pH敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的制备及应用

ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的制备及应用
技术领域
1.本发明提供一种对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的制备及应用，属于生物材料技术领域。


背景技术：

2.在临床肿瘤治疗中，化疗作为一种常用治疗手段存在着治疗效率低和毒副作用大的缺点，使用复合纳米材料作为化疗药物载体可以有效克服这些缺点。纳米羟磷灰石因其良好的生物相容性，强吸附性和对多种肿瘤细胞的抑制作用，可以作为优良的药物载体应用于肿瘤治疗，但是其天然的团聚趋势导致其分散性和稳定性不足，阻碍了在肿瘤治疗中的进一步应用。因此，在制备过程中加入表面活性剂作为模板或稳定剂调控纳米羟磷灰石尺寸及分散性，并通过掺杂离子优化其性能使其同时具有优异的生物成像与药物负载性能是目前关注的热点。例如在公开的发明专利cn 109437139 a中公布了一种钆基纳米羟磷灰石造影剂的制备方法，并将其应用于药物负载和磁共振成像，虽然与商用的gd-dtpa造影剂相比具有更好的磁共振成像效果，但游离的钆具有毒性高和代谢过快的缺陷，不适用于肿瘤的诊断与治疗。
3.通常，羟磷灰石在生物体内递送药物过程中存在由于材料本身降解导致药物未达到病灶过早释放的缺陷，无法实现较长的血液循环。例如在公开的发明专利cn 104587488 a中公布了一种具有ph响应性和细胞靶向的介孔羟磷灰石纳米药物载体的制备方法，但是该药物载体在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中24h内即释放超过20％盐酸阿霉素，说明该药物载体在血液循环过程中就存在较多药物浪费。因此，寻找一种简便且生物毒性低的制备方法制备对ph具有高敏感性的复合纳米材料，延长复合材料在体内的缓释时间，减少在血液循环过程中的药物浪费以提高药物载体治疗效果显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要解决一般药物载体化疗效率低、毒性大、化疗药物未到达肿瘤部位就过早释放，无法实现较长时间的血液循环的问题，并且希望药物载体同时可作为磁共振成像造影剂应用于肿瘤的临床诊断。本发明采用液相均相沉淀法制备纳米改性羟磷灰石，并将其与化疗药物和铁-单宁酸网络结合构建对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸应用于肿瘤诊断和治疗。
5.1.一种对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的制备方法，具体是按照以下步骤完成：
6.一、纳米改性羟磷灰石的合成：将硝酸钙、硝酸锰、聚丙烯酸和20ml～40ml蒸馏水混合加入烧杯中在超声条件下充分溶解，在400rpm～500rpm转速条件下磁力搅拌1h～2h，向混合溶液中加入5ml～15ml磷酸氢二铵水溶液，滴加质量分数为25％～28％的氨水使混合体系保持ph＝9～10，将混合体系转移到圆底烧瓶中，油浴加热到80℃～90℃，在300rpm～400rpm转速条件下搅拌1h～1.5h，室温继续搅拌12h～24h，反应结束后静置陈化12h～
24h，用蒸馏水和乙醇交替洗涤3～4次，离心收集沉淀，在50℃～60℃条件下真空烘干，得到纳米改性羟磷灰石；步骤一中所述硝酸钙和硝酸锰的摩尔比为1：(0.01～0.25)；步骤一中所述混合溶液中钙离子、锰离子的总和与磷酸根离子的摩尔比为1:(0.5～0.7)；步骤一中所述聚丙烯酸的分子量为～2000；步骤一中所述聚丙烯酸的质量与蒸馏水的体积比为1g：(20ml～40ml)；
7.二、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石的合成：将步骤一中制备的纳米改性羟磷灰石、盐酸阿霉素和10ml～30ml蒸馏水加入烧杯中在超声条件下混合，在400rpm～500rpm转速条件下黑暗中磁力搅拌48h～72h；步骤二中所述纳米改性羟磷灰石的质量与蒸馏水的体积比为1g：(100ml～200ml)；步骤二中所述盐酸阿霉素与纳米改性羟磷灰石的质量比为1：(10～20)；
8.三、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的合成：向步骤二磁力搅拌48h～72h后的混合体系中加入100μl ～300μl单宁酸水溶液和100μl～300μl氯化铁水溶液，并快速超声震荡，加入氢氧化钠溶液调节混合体系ph＝8～8.5，室温搅拌1h～2h后离心收集沉淀，在50℃～60℃下真空干燥，得到了含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸；步骤三中所述单宁酸和氯化铁的摩尔比为1:(1～1.5)；步骤三中所述纳米改性羟磷灰石的质量与单宁酸的摩尔比为1g：(0.05mol～0.1mol)；
9.2.对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸用于肿瘤诊断和治疗，具体是按照以下步骤进行：
