大环化合物与mek抑制剂联用在用于治疗疾病药物中的用途
技术领域：
：1.本发明涉及含大环化合物尤其含氟大环化合物与mek抑制剂的联合用药用于治疗kras突变癌症中的用途。技术背景2.kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras)是人类癌症中最常见的突变癌基因之一(cosmicdatabase)，提示着疾病不良预后。在既往很多年内，因缺乏针对该基因的治疗手段，而被视为不可成药性靶点。随着近年研究不断进展，针对krasg12c突变的靶向药物sotorasib(amg510)在2021年5月29日获得fda加速批准上市，用于治疗至少经过一次系统治疗的krasg12c突变的非小细胞肺癌(nsclc)。3.kras蛋白是一种细胞膜结合的鸟苷酸三磷酸酶(gtpase)，它与gtp结合时处于激活状态，而kras的gtpase活性将gtp转换为失活的gdp，鸟苷酸交换因子(gef)，如sos1蛋白，可促使ras蛋白转化为gtp结合的激活状态。kras蛋白在gtp与gdp状态之间循环，重新合成的半衰期约24小时。kras犹如“细胞开关”，当其被细胞外刺激“打开开关”，将激活多种下游信号通路，包括致癌相关的raf-mek-erk、pi3k-akt-mtor、ral-gef通路，涉及细胞增殖、细胞周期调节、代谢改变、细胞存活与细胞分化等(liup,wangy,lix.targetingtheuntargetablekrasincancertherapy[j].actapharmaceuticasinicab,2019,9(5):871-879.)。[0004]点突变是kras突变常见形式，其导致kras处于一种持续gtp结合的活化状态，激活下游致癌信号通路。kras突变频率最高的三种肿瘤分别为胰腺癌(88％)、结肠直肠癌(45％-50％)和肺癌(31％-35％)。kras突变在肺腺癌中更为常见(20％-40％)，肺鳞癌中相对较少(5％)(jemala,siegelr,warde,etal:cancerstatistics,2008.cacancerjclin58:71-96,2008)。在多达30％的nsclc患者中可见kras突变，主要发生在密码子12和13。大量研究发现kras最常见突变为g12c，占39％；其次是g12v(18-21％)和g12d(17-18％)(clin.cancerres.18(2012)6169–6177；j.clin.oncol.35(2017)9021)。[0005]kras靶向治疗史[0006]目前已对kras靶点进行了将近40年的药物研发，包括靶向kras蛋白本身、翻译后修饰、膜定位、蛋白-蛋白互作、以及下游信号通路，但大多在临床研究中失败，原因可能是kras蛋白除了gtp/gdp结合口袋外，其他位置缺乏小分子药物结合区域。[0007]1)直接靶向kras[0008]由于kras蛋白生化的复杂性、gtp对kras的高亲和力、以及其有限的活性结合位点，直接靶向kras具有很大挑战性。虽然在计算机建模和结构结晶研究的最新进展中发现了直接结合特定ras构象的小分子，但这些早期化合物的结合亲和力仍需提高。虽然sotorasib(amg510)在2021年5月29日获得fda加速批准上市，但只针对g12c突变。[0009]2)间接靶向kras[0010]包括靶向翻译后修饰、膜定位、蛋白-蛋白互作以及抑制下游信号通路。肿瘤微环境重编程是肿瘤的主要特征，肿瘤细胞可以通过多种途径(比如免疫抑制、诱导血管生成、改变代谢)对肿瘤微环境进行重编程(hanahanetal.robertaweinberg,hallmarksofcancer:thenextgeneration.2011)。许多研究表明kras信号通路可以诱导大量的免疫调节因子的表达，比如tgfβ、gm-csf、cxcl8、il-6和il-10，这些免疫因子与肿瘤微环境相互作用，从而导致免疫抑制(cavalhoetal.krasoncogenicsignalingextendsbeyondcancercellstoorchestratethemicroenvironment.2018；cullisetal.janecullis,krasandtumorimmunity:friendorfoe2018；maldegemetal.mutantkrasattheheartoftumorimmuneevasion.2020)。kras突变驱动的肿瘤细胞可将基质细胞重编程为利于肿瘤发生的状态(cavalhoetal.targetingthetumormicroenvironment:anunexploredstrategyformutantkrastumors.2019)，通过阻碍自分泌细胞因子信号通路抑制肿瘤的发生(zhuetal.inhibitionofkras-driventumorigenicitybyinterruptionofanautocrinecytokinecircuit.2014)。其中一个例子就是kras突变的肿瘤细胞能分泌il-6。il-6在肺癌中上调，介导促进kras驱动的肺肿瘤发生的信号通路(brooksetal.il6trans-signalingpromoteskras-drivenlungcarcinogenesis.2016)。