一种改善抑郁的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改善抑郁的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.抑郁症又称抑郁障碍，为临床中常见的与情感相关的精神类疾病，其代表性的临床表现为情绪不高、悲观厌世、认知和睡眠障碍，患者常常陷入忧郁、无法控制的自我沉思及对过去、现在和未来的消极思考中。抑郁症患者往往具有较差的生理功能、较高的复发风险，甚至存在极高的自杀率。
3.目前临床上西医对于抑郁症的治疗主要以口服抗抑郁药物或心理疗法为主。临床上有很多抗抑郁症的药物，如三环及四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺(5-ht)再摄取抑制剂等。但临床一线治疗仅对1/3的患者显现出明显的改善作用，并且药物起效作用存在数周至数月的潜伏期，疗效持续时间较短，容易反复且有一定不良反应。因而需要一种方便使用、安全，能够有效改善抑郁的产品。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种改善抑郁的组合物及其制备方法和应用，方便使用、安全，能够有效改善抑郁。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明提供的一种改善抑郁的组合物，所述组合物为磷脂双分子层包埋棕榈酰三肽-8和euk-134后获得的脂质体；
7.其中，棕榈酰三肽-8和euk-134的质量份比为(1～3):(1～3)。
8.优选地，棕榈酰三肽-8和euk-134的质量份比为1:2。
9.优选地，在脂质体中添加医学辅料制备成鼻用滴剂、喷雾、凝胶、乳膏、散剂或粉雾剂。
10.本发明还公开了上述一种改善抑郁的组合物的制备方法，将棕榈酰三肽-8加入到搅拌状态下的磷脂混合物中混合均匀，得到混合物a；将euk-134加入水中混合均匀，得到溶液b；再将溶液b注入搅拌状态下的混合物a中，继续搅拌，然后进行高压均质处理，制得脂质体混悬液。
11.优选地，所述磷脂混合物为pro-lipo
tm neo。
12.优选地，所述溶液b缓慢注入搅拌状态下的混合物a中的具体步骤为：将溶液b以1～4％v/min的速度缓慢注入搅拌速度为800～1000rpm/min的混合物a中。
13.优选地，溶液b注入完毕后，继续搅拌20min。
14.优选地，在制得脂质体混悬液基础上，加入10％的d-甘露糖醇，混合均匀后进行冻干，得到脂质体冻干粉。
15.本发明还公开了上述一种改善抑郁的组合物在制备改善抑郁症的药物中的应用。
16.优选地，所述药物的给药途径为鼻腔给药。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明提供的一种改善抑郁的组合物，棕榈酰三肽-8和euk-134能够通过清除自由基、抗炎、营养脑神经，抑制脑神经凋亡，从根本发挥长效改善抑郁作用；将组合物包封入脂质体，鼻腔给药，能有效减少药物对鼻腔的刺激性和毒性。脂质体本身能增加药物的吸收率，且其中的磷脂能营养神经、活化人体的神经细胞，改善大脑功能，提高神经细胞间的信息传递速度以及准确性。通过对制得的组合物进行毒理实验验证，给药组与control组相比，均没有显著性差异，对l929细胞无明显的毒性作用，说明该组合物具有良好的生物相容性。通过对制得的组合物进行动物实验验证，糖水偏好实验、悬尾实验、强迫游泳实验以及炎症因子检测实验，均证明给药组与model组相比具有显著性差异，小鼠抑郁症状有所缓解。该组合物在使用时经鼻吸收，棕榈酰三肽-8和euk-134经鼻粘膜吸收，可经嗅神经通路、三叉神经通路直接入颅，靶向大脑，避免了肝脏的首过效应和血脑屏障，从而能够快速起效并提高功效成分的利用率。因而该组合物不仅安全有效，方便使用，而且能够快速起效，能够应用于改善抑郁症中。
附图说明
19.图1为本发明的不同浓度的脂质体对l929细胞的毒性图；
20.图2为本发明的脂质体冻干粉对小鼠抑郁样行为的影响图；其中，a为糖水偏好实验，b为悬尾实验，c为强迫游泳实验；相对于model组，**表示p＜0.01，ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，#表示p＜0.05，##表示p＜0.01；