10.一、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在不同ph环境中的缓释实验：分别将10mg～20mg含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸加入20～40ml ph＝4.5和ph＝7.4的缓冲溶液中，在37℃条件下恒温振荡96h～144h，每隔一段时间取3ml～5ml上清液用可见分光光度法测定上清液中盐酸阿霉素的含量，同时补充相同体积的缓冲溶液，为了设置对照组，将10mg～20mg未包覆铁-单宁酸网络的含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石在相同条件下进行缓释实验；
11.二、检测含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的磁共振成像效果：分别将10mg～20mg含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸加入20～40ml ph＝4.5和ph＝7.4的缓冲溶液中，在37℃条件下恒温振荡4h～12h，每隔一段时间取3ml～5ml上清液，通过icp-oes分析检测锰离子的释放量，并进行1t磁共振成像扫描。未与含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸混合的缓冲溶液作为对照组置于试管中，进行1t磁共振成像扫描。
12.有益效果：
13.1、本发明制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在液相中分散性与稳定性良好，不易沉淀，可以有效避免材料在人体内循环时堵塞的问题；
14.2、本发明制备的纳米改性羟磷灰石为介孔结构，比表面积大于50m2/g，有利于载药，纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸对药物的负载效率大于90％，载药量为52～60mg/g；
15.3、本发明制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸表面包覆单宁酸和铁的络合物，具有良好生物相容性，在中性条件下(ph＝7.4)铁-单宁酸网络降解缓慢，有效减少了化疗药物在血液循环时的释放，在酸性条件下(ph＝4.5)单宁酸中的酚羟基被质子化导致铁-单宁酸网络交联不稳定从而快速降解，释放化疗药物，且纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸降解后
产生的游离离子无生物毒性，可安全使用；
16.4、本发明制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸降解释放的锰离子具有良好的顺磁性，相较重金属来说具有更低的生物毒性，在非稀土金属中具有较好的成像性能，可以有效增强肿瘤部位的磁共振成像加权信号。
附图说明
17.图1是实施例1中纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的透射电镜图；由图1a可以看出，羟磷灰石为棒状结构，长度为50～100nm，宽度为5～10nm，分散性良好，由图1a中的插图可以看出聚丙烯酸生长在羟磷灰石表面；由图1b可以看出，铁-单宁酸网络包覆在纳米改性羟磷灰石表面；
18.图2是实施例1中纳米改性羟磷灰石x射线衍射图谱；从图2中可以看出，采用液相均相沉淀法制备的纳米改性羟磷灰石x射线衍射图谱与晶体材料粉末衍射卡片中的09-0432卡片一致，证明成功制备出了纳米改性羟磷灰石，锰离子掺杂的纳米改性羟磷灰石均显示出纯羟磷灰石的特征峰，说明锰离子没有抑制羟磷灰石的晶体结构；
19.图3是实施例1中纳米改性羟磷灰石的氮气等温吸脱附曲线；实施例1制备的纳米改性羟磷灰石的吸附等温线为iv型，等温线滞留回环呈狭长裂口型，说明该纳米改性羟磷灰石孔型较为统一，孔径分布窄，符合多孔材料的介孔尺寸分布特征，比表面积为72.63m2/g，孔体积为0.38cm3/g，该材料的高比表面积和高孔体积允许容纳大量药物分子或大分子药物，可以防止药物在恶劣环境中降解或失活；
20.图4是实施例2中含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在模拟肿瘤细胞内环境的缓冲溶液中盐酸阿霉素的释放行为；从图4可以看出，实施例1制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在ph＝4.5时，单宁酸中的酚羟基被质子化导致铁-单宁酸网络交联不稳定从而快速降解，前3h就有11.80％的盐酸阿霉素迅速释放，48h后释放的盐酸阿霉素量达到45.4％，并能长时间持续释放盐酸阿霉素，这说明实施例1制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸具有ph响应性能，能在酸性环境中快速释放化疗药物；
