一种仿生生物人工肝芯片及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种仿生生物人工肝芯片。


背景技术：

2.急性肝衰竭(acute liver failure,alf)是目前临床上最具生命危险的肝脏疾病之一，患者在短期内极有可能会出现位于肝细胞的大面积急性坏死，肝功能也可受到严重损伤，甚至肝昏迷等临床症状。目前其临床治疗方法及特效药物等极其匮乏，其药物治疗为非特异性放射性药物治疗，且预后较差，病死率高。肝移植手术是目前唯一一种明确有效的治疗方法，但往往受到肝脏来源大量短缺的严重限制，手术治疗费用相对较昂贵，相当一部分肝病患者往往在等待最新肝源的过程中死亡，因此我们迫切需要积极寻找新的肝脏治疗手段用来辅助或直接替代传统的肝脏器官进行移植以有效治疗alf。
3.新兴的生物人工肝(bioartifcial livers,bals)系统能以人工方法替代或部分替代肝功能，给以短暂支持，帮助自体肝细胞再生，促进功能恢复或作为肝移植的过渡辅助。一般来说，bal 系统的构建主要集中在建立合适的生物材料支架来培养肝脏及相关细胞，从而成功地在体外重现肝功能。现有的研究由常用的块状或多孔材料制成的支架可以有效地增加细胞密度，但这些材料的孔隙率和结构的不可控性限制了细胞生长和进一步的功能再生。此外，现有的bal 系统通常缺乏对液体循环和细胞来源的充分考虑，导致难以实现真实的肝脏功能以及真实活体器官中的动态物质交换和细胞-细胞或细胞-环境的相互作用。生物人工肝主要是以反应器作为种子细胞的反应场所，从而与血浆进行物质交换。目前生物反应器存在的瓶颈在于其仅仅只是细胞与循环管道的机械组装，不能模拟真正的肝小叶结构。
4.因此，亟需构建具有肝小叶结构功能单元的肝脏芯片的新型bal系统。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术中的不足，提供一种仿生生物人工肝芯片。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种仿生生物人工肝芯片，所述芯片由具有微孔道的水凝胶支架、位于水凝胶支架微孔道内的肝小叶结构功能单元构成；所述肝小叶功能结构单元由半透膜微管和环绕在半透膜微管周围的肝细胞微载体构成。
8.为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
9.进一步地，上述仿生生物人工肝芯片通过以下方法制备：
10.s1、利用3d打印构建具有微孔道的水凝胶支架，将半透膜微管置于水凝胶支架的微孔道内；
11.s2、将肝细胞微载体通入水凝胶支架的微孔道内，使肝细胞微载体环绕在半透膜微管周围。
12.进一步地，步骤s1中，水凝胶支架的材料是聚二甲基硅氧烷(pdms)。
13.进一步地，步骤s1中，半透膜微管的材料是聚乙烯-乙烯醇共聚物(ethylene vinyl alcoholcopolymer,evoh)。
14.进一步地，步骤s1中，半透膜微管的直径是175μm，半透膜微管的厚度是40μm，半透膜微管的分子量滤除点是150kd。
15.一种通过上述方法制备的仿生生物人工肝芯片用于制备仿生生物人工肝。
16.本发明的有益效果是：本发明通过将肝细胞微载体和半透膜微管结合，使肝细胞包裹在半透膜微管周围，构建了肝小叶结构功能单元，其同时具有功能性细胞聚集体和有效的循环系统，粘附在肝细胞微载体上肝细胞具有良好的细胞活性，半透膜微管通过管壁上的孔隙与外层血浆进行物质交换。结合肝小叶结构功能单元和pdms水凝胶支架构建了仿生生物人工肝芯片，并结合双向循环系统制备了仿生生物人工肝，用于alf兔血浆的过滤，经过仿生生物人工肝治疗后的兔子的反应迟缓、嗜睡等情况有所缓解，恢复了一定的活力，证明了其治疗有效，显示了仿生生物人工肝在组织工程中的应用前景。
附图说明
17.图1展示了肝细胞微载体3d培养储备功能优于细胞平板培养；
18.图2展示了肝小叶结构功能单元的建立；
19.图3展示了基于肝小叶结构功能单元的肝脏芯片的构建；
20.图4展示了仿生生物人工肝治疗急性肝衰竭的作用研究。
具体实施方式
21.实施例1肝细胞微载体3d培养储备功能评估
22.1)材料和方法