21.图3为本发明的脂质体冻干粉对小鼠海马区炎症因子水平的影响图；其中，a为对il-1β的影响；b为对tnf-α的影响；c为对il-10的影响；相对于model，**表示p＜0.01，ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，#表示p＜0.05，##表示p＜0.01。
具体实施方式
22.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
23.需要说明的是，本发明的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
24.下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
25.下述各实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；棕榈酰三肽-8购自陕西昊森生物科技有限公司，纯度≥98％；euk-134购自浦瑞生物医药技术有限公司，纯度＞98％；磷脂混合物为购自sage chemical(group)有限公司的pro-lipo
tm neo。
26.实施例1
27.一种改善抑郁的组合物，为磷脂双分子层包埋棕榈酰三肽-8和euk-134(乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物)获得的脂质体。其中棕榈酰三肽-8和euk-134的质量份数比例为1:2。
28.1.制备改善抑郁的组合物
29.具体的制备方法为：首先在搅拌下将0.5份棕榈酰三肽-8加入到10份磷脂混合物中使其混合均匀，得到混合物a。将1份euk-134加入188.5份水中使其混合均匀得到溶液b。之后将b溶液缓慢注入搅拌状态下的混合物a中，混合物a搅拌速度800～1000rpm/min，注入速度1～4％v/min，注入完毕后继续搅拌20min，然后进行高压均质处理，得到脂质体混悬液(即改善抑郁的组合物)。脂质体混悬液中磷脂最终质量浓度5％，棕榈酰三肽-8的终浓度为0.25％，euk-134的终浓度为0.5％。
30.2.对制得的改善抑郁的组合物进行性能评价
31.1)细胞实验
32.准确吸取上述制得的脂质体混悬液，用dmem培养基将其分别稀释10倍、20倍和50倍，得到hdg(高剂量)、mdg(中剂量)和ldg(低剂量)混悬液，待用。
33.将冻存在液氮罐中的小鼠成纤维细胞(l929)进行复苏，用已添加1％双抗和10％胎牛血清的dmem培养基，于37℃、95％湿度和5％co2的条件下培养一段时间。待细胞贴壁生长良好后，将l929细胞按照1.2*104/孔的密度接种于96孔板中，设置blank组(孔中只加入培养基，无细胞和脂质体混悬液)、control组(孔中只加入细胞和培养基，无脂质体混悬液)及ldg、mdg和hdg实验组，每组各设置5个平行样。
34.培养24h后，将孔中培养基吸出并重新加入200μl对应浓度梯度的脂质体混悬液。blank组和control组不做任何处理。
35.细胞继续培养24h后，每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，孵育4h后，小心吸去孔内培养基。每孔加入200ul的dmso，轻轻振荡96孔板，使用酶标仪于490nm波长处测定od值。并使用公式计算细胞存活率：
[0036][0037]
结果分析：
[0038]
如图1所示，与control组相比，三个实验组ldg、mdg、hdg与control组均没有显著性差异，说明低、中、高脂质体浓度对l929细胞无明显的毒性作用，脂质体具有良好的生物相容性。
[0039]
2)动物实验
[0040]
a.实验动物
[0041]
健康km小鼠30只，雄性，体质量(18
±
2)g，由空军军医大学实验动物中心提供。实验前在恒温(24
±
2)℃，相对湿度40％～70％条件下，自由饮水摄食。适应饲养一周后，随机分成5组，即ldg组、mdg组、hdg组，model组和control组，每组动物均为6只。
[0042]
b.材料
[0043]