kras突变肿瘤细胞通过分泌血管内皮生长因子(vegf)和其他血管生成因子(如cxc趋化因子)促进血管生成，属于旁分泌过程(matsuoetal.k-raspromotesangiogenesismediatedbyimmortalizedhumanpancreaticepithelialcellsthroughmitogen-activatedproteinkinasesignalingpathways.2009)。旁分泌过程除影响免疫逃避和血管生成外，也可通过重塑基质改变肿瘤细胞过程。比如，kras突变细胞可以分泌胰岛素样生长因子-1(igf1r)，通过igf1r信号通路增加肿瘤细胞线粒体容量(tapeetal.oncogenickrasregulatestumorcellsignalingviastromalreciprocation.2016)。综上，对于kras突变的肿瘤患者，有效的治疗方案不仅需要靶向肿瘤细胞，还需要靶向肿瘤微环境。[0011]法尼基转移酶抑制：ras蛋白的法尼基化(farnesylation)是其正常生理功能和其致癌突变功能所必需的。法尼基转移酶抑制剂(ftis)tipifarnib和salirasib等已经进行了临床研究，但在kras突变的nsclc中未显示出疗效。[0012]mek抑制：mek抑制剂在临床研究中单药治疗效果不佳。selumetinib和trametinib是mek1/2的变构选择性抑制剂。selumetinib在临床前研究中对kras突变肿瘤具有活性。在一项ii期临床研究中，对于87例经治kras突变晚期nsclc患者，selumetinib联合docetaxel与docetaxel单药相比，os差异无统计学意义(9.4个月vs5.2个月，p＝0.21)。在另一项研究中，对于510例kras突变nsclc患者，selumetinib联合docetaxel与docetaxel单药相比，pfs未获得改善(hr＝0.93)。在一项比较trametinib与docetaxel治疗kras突变的nsclc患者的ⅱ期临床试验中，由于trametinib疗效在中期分析中超出无效边界，导致试验提前终止。(blumenscheinetal2015)因此，目前已知的mek抑制剂的单药和mek抑制剂联合化疗对于kras突变的nsclc患者均无效。[0013]固有耐药和适应性耐药是kras抑制剂在临床上作为单药使用时的限制因素，耐药机制包括kras核苷酸循环、负反馈重激活以及肿瘤细胞绕过对kras的依赖性(hallinetal,cancerdiscovery,2020,10(1),54-71)。通过与重激活mapk反馈途径、激活rtk诱导的pi3k通路、增加凋亡、抑制促炎肿瘤微环境的药物联用，可能是显著提高临床获益的方法。kras共价抑制剂联合免疫检测点抗体(如pd-1抗体)，表现出更好的药效(canonetal,cooperatetosuppressdoxorubicin-inducedapoptosisofbreasttumorcells.2006)。rhoa-fak是维持kras驱动的肺腺癌所必需的信号轴。体内抑制fak可下调p-akt，但不触发pi3k/akt依赖的代偿机制(konstantinidouetal.rhoa-fakisarequiredsignalingaxisforthemaintenanceofkras-drivenlungadenocarcinomas.2013)。[0018]fak在y925上的磷酸化构成了一个连接grb2的位点，crb2可以激活小gtp蛋白ras和下游erk2(mapk)(kantetietal.fakandpaxillin,twopotentialtargetsinpancreaticcancer.2016)。桩蛋白是粘着斑的主要成分，连接细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架，在肿瘤细胞中，scr和fak介导的磷酸化调控桩蛋白的功能。细胞脱离增加、akt/erk1/2和src抑制、细胞凋亡增加等证据显示，与单独抑制fak相比，fak与src的的双重抑制更有效(golubovskayaetal.simultaneousinhibitionoffocaladhesionkinaseandsrcenhancesdetachmentandapoptosisincoloncancercelllines.2003)。干扰素和炎症相关基因在kras突变结肠细胞系中富集，表现出对mek抑制的固有和获得性耐药(wagneretal.suppressionofinterferongeneexpressionovercomesresistancetomekinhibitioninkras-mutantcolorectalcancer.2019)。此外，src和fak可以调控stat3，从而控制vegf等血管生成因子以及其他细胞因子的表达(niuetaloncogeneconstitutivestat3activityup-regulatesvegfexpressionandtumorangiogenesis.2002；cavalhoetalcancerstargetingthetumormicroenvironment:anunexploredstrategyformutantkrastumors.2019)。[0019]jak2抑制：jak2为炎症细胞因子提供信号转导，抑制jak2可能会减少干扰素和炎症相关基因的分泌，并使kras突变细胞系对mek抑制剂敏感。