21.图5是实施例2中含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸与未包覆铁-单宁酸网络的纳米改性羟磷灰石在模拟人血液环境(ph＝7.4)的缓冲溶液中盐酸阿霉素的释放行为；从图5可以看出，未包覆铁-单宁酸网络的纳米改性羟磷灰石在实验开始即释放盐酸阿霉素，在24h内的释放量超过10％，最终释放量为15.1％；铁-单宁酸网络包覆的纳米改性羟磷灰石6h～8h后才开始释放盐酸阿霉素，24h后仅释放7.4％的盐酸阿霉素，这说明实施例1制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在中性环境中能够减少盐酸阿霉素的释放和损失；
22.图6是实施例2中含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在ph＝7.4和ph＝4.5的缓冲溶液中锰离子的释放行为；从图6可以看出，当ph＝7.4时，4小时内锰离子的的释放量小于10％；ph＝4.5时，4小时内锰离子的释放量达到65％以上；这说明实施例1制备的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸具有ph响应性能，能在酸性环境中快速释放锰离子；
23.图7是实施例2中含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在ph＝7.4和ph＝4.5的缓冲溶液中1h，2h和4h的t1加权图像；从图7可以看出，ph＝4.5的缓冲溶液中t1加权图像的信号强度明显高于ph＝7.4的缓冲溶液中t1加权图像的信号强度；并且在ph＝4.5的缓
冲溶液中，1小时内t1加权图像的信号强度快速增强，4小时内逐渐增强；这说明酸性条件下锰离子能在短时间内快速释放并在后续时间内持续缓慢释放，这与图6中锰离子的释放行为一致。
具体实施方式
24.实施例1：
25.一种对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的制备，具体实验方法如下：
26.一、纳米改性羟磷灰石的合成：将19mmol硝酸钙、1mmol硝酸锰、1g聚丙烯酸和30ml蒸馏水混合加入烧杯中在超声条件下充分溶解，在400rpm转速条件下磁力搅拌1h，向混合溶液中加入5ml磷酸氢二铵水溶液(2.4mol/l)，滴加质量分数为25％～28％的氨水使混合体系保持ph＝10，将混合体系转移到圆底烧瓶中，油浴加热到90℃，在400rpm转速条件下搅拌1h，室温继续搅拌24h，反应结束后静置陈化24h，用蒸馏水和乙醇交替洗涤3次，离心收集沉淀，在60℃条件下真空烘干，得到纳米改性羟磷灰石；
27.二、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石的合成：将60mg步骤一中制备的纳米改性羟磷灰石、3.5mg盐酸阿霉素和10ml蒸馏水在超声条件下加入烧杯中混合，在500rpm转速条件下黑暗中磁力搅拌72h；
28.三、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的合成：向步骤二磁力搅拌72h后的混合体系中加入200μl单宁酸水溶液(24mmol/l)和200μl氯化铁水溶液(24mmol/l)，并快速超声震荡，加入氢氧化钠溶液调节混合体系ph＝8，室温搅拌1h后离心收集沉淀，在60℃下真空干燥，得到了含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸；
29.实施例2：
30.对ph敏感的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸用于肿瘤诊断和治疗，具体是按照以下步骤进行：
31.一、含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸在不同ph环境中的缓释实验：分别将10mg含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸加入30ml ph＝4.5和ph＝7.4的缓冲溶液中，在37℃条件下恒温振荡124h，分别在第1h、2h、3h、5h、6h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、52h、76h、100h、124h取3ml上清液用可见分光光度法测定上清液中盐酸阿霉素的含量，同时补充3ml的缓冲溶液；为了设置对照组，将10mg未包覆铁-单宁酸网络的含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石在相同条件下进行缓释实验；
32.二、检测含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸的磁共振成像效果：分别将10mg含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸加入30ml ph＝4.5和ph＝7.4的缓冲溶液中，在37℃条件下恒温振荡4h。分别在第1h、2h和4h取3ml上清液，通过icp-oes分析检测锰离子的释放量，并进行1t磁共振成像扫描。未与含盐酸阿霉素的纳米改性羟磷灰石/铁-单宁酸混合的缓冲溶液作为对照组置于试管中，进行1t磁共振成像扫描。