23.在肝细胞达到长满培养皿底面积80％～90％时，弃去原培养基，使用pbs洗涤3次，用新的培养基将icg稀释至工作浓度：1mg/ml，分别加入平板培养组以及与微载体共同培养组中，37℃、5％co2条件下连续孵育15min，用pbs洗涤2次，在光学显微镜下仔细观察细胞对icg的摄取情况，拍照记录，加入新的培养基，37℃、5％co2条件下连续培养6h。
24.2)结果
25.如图1所示，肝细胞微载体3d培养储备功能优于细胞平板培养。图1是两组icg 6h释放情况量化比对图，可见微载体组在每个时间段的icg释放能力均优于平板培养组，说明微载体组能较好地维持功能细胞的摄取、储备和排泄能力。
26.实施例2具有肝小叶结构功能单元的仿生生物人工肝芯片的构建
27.1)材料和方法
28.利用3d打印技术和负性复制构建具有微孔道的pdms水凝胶支架；以evoh为原材料，构建直径为175μm，厚度为40μm，分子量滤除点为150kd的半透膜微管，将半透膜微管置于水凝胶支架的每个微孔道内；向pdms水凝胶支架的微孔道内分别通入血浆和肝细胞微载体(培养基)，使肝细胞在半透膜微管外部均匀紧密的排列，通过半透膜微管的孔隙与外层血浆进行物质交换，从而建立具有肝小叶结构功能单元的仿生生物人工肝芯片，并在显微镜下观察其结构情况。
29.2)结果
30.构建得到的肝小叶结构功能单元如图2a所示，图2b展示了肝小叶结构功能单元共聚焦显微镜下的横截面，图2c展示了肝小叶结构功能单元共聚焦显微镜下的纵切面，图2d展示了肝小叶结构功能单元光学显微镜下的纵切面。通过使用3d共焦显微镜和光学显微镜可以观察到在构建出的单个肝小叶结构功能单元中，肝细胞微载体能够在半透膜微管周围均匀分布，肝细胞微载体上存在的荧光表明微载体上有大量细胞附着(图2e)，证明肝细胞在肝细胞微载体上具有较高的黏附性。
31.实施例3仿生生物人工肝的构建
32.1)材料和方法
33.将实施例2中构建的仿生生物人工肝芯片用pdms上板密封，预留两套进出口，一套用于血浆循环，另一套用于培养基循环，制备得到仿生生物人工肝。
34.cck-8检测：接种后的细胞悬液于96孔板中(100μl/孔，注意不要产生气泡)进行预培养24h，同时分别设置空白组和对照组；向每孔加入10μl的cck-8solution(沿细胞壁加入，后轻轻混匀，避免产生气泡)；在细胞培养箱中孵育一段时间；酶标仪测定450nm处的吸光值。
35.2)结果
36.图3a展示了具有3d结构的，基于pdms构建的仿生生物人工肝的结构，图3b是不同流速下尿素分泌实验，图3c是不同流速下cck-8实验，图3d是不同流速下alb分泌实验；在0.5ml/h流速时，细胞的细胞活性、alb及尿素分泌水平明显强于0.25ml/h及1ml/h组，因此，为了保证细胞活性，维持细胞功能，本实验中我们采用0.5ml/h流速对细胞进行3d循环培养。
37.实施例4仿生生物人工肝的应用
38.1)材料和方法
39.兔急性肝衰竭模型建立：称取d-gal，使用50g/l的葡萄糖溶液将其充分溶解，将d-gal 浓度调整至10％，预留定容体积。通过使用ph仪，向d-gal溶液中加入1mol/l的naoh溶液，将溶液ph值调节至6.8-7.2，定容后使用直径为0.22μm的微孔滤器将溶液进行过滤除菌。采用4月龄新西兰兔，术前禁12h，禁食6h，在麻醉状态下腹腔注射d-gal溶液(1.0g/kg)诱导急性肝功能衰竭。使用仿生生物人工肝对兔子进行插管治疗。
40.肝功能检测：当天取出的新鲜血液处理后立即送南京大学附属鼓楼医院医学检验科进行血清alt、ast检测，并使用alb、尿素含量测定试剂盒进行alb、尿素含量检测。
41.2)结果
42.图4a展示了组装好的，用于alf兔血浆过滤的仿生生物人工肝，图4b是过滤血浆处理前的alf兔的情况，图4c是过滤血浆处理后alf兔的情况，图4d展示了alf兔使用仿生生物人工肝治疗前后alt的变化，图4e是alf兔使用仿生生物人工肝治疗前后ast变化，图4f是alf兔使用仿生生物人工肝治疗前后尿素变化，图4g是alf兔使用仿生生物人工肝治疗前后alb变化。
43.经过仿生生物人工肝治疗后兔子反应迟缓、嗜睡等情况有所缓解，恢复了一定的活力，证明了其治疗有效；alf组的兔子alt、ast水平异常增高，表明肝功能收到了损害，在经过仿生生物人工肝治疗后，其alt、asl水平仍高于正常值，但较alf组有明显下降，通过白蛋白及尿素含量的检测结果同样验证了这一结论。
44.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。