il-1、tnf-α、il-10等elisa试剂盒均由武汉华美生物工程有限公司提供。
[0044]
c.建立小鼠慢性抑郁模型
[0045]
将control组6只为一笼群养，不给予任何外界刺激，并自由饮水摄食。其余各组小鼠孤养，并每天给予不同刺激，且接受刺激尽量反差较大，应激源包括水平震荡5min、禁食禁水24h、夹尾5min、4℃冷水游泳5min、45℃烘箱热烘5min、12h昼夜颠倒和24h潮湿垫料7种。接受刺激的各组小鼠每天接受随机安排的一种刺激，对一组小鼠不能连续接受同种刺激，且同种刺激最多使用3次。
[0046]
d.试验方法
[0047]
在上述制得的脂质体混悬液中加入10％的d-甘露糖醇，混合均匀后进行冻干，得到脂质体冻干粉。将制得的脂质体冻干粉用100ml pbs复溶，得到复溶原液，用于hdg组小鼠经鼻滴注。对复溶原液分别稀释5倍和20倍分别用于mdg组和ldg组小鼠经鼻滴注。control组和model组小鼠经鼻滴注pbs。5组小鼠每天经鼻给药1次，每次20μl，连续给药21d。给药的同时，进行刺激，除control组不需要刺激外，其他各组小鼠均给予刺激。
[0048]
糖水偏好实验(sucrosepreferencetest，spt)：
[0049]
测试前对各组小鼠适应性饮用1％蔗糖水48h，尽量避免其对新事物产生恐惧，以及避免饮水位置的偏爱，每日要调换一次饮水瓶的位置。测试时，先将小鼠禁水24h后给予等体积a和b两瓶水(a瓶水为自来水，b瓶水为1％蔗糖水)，根据小鼠在5h期间的糖水摄取量和自来水摄取量，计算糖水偏好度。(糖水偏好度％＝[b/(a+b)]
×
100％)。
[0050]
悬尾实验(tailsuspensiontest，tst)：
[0051]
将小鼠尾端1/3处用胶带将其尾巴固定在离地面50cm处悬吊，由一名受训的盲目设计观察者测量小鼠在该环境下5min内不动时间的总和。
[0052]
强迫游泳实验(forcedswimmingtest，fst)：
[0053]
该实验方法是一种行为绝望实验法，用来评价药物抗抑郁作用的动物模型。实验在两天内完成。第一天：将小鼠放入高50cm、直径20cm的圆柱形桶中10min，其中，桶内装满水(温度25
±
1℃)。第二天：将小鼠放入圆柱形桶中5min。由对不熟悉此试验设计的实验者记录小鼠5min内的不动时间。
[0054]
炎症因子检测：
[0055]
处死小鼠后，用冰冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，pbs，ph值7.4)匀浆(10％w/v)其海马组织，离心(12,000rpm，4℃，20min)，收集上清液，用elisa试剂盒检测海马标本中il-1β、tnf-α和il-10的含量，具体操作步骤均严格按照试剂盒的说明进行。
[0056]
e.结果分析
[0057]
如图2所示，图2a的糖水偏好实验中，model组与control组相比，糖水摄入明显减少，说明慢性抑郁模型造模成功。ldg、mdg、hdg与model组相比，均具有显著性差异，说明这三组都能改善模型组糖水摄入量减少的情况，也即能改善小鼠的抑郁行为。同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，mdg组的糖水摄入量显著高于hdg组，说明mdg组改善抑郁的效果优于hdg组。图2b的悬尾实验中，model组与control组相比，悬尾实验中小鼠不动时间显著增加，说明慢性抑郁模型造模成功。ldg、mdg、hdg与model组相比，小鼠不动时间均显著减少，说明这三组都能改善小鼠的抑郁行为。同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较无显著性差异。图2c的强迫游泳实验中，model组与control组相比，强迫游泳实验中小鼠不动时间显著增加，说明慢性抑郁模型造模成功。ldg、mdg、hdg与model组相比，游泳中不动时间均显著减
少，说明这三组都能改善小鼠的抑郁状况。同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，mdg与ldg、hdg相比，小鼠强迫游泳实验中不动时间均减少，具有显著性差异。说明强迫游泳实验中，mdg与ldg、hdg相比，能明显减少小鼠的不动时间，也说明mdg剂量组在减少强迫游泳实验中小鼠不动时间的效果更好。