研究报道，kras突变在缺乏il-6分泌的情况下可激活p-stat3(tyr705)，stat3介导bcl-xl上调有助于kras突变介导的结肠癌细胞的凋亡抵抗(zaananetal.themutantkrasgeneup-regulatesbcl-xlproteinviastat3toconferapoptosisresistancethatisreversedbybimproteininductionandbcl-xlantagonism.2015)。因此，抑制jak2可以调控stat3的磷酸化，从而在包括结直肠癌等kras突变的肿瘤中产生协同的凋亡效应。在临床前研究中，抑制mek会通过jak和fgfr激酶活性导致stat3自分泌活化，从而导致耐药性的产生。mek抑制剂cobimetinib联合jak1/2抑制剂ruxolitinib和多靶点激酶抑制剂ponatinib(包含fgfr抑制剂在内)在小鼠异种移植瘤模型中表现出增强的疗效(leeetal.drugresistanceviafeedbackactivationofstat3inoncogene-addictedcancercells.2019)。[0020]综上，src、fak和jak2通过调控肿瘤中的血管生成，在肿瘤微环境中构建促肿瘤生长的免疫响应，以及肿瘤细胞内和细胞外的信号传递，在kras突变肿瘤中发挥重要作用。而靶向突变活化ras蛋白的中心下游信号效应因子的药物研发一直存在挑战。src/fak/jak2抑制剂与mek抑制剂(尤其是trametinib)的联用，代表了一种新的治疗方式，最大限度地提高了mek抑制剂抗肿瘤活性和应答时间，特别是trametinib对kras突变患者的治疗获益。[0021]化合物1，新一代多靶点在研药物，在治疗浓度下，可以有效抑制src/fak/jak2激酶活性。在一系列具有不同类型kras突变的肺癌、胰腺癌和结直肠癌细胞中，与单药相比，化合物1联用mek抑制剂trametinib抗肿瘤增殖活性显著增加，肿瘤细胞发生凋亡比例增加。在一部分kras突变的肿瘤亚型中，trametinib与化合物1联用后可抑制因trametinib诱导的akp磷酸化(pakt)水平反弹。然而，src抑制剂dasatinib、jak1/2抑制剂ruxolitinib或fak抑制剂defactinib与trametinib分别联用后并不能抑制trametinib诱导的akt磷酸化，表明联合药效增加需要同时抑制src/fak/jak2。在kras突变的小鼠异种移植实验中，联用后的体内抗肿瘤作用强于trametinib单药。trametinib与化合物1联用可以通过持续抑制突变的kras信号通路从而发挥更强和更持久的抗肿瘤作用。同时抑制src、fak和jak2的药物联合mek抑制剂，可能是有效靶向kras突变癌症的一种有前景的治疗方法。此外，src、fak和jak2的联合抑制可能在其他炎症相关疾病中具有潜在的作用，比如哮喘、炎性肠病、溃疡性结肠炎，克罗恩病和纤维化。技术实现要素：[0022]本发明涉及一种所示的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，立体异构体，联合mek抑制剂在制备治疗疾病药物中的用途，[0023][0024]其中所述r为氢、卤素、甲基、乙基。[0025]进一步地本发明所述用途，其中式(i)化合物中r为氢或f；更为优选r为f。[0026]进一步地本发明所述的用途，其中式(i)化合物为抑制fak、src或jak2的抑制剂。[0027]在一些实施方案中本发所述用途,其中所述疾病为癌症或炎症相关疾病，其中所述癌症是至少一个遗传改变的致癌基因先前已经在患者中鉴定，其中所述至少一种遗传改变的致癌基因是遗传改变的kras，遗传改变的mek；其中所述炎症相关疾病为哮喘、炎性肠病、溃疡性结肠炎，克罗恩病和纤维化。[0028]进一步地所述的用途，其中所述遗传改变的kras包括选自g12c，g12v，g12d，g12a，g13c，g12s，d12r，d12f，g13d，g13v，g13r，g13e，q61h，q61e，q61l和q61r中的至少一种突变；或选自g12d，g13d和q61h；或者kras包括至少一个不是g12a，g12c，g12s，g12v和q61k的突变。[0029]进一步地本发明所述的用途，其中所述疾病是结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌或胃癌。[0030]进一步地本发明所述的用途，其中式(i)的化合物的给药量为约1mg至约1000mg。[0031]进一步地本发明所述的用途，其中mek抑制剂的给药量为约0.5mg至约100mg。[0032]进一步地本发明所述的用途，其中mek抑制剂是曲美替尼，司鲁美替尼，ly3214996，r05126766，tno155(shp099)或米达美替尼或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。优选曲美替尼或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。[0033]进一步地本发明所述的用途，其中式(i)化合物以约1-500mg的量每天施用一次或每天施用两次。[0034]进一步地本发明所述的用途，其中mek抑制剂以约1-100mg的量给药。[0035]在一些实施方案中本发明的用途，其中式(i)化合物与mek抑制剂同时给药。[0036]在一些实施方案中本发明的用途，其中式(i)的化合物在mek抑制剂之前给药。[0037]在一些实施方案中本发明的用途，其中式(i)的化合物在mek抑制剂之后给药。[0038]在一些实施方案中本发明的用途，其中所述患者还没有接受过先前的治疗。