccctccttgagcccggcccctgacacagggctgtctccctccaaaaggactcaccagcgctctaagtcagatgccactgccagcataagtctcagcagcaacctgaaacgaacagccagcaaccctaaagtggagaatgaggatgag(seq id no.5，下划线为qrt-pcr引物结合位点)；
[0076]
shrna序列为：5
’‑
agaatgaggatgagcttggaa-3’(seq id no.6)。
[0077]
(2)质粒转染
[0078]
以5-10
×
105/ml的人源肝细胞l02(包括正常细胞以及游离脂肪酸刺激(ffa)刺激的nafld模型细胞)密度接种于6孔板，显微镜下观察细胞形态，待细胞贴壁生长至50％-60％。其中，正常细胞使用的培养基为opti-mem。游离脂肪酸刺激(ffa)刺激的nafld模型细胞使用的培养基由如下方式配制：1)配制ffa原液：油酸钠(sodium oleate，oa)0.0609g溶于10ml质量分数为25％的bsa(20mm)，棕榈酸钠(sodium palmitate，pa)0.0557g溶于20ml质量分数为25％的bsa(10mm)，55℃水浴溶解1h，震荡，混匀，超声10分钟(30s
×
20次)，37h水浴过夜。2)细胞1m ffa培养基：将0.333ml(oa)和0.333ml(pa)溶于10ml培养基。
[0079]
然后，将上一步构建的质粒载体、opti-mem培养基、脂质体lipofectaminetm3000，严格按照转染试剂说明书配比成所需转染液(赛默飞，invitrogen lipofectamine 3000转染试剂)。将上一段所述的培养基换成转染液，在转染液中，质粒载体的浓度为1μg/ml，lipofectaminetm3000的浓度为125μl/ml。上述混合液体轻轻混匀后置37℃孵育10-20分钟，每孔加入250μl的转染液并充分混匀，置于恒温培养箱培养6小时以后，更换正常普通培养基(opti-mem)。
[0080]
(3)检测
[0081]
在转染之后24h，对ffa组换取棕榈酸+油酸(1:1，即ffa培养基)继续造模24小时，正常组更换正常的普通培养基。对空白对照、circpi4kb过表达组、sh-circpi4kb组的细胞(liver)中以及培养基(serum)中的mirna-122的表达水平进行了qrt-pcr检测，实验结果参见图8。可见在正常细胞中，circpi4kb过表达会导致大量mirna-122外排至细胞外；circpi4kb被抑制后，mirna-122会在细胞内一定程度地累积，并且外排至胞外的量大大减少。所以，对于正常细胞而言，circpi4kb表达上调会促进mirna-122从胞内排出至胞外。而mirna-122从肝细胞内到外的转运，导致细胞内mirna-122含量减少而保护性作用降低，会促进肝脏脂质沉积以及nafld的发生发展。而在nafld模型细胞(ffa)中，细胞中的mirna-122含量进一步减小，circpi4kb过表达组中细胞中的mirna-122含量最少，其次是空白对照
和sh-circpi4kb组。而在nafld模型细胞(ffa)中，培养基中，mirna-122含量进一步增加，circpi4kb过表达组中培养基中的mirna-122含量最高，其次是空白对照和sh-circpi4kb组。上述实验结果说明，使用sh-circpi4kb可以通过抑制circpi4kb的表达，来抑制mirna-122的表达以及外排，可以作为治疗由于mirna-122引起的nafld的潜在手段。
[0082]
发明人进而对mirna-122的下游5个脂质沉积相关蛋白及其mrna(srebp、fas、hmgcr、agpat1和dgat1)的水平变化进行了检测。实验结果参见图9和图10。上述实验结果明确了circpi4kb的水平变化可影响肝细胞内脂质沉积。
[0083]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]