[0058]
如图3所示，图3a中，对il-1β的影响中，model组与control组有显著性差异，炎性因子il-1β明显升高。ldg、mdg、hdg与model组相比，il-1β的含量明显降低，且均具有显著性差异，说明这三组都能降低模型组海马组织il-1β的含量。同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，无显著性差异。图3b中，对tnf-α的影响结果显示，model组与control组相比，炎性因子tnf-α含量明显升高。ldg、mdg、hdg与model组相比，均显著降低，说明这三组都能降低小鼠海马组织炎性因子tnf-α的含量；同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，无显著性差异。图3c中，对il-10的影响，结果显示，model组与control组有显著性差异，model组抗炎因子il-10明显降低。ldg、mdg、hdg与model组相比，均具有显著性差异，说明这三组都能增加小鼠海马组织抗炎因子il-10的含量。同时ldg、mdg、hdg三组之间相互比较，mdg与ldg、hdg相比，能明显增加小鼠海马组织抗炎因子il-10的含量，也说明mdg剂量组相比于ldg和mdg，提高抗炎因子il-10含量的效果更强。
[0059]
以上结果说明包埋棕榈酰三肽-8和euk-134的脂质体，经鼻吸收，能明显增加慢性抑郁小鼠的糖水摄入量、减少悬尾实验和强迫游泳试验中的不动时间，也即改善慢性抑郁小鼠的抑郁行为。三组剂量中，mdg剂量组比ldg和hdg改善抑郁的效果好。进一步分析脂质体改善抑郁的原因，发现不同剂量的实验组相比于model组，小鼠海马组织的炎症因子il-1β、tnf-α明显降低，抗炎因子il-10的含量明显升高，且mdg组il-10的含量高于ldg和hdg组。说明棕榈酰三肽-8和euk-134的脂质体通过减少炎症因子il-1β、tnf-α的含量，增加抗炎因子il-10的含量发挥抗抑郁效果。
[0060]
实施例2
[0061]
一种改善抑郁的组合物，为磷脂双分子层包埋棕榈酰三肽-8和euk-134(乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物)获得的脂质体。其中棕榈酰三肽-8和euk-134的质量份数比例为1:3。
[0062]
具体的制备方法如下：
[0063]
首先在搅拌下将0.5份棕榈酰三肽-8加入到10份磷脂混合物中使其混合均匀，得到混合物a。将1.5份euk-134加入188份水中使其混合均匀得到溶液b。之后将b溶液缓慢注入搅拌状态下的混合物a中，混合物a搅拌速度800～1000rpm/min，注入速度1～4％v/min，注入完毕后继续搅拌20min，然后进行高压均质处理，得到脂质体混悬液(即改善抑郁的组合物)。脂质体混悬液中磷脂最终质量浓度5％，棕榈酰三肽-8的终浓度为0.25％，euk-134的终浓度为0.75％。
[0064]
实施例3
[0065]
一种改善抑郁的组合物，为磷脂双分子层包埋棕榈酰三肽-8和euk-134(乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物)获得的脂质体。其中棕榈酰三肽-8和euk-134的质量份数比例为3:1。
[0066]
具体的制备方法如下：
[0067]
首先在搅拌下将1.5份棕榈酰三肽-8加入到40份磷脂混合物中使其混合均匀，得
到混合物a。将0.5份euk-134加入958份水中使其混合均匀得到溶液b。之后将b溶液缓慢注入搅拌状态下的混合物a中，混合物a搅拌速度800～1000rpm/min，注入速度1～4％v/min，注入完毕后继续搅拌20min，然后进行高压均质处理，得到脂质体混悬液(即改善抑郁的组合物)。脂质体混悬液中磷脂最终质量浓度4.0％，棕榈酰三肽-8的终浓度为0.15％，euk-134的终浓度为0.05％。
[0068]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。