[0039]在一些实施方案中本发明的用途，其中所述患者已经接受了一种或多种化疗剂或免疫疗法的至少一种先前治疗。[0040]在一些实施方案中本发明的用途，其中所述患者已经接受了一种或多种化疗剂或免疫疗法的至少一种先前治疗，并且已经发展出对所述治疗的获得性抗性，和/或发展出对所述治疗的旁路抗性。[0041]另一方面本发明提供一种具有式(i)化合物或其药学上可接受的盐，与治疗有效量的mek抑制剂组合，用于治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法中。[0042]另一方面本发明一种所示的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，立体异构体，在制备治疗fak、src或jak2相关疾病药物中的用途[0043][0044]其中所述r为氢、卤素、甲基、乙基；作为优选r为h或氟，更为优选r为f。[0045]进一步地所述用途为癌症或自身免疫疾病。[0046]进一步地所述用途，其中癌症为：肺癌、胰腺癌、直肠癌。[0047]进一步地所述用途，其中所述自身免疫疾病为：哮喘、炎性肠病、溃疡性结肠炎，克罗恩病和纤维化。[0048]本文所用术语“癌症”；包括：但不限于肺癌，如非小细胞肺癌(nsclc)，腺癌，肺鳞癌，大细胞癌，和大细胞神经内分泌肿瘤，小细胞肺癌(sclc)，神经母细胞瘤，炎性肌成纤维细胞瘤，成人肾细胞癌，小儿肾细胞癌，乳腺癌，例如三阴性乳腺癌，三阳性乳腺癌，结肠腺癌，胶质母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤，甲状腺癌，例如间变性甲状腺癌，胆管癌，卵巢癌，胃癌，例如胃腺癌，结肠直肠癌(crc)，炎性肌成纤维细胞瘤，血管肉瘤，上皮样血管内皮瘤，肝内胆管癌，甲状腺乳头癌，痰盂瘤，肉瘤，星形细胞瘤，脑下胶质瘤，分泌性乳腺癌，乳房模拟癌，急性髓性白血病，先天性中胚层肾瘤，先天性纤维肉瘤，ph样急性淋巴母细胞白血病，甲状腺癌，皮肤癌，如皮肤黑色素瘤，头颈部鳞状细胞癌(hnsc)，儿科神经胶质瘤cml，前列腺癌，卵巢浆液性膀胱癌，皮肤黑色素瘤，抗去势前列腺癌，霍奇金淋巴瘤，浆液性和清澈性细胞子宫内膜癌。可以理解，术语“癌症”；包括原发性癌症或原发性肿瘤和转移性癌症或转移性肿瘤。例如，转移性nsclc，转移性crc，转移性胰腺癌，转移性结肠直肠癌，转移性hnscc等。可以理解，术语“癌症”包括涉及某些基因上调或某些基因中的遗传突变的癌症，所述基因可导致疾病进展，例如表皮生长因子受体的上调。[0049]本发明描述的各个方面的一些实施例中，癌症由至少一种选自遗传改变的kras的遗传改变的致癌基因介导，已经在患者中鉴定了遗传改变的nras，遗传改变的hras，遗传改变的braf，遗传改变的mek或遗传改变的pi3k，或这样的遗传改变的致癌基因。在这里描述的各个方面的一些实施例中，该癌症是由基因改变的kras介导的非小细胞肺癌，该kras包括选自g12c，g12v，g12d，g12a，g13c，g12s，d12r，d12f，g13d，g13v，g13r，g13e，q61h，q61e，q61l和q61r中的至少一种突变。在本文所述各方面的一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌，其由遗传改变的kras介导，所述kras包含选自g12d，g13d和q61h中的至少一种突变；在本文所述的各个方面的一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌，其由遗传改变的kras介导，所述kras包含至少一个不是g12a，g12c，g12s，g12v或q61k的突变。[0050]本发明所述的各个方面的一些实施例中，所述癌症是由遗传改变的kras介导的结肠直肠癌，所述kras包含选自g12d，g12v，g13d，a146t，g12c，g12a，g12s，k117n，q61k，g12r，m72v，s17g，k5r，d69g，g13c，g13r，q61h，k117e，q61l，q61r，k117r，a146v，a146p，k147n和r97i中的至少一种突变。在本文所述的各个方面的一些实施方案中，所述癌症是由遗传改变的kras介导的胰腺癌，所述kras包含选自g12d，g12v，g12r，q61h，g12c和g12s中的至少一种突变。[0051]本发明所述“kras”；指kras基因，由kras基因转录产生的相应mrna，或由kras基因编码的蛋白质，称作k-ras，涉及ras/mapk信号通路。术语kras基因，k-ras和ras/mapk信号途径将为本领域技术人员所知和理解。可以理解，kras突变发生在所有人转移性癌症中的大约七分之一中，并且这些突变可以发生在kras基因编码序列中的多种位置。kras突变主要发生在kras密码子12和13中，也发生在低频率的密码子18，61,117和146中，并且对基于密码子和错义突变的肿瘤细胞信号传导具有明显的作用。kras突变的例子包括但不限于krasg12d，krasg12v，krasg12r，krasg12s，krasg13c，krasg13d，krasa18d，krasq61h，krask117n等。[0052]本发明所用的“mek抑制剂”；包括但不限于本领域已知的抑制mapk/erk激酶-1和-2基因或抑制由mapk/erk激酶-1和-2基因编码的蛋白质(mek1和mek2；map2k1和map2k2)的任何化合物或试剂。用于本文所述方法和组合物的示例性mek抑制剂包括，但不限于曲美替尼，匹马沙替尼(ast03026)；硒美替尼(azd6244)；考比美替尼；米达美替尼(pd-0325901)；瑞法美替尼(rdea119)；tak733；mek162；r05126766；wx-554；r04987655；gdc-0973；azd8330；azd6244；和ci-1040(pd-184352)；gdc-0623；hl-085。[0053]本发明所述“曲美替尼”涉及具有下式的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，也称作gsk1120212或n-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6，8-二甲基-2，4，7-三氧代-3，4，6，7-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-1(2h)-基}苯基)乙酰胺。曲美替尼是具有潜在抗肿瘤活性的促分裂原活化蛋白激酶激酶(mekmapk/erk激酶)的口服生物可利用抑制剂。曲美替尼特异性结合并抑制mek1和2，导致在各种癌症中抑制生长因子介导的细胞信号传导和细胞增殖。[0054]曲美替尼药学上可接受的盐为曲美替尼与酸成盐获得，包括但不限于甲磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、二氟醋酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、萘磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、以及磷酸盐。[0055]“药学上可接受的盐”是指，包括碱根离子与自由酸形成的盐或酸根离子与自由碱形成的盐，例如包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、草酸盐等。[0056]“有效量”或“有效治疗量”包含足以改善或预防医学病症的症状或者病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可以根据以下因素而变化；如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒副作用的最大剂量或给药方案。[0057]化合物1结构为：在专利wo2021115401中报道。[0058]化合物2结构为：参考专利wo2019210835实施例6制备。[0059]曲美替尼(trametinib)购自上海皓元生物医药科技有限公司，批号30987。[0060]试验例1：联合用药体外增殖抑制实验[0061]实验目的：通过检测化合物作用后肿瘤细胞活力，以ic50值为指标，评价联合用药和单独用药对hct116等kras突变细胞的体外增殖抑制作用。[0062]实验材料：hct116、kp-4、sw480和nci-h23全部购于南京科佰，cellcounting-litetm2.0[0063]实验方法：[0064](1)取对数生长期细胞hct116、kp-4、sw480和nci-h23，胰酶消化，1000rpm离心3分钟，弃上清，培养基重悬后计数，按2-5*103个/每孔接种到96孔板中，于37℃，5％co2培养箱中培养24h。[0065](2)将待测化合物溶解在100％dmso中，配制成10mm储存液，4℃避光储存。设置单药孔、联用孔、对照孔和空白孔。单药孔为梯度浓度的化合物1或化合物2或trametinib(初始浓度为3μm)，3倍稀释，共9个浓度；联合用药孔为梯度浓度的trametinib和1μm的化合物1或化合物2；对照孔含细胞和培养基；空白孔只含培养基。所有孔dmso含量为0.5％。加药后将细胞置于37℃，5％co2培养箱继续培养72h。[0066](3)取出待测细胞培养板，室温平衡30分钟，加入与待测细胞培养物等体积的cellcounting-litetm2.0，振荡混匀10分钟充分裂解细胞，静置5分钟后采用多功能酶标仪检测发光信号。[0067]数据分析：[0068]计算公式：细胞活力＝(ls-lb)/(lc-lb)*100％[0069]其中：ls代表实验孔发光值，lb代表空白孔发光值，lc代表对照孔发光值。[0070]拟合量效曲线[0071]以浓度的log值作为x轴，细胞活力为y轴，采用分析软件graphpadprism5的log(抑制剂)vs.响应-变量斜率(log(inhibitor)vs.response–variableslope)拟合量效曲线，从而得出各个化合物的ic50值。[0072][0073]实验结论：trametinib联用化合物1或化合物2，对肿瘤细胞hct116、nci-h23、kp-4和sw480的体外增殖抑制作用显著强于各自单独作用时的体外增殖抑制作用。[0074]实验例2：jak2激酶活性检测[0075]实验目的：检测化合物对jak2激酶抑制活性[0076]实验材料：[0077][0078]实验方法：[0079]1)配制1x激酶缓冲溶液(ddh2o配制，含40mmtris、20mmmgcl2、0.10％bsa、0.5mmdtt)[0080]2)在稀释板中用dmso对化合物进行3倍稀释，化合物起始浓度为10μm[0081]3)将化合物50倍稀释到1x激酶反应缓冲液中，在振荡器上震荡20分钟[0082]4)用1x的酶反应缓冲液配制准备2x激酶[0083]5)向反应板中每孔加入2μl激酶(步骤4中配制)[0084]6)向每孔加入1μl在缓冲液中稀释好的化合物，用封板膜封住板子1000g离心30秒，室温放置10分钟[0085]7)用1x的酶反应缓冲液配制4xmbpprotein和atp(atp终浓度10μm)混合液，向反应板中加入1μl4xmbpprotein/atp混合液[0086]8)用封板膜封住板子1000g离心30秒，室温反应60分钟[0087]9)转移4μladp-glo到384反应板中1000rpm,离心1min，25℃孵育40min[0088]10)转移8μldetection溶液到384反应板中1000rpm,离心1min，25℃孵育40min[0089]11)使用biotek多功能读板机读取rlu(relativeluminescenceunit)信号。信号强度用于表征激酶的活性程度[0090]12)数据处理：[0091]a)化合物抑制率％＝(1-(rlu待测物-rlu阳性对照)/(rlu阴性对照-rlu阳性对照))*100％[0092]b)用graphpad7.0软件进行数据分析。利用以下非线性拟合公式来得到化合物的ic50(半数抑制浓度)：y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-x)*hillslope))。其中，x为化合物浓度log值，y为抑制率(％inhibition)。[0093]13)实验结果：[0094][0095]实验结论：化合物1和化合物2对jak2激酶有显著抑制作用。[0096]实验例3：fak激酶活性检测[0097]实验目的：检测化合物对fak激酶抑制活性[0098]实验材料：[0099][0100][0101]实验方法：[0102]1)配制1x激酶缓冲溶液(ddh2o配制，含5mmmgcl2；1mmdtt；3.9nmseb)[0103]2)用100％dmso将待测化合物稀释5倍，在96孔稀释板中进行3倍等比稀释,取1μl的化合物加入39μl的激酶反应缓冲液中，在微孔板振荡器上震荡20min[0104]3)转移2μl的2.5x激酶到384反应板中,加入1μl的待测化合物(步骤2中准备)到384反应板中(greiner,784075)，1000rpm，离心1min,25℃孵育10min[0105]4)转移2μl2.5x底物混合物到384反应板中，1000rpm，离心1min，25℃孵育40min[0106]5)用htrf检测缓冲液配制2xsa-xl665/tk-antibody-cryptate混合液[0107]6)每孔加入5μlsa-xl665/tk-antibody-cryptate，1000g离心30秒，室温反应1小时[0108]7)用biotek读615nm(cryptate)和665nm(xl665)的荧光信号[0109]8)数据分析[0110]a)计算每孔的比率(ratio_665/615nm)[0111]b)将每孔比率代入以下公式计算相应抑制率：化合物抑制率％＝(1-(化合物-阳性对照)/(阴性对照-阳性对照))*100％[0112]c)以化合物浓度的log值为x轴，百分抑制率为y轴，采用分析软件graphpadprism7.0拟合量效曲线得到化合物的ic50，拟合公式为y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-x)*hillslope))。[0113]实验结果：[0114][0115]实验结论：化合物1和化合物2对fak激酶有显著抑制作用。[0116]实验例4：src激酶活性检测[0117]实验目的：检测化合物对src激酶抑制活性[0118]实验材料：[0119]材料和试剂厂家货号srccarna08-173kinasesubstrate4gl112395dmsosigmad8418-1l384-wellplatecorning3573srccarna08-173仪器和设备厂家货号或型号离心机eppendorf5430echo550labcyteecho550酶标仪perkinelmercaliperezreader[0120]实验方法：[0121]1)配制1x激酶缓冲溶液[0122]2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为10μm起始，3倍稀释，共10个浓度，，单孔。在384source板中稀释成100倍终浓度的100％dmso溶液。使用分液器echo550向目的板384孔板转移250nl100倍终浓度的化合物。阳性和阴性对照孔加入250nldmso。[0123]3)用1x激酶缓冲溶液配制2.5倍终浓度的激酶溶液。[0124]4)在化合物孔和阳性对照孔分别加入10μl的2.5倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加10μl的1x激酶缓冲溶液。[0125]5)1000rpm离心30秒，反应板振荡混匀后室温孵育10分钟。[0126]6)用1x激酶缓冲溶液配制25/15倍终浓度的atp和kinasesubstrate4的混合溶液。[0127]7)加入15μl的25/15倍终浓度的atp和kinasesubstrate4的混合溶液，起始反应。[0128]8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育30分钟。[0129]9)加入30μl终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。[0130]10)用caliperezreader读取转化率。[0131]11)数据分析：[0132]a)计算抑制率：化合物抑制率％＝(conversion％max-conversion％sample)/(conversion％max-conversion％min)*100％，其中conversion％sample是样品的转化率读数；conversion％min是阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；conversion％max是阳性对照孔均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。[0133]b)以化合物浓度的log值为x轴，百分抑制率为y轴，采用分析软件graphpadprism5.0拟合量效曲线得到化合物的ic50，拟合公式为y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-x)*hillslope))。[0134]实验结果：[0135][0136]实验结论：化合物1和化合物2对src激酶均有抑制作用。[0137]试验例5：联合用药在krasg12v突变肺癌minipdx模型上的抗肿瘤药效学评价实验目的：通过建立krasg12v突变肺癌的minipdx模型并检测化合物的抗肿瘤药效,以肿瘤细胞相对增殖率为指标，评价联合用药和单独用药对krasg12v突变肺癌的体内增殖抑制作用。[0138]实验材料：[0139]1)体内移植瘤模型信息：[0140]模型编号病人性别病人年龄突变类型病理描述ld1-0025-200616女75krasg12v低-中分化腺癌[0141]2)实验动物：balb/c-nu小鼠18只，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购买于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。[0142]3)其他试剂及仪器：[0143][0144][0145]实验方法：[0146]1)minipdx制备：[0147]a)复苏实验所需的肿瘤模型，待肿瘤长至500-800mm3时，分别手术无菌摘取肿瘤组织，于生物安全柜中去除非肿瘤组织和坏死组织；[0148]b)将肿瘤组织切成1-3立方毫米小块，使用消化液37℃消化肿瘤块1-2小时，之后过70μm筛网收集细胞悬液，1200rpm离心3分钟去除上清，使用10ml含1％fbs的pbs重悬细胞并血球计数板计数；[0149]c)去除鼠源细胞后，1200rpm离心3分钟去除上清，用bio-mpm-1细胞培养液(不含血清)重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞密度。将细胞悬液灌装至minipdx装置中；[0150]d)按照体重对小鼠进行随机分组；将minipdx装置接种至小鼠背部皮下，每只小鼠接种2个minipdx装置。接种当天为第0天，整个实验进行7天。[0151]2)小鼠分组及给药：[0152]在第0天时开始按下表进行分组及给药。[0153][0154][0155]注：n：重复个数；给药体积为10μl/g；qd×7：每天给药1次，共7次；p.o.：口服给药。[0156]在整个实验过程中，对实验动物的使用和观察均按照aaalac动物使用和管理的相关规定进行。实验动物在接种minipdx肿瘤装置后，每天进行观察，对所有的实验动物进行行为、进食、进水、毛发进行监测，并记录小鼠体重。[0157]第六天给药(即第7次给药)24小时后，实验结束，所有小鼠安乐死，取出minipdx装置。用celltiter-glo法，检测细胞活力。[0158]数据处理：[0159]1)计算公式：[0160]a)肿瘤细胞相对增殖率(％)＝(v药物处理组d7-v对照组d0)/(v对照组d7-v对照组d0)×100％。(v药物处理组d7：第7天给药组荧光值；v对照组d7：第7天对照组荧光值；v对照组d0：第0天对照组荧光值)。[0161]b)所有荷瘤鼠体重每天测量一次。同时计算给药后小鼠体重增长变化比率：rcbw(％)＝(bwi–bw0)/bw0×100，bwi为开始给药后的平均体重，bw0为首次给药时的平均体重。[0162]2)数据分析：[0163]所有数据均采用mean±sem表示，用student’st-test比较给药组与对照组之间的ctg检测后荧光值有无显著性差异。所有的数据均用graphpad进行分析。p《0.05即认为具有显著性差异。[0164]实验结果：[0165]在ld1-0025-200616krasg12v肺癌minipdx药效模型中，化合物1,10mg/kg、tpx-0005,10mg/kg、曲美替尼,1mg/kg、曲美替尼,1mg/kg+tpx-0005,10mg/kg和曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg给药组在分组给药后第7天肿瘤细胞相对增殖率分别为57％、37％、46％、55％和28％。与对照组相比较，曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg联合给药组荧光值(rlu)显著性减少(p《0.05)，表现出显著的抑瘤作用。此外，与相应的单药治疗组相比较，曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg联合给药组具有协同或相加作用。给药期间，所有给药组的小鼠均没有表现出体重明显下降的现象(rcbw％《-15％)，也未观察到其他异常行为和表现，所有小鼠在该模型上对受试剂量下的药物均具有良好的耐受性。[0166][0167]实验结论：曲美替尼联用化合物1，在krasg12v突变肺癌minipdx模型中对肿瘤细胞的增殖抑制作用显著强于曲美替尼单用或化合物1单用时的增殖抑制作用。化合物1与曲美替尼的联用显著优于tpx-0005与曲美替尼的联用。[0168]试验例6：联合用药在krasg12d突变肺癌minipdx模型上的抗肿瘤药效学评价实验目的：通过建立krasg12d突变肺癌的minipdx模型并检测化合物的抗肿瘤药效,以肿瘤细胞相对增殖率为指标，评价联合用药和单独用药对krasg12d突变肺癌的体内增殖抑制作用。[0169]实验材料：[0170]1)体内移植瘤模型信息：[0171]模型编号病人性别病人年龄突变类型病理描述ld1-0025-370740男70krasg12d低分化腺癌[0172]2)实验动物：balb/c-nu小鼠18只，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购买于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。[0173]3)其他试剂及仪器：[0174][0175]实验方法：[0176]1)minipdx制备：[0177]a)复苏实验所需的肿瘤模型，待肿瘤长至500-800mm3时，分别手术无菌摘取肿瘤组织，于生物安全柜中去除非肿瘤组织和坏死组织；[0178]b)将肿瘤组织切成1-3立方毫米小块，使用消化液37℃消化肿瘤块1-2小时，之后过70μm筛网收集细胞悬液，1200rpm离心3分钟去除上清，使用10ml含1％fbs的pbs重悬细胞并血球计数板计数；[0179]c)去除鼠源细胞后，1200rpm离心3分钟去除上清，用bio-mpm-1细胞培养液(不含血清)重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞密度。将细胞悬液灌装至minipdx装置中；[0180]d)按照体重对小鼠进行随机分组；将minipdx装置接种至小鼠背部皮下，每只小鼠接种2个minipdx装置。接种当天为第0天，整个实验进行7天。[0181]2)小鼠分组及给药：[0182]在第0天时开始按下表进行分组及给药。[0183][0184]注：n：重复个数；给药体积为10μl/g；qd×7：每天给药1次，共7次；p.o.：口服给药。[0185]在整个实验过程中，对实验动物的使用和观察均按照aaalac动物使用和管理的相关规定进行。实验动物在接种minipdx肿瘤装置后，每天进行观察，对所有的实验动物进行行为、进食、进水、毛发进行监测，并记录小鼠体重。[0186]第六天给药(即第7次给药)24小时后，实验结束，所有小鼠安乐死，取出minipdx装置。用celltiter-glo法，检测细胞活力。[0187]数据处理：[0188]1)计算公式：[0189]a)肿瘤细胞相对增殖率(％)＝(v药物处理组d7-v对照组d0)/(v对照组d7-v对照组d0)×100％。(v药物处理组d7：第7天给药组荧光值；v对照组d7：第7天对照组荧光值；v对照组d0：第0天对照组荧光值)。[0190]b)所有荷瘤鼠体重每天测量一次。同时计算给药后小鼠体重增长变化比率：rcbw(％)＝(bwi–bw0)/bw0×100，bwi为开始给药后的平均体重，bw0为首次给药时的平均体重。[0191]2)数据分析：[0192]所有数据均采用mean±sem表示，用student’st-test比较给药组与对照组之间的ctg检测后荧光值有无显著性差异。所有的数据均用graphpad进行分析。p《0.05即认为具有显著性差异。[0193]实验结果：[0194]在ld1-0025-370740krasg12d肺癌minipdx药效模型中，化合物1,10mg/kg、tpx-0005,10mg/kg、曲美替尼,1mg/kg、曲美替尼,1mg/kg+tpx-0005,10mg/kg和曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg给药组在分组给药后第7天肿瘤细胞相对增殖率分别为97％、60％、30％、54％和19％。与对照组相比较，所有给药组荧光值(rlu)均呈现出不同程度地减少，其中曲美替尼,1mg/kg给药组和曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg给药组荧光值显著减少(p《0.05)，表现出显著的抑瘤作用。此外，与对应的单药治疗组相比较，曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg联合给药组表现出协同或相加效应。给药期间，曲美替尼,1mg/kg+化合物1,10mg/kg给药组在第6天有一只小鼠体重下降了15.14％，该组其余两只小鼠体重变化正常。同时，其余所有给药组的小鼠均没有表现出体重明显下降的现象(rcbw％《-15％)，也未观察到其他异常行为和表现，表明所有荷瘤小鼠在该模型上对受试剂量下的各给药组均能够耐受，个别小鼠体重下降可能是个体差异所致。[0195][0196]实验结论：曲美替尼联用化合物1，在krasg12d突变肺癌minipdx模型中对肿瘤细胞的增殖抑制作用显著强于曲美替尼单用或化合物1单用时的增殖抑制作用。化合物1与曲美替尼的联用显著优于tpx-0005与曲美替尼的联用。当前第1页12当前第1页12