脂肪间充质干细胞在制备治疗膝骨关节炎药物或制剂中的用途的制作方法

1.本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞在制备治疗膝骨关节炎药物或制剂中的用途。


背景技术：

2.膝骨关节炎主要指膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis，koa)，是一种以膝关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特征的慢性关节炎疾病，随着时间推移，膝关节炎症状将会逐渐加重，逐渐出现膝关节疼痛、肿胀、僵硬、畸形等，长期的膝关节疼痛与活动受限，对患者生活质量造成巨大的影响，并给家庭和社会带来巨大经济负担。
3.基于我国大型流行病学数据，指出我国koa患病率存在性别、地域和区域差异；症状性koa在我国的患病率为8.1％，koa发病率明显高于髋骨关节炎。从地域分布特征来看，西南和西北地区比华北和东部沿海地区患病率增加近一倍；区域分布差异显示症状性koa农村地区患病率高于城市地区；45岁以下人群患病率较低，为1％～4％。65岁以上人群患病率约为50％，70岁以上人群患病率高达80％。对于轻型患者，男女发病无明显差别，对于60岁以上重型患者，女性病发率高于男性。
4.koa病因和发病机制尚不明确，目前认为其发病与患者年龄、肥胖、炎症、创伤与遗传因素等有关，其特征是膝骨关节软骨原发性或继发性退行性变及骨质增生。原发性膝关节炎的发病原因尚不明确，在已知的致病因素中，高龄和超重是已经明确的两个主要治病因素，一般认为原发性膝骨关节炎是由全身或局部综合因素所致，如软骨营养和代谢失常、应力不平衡、累积的微小创伤或关节负荷过重等。继发性膝关节炎一般是在原发疾病基础上发生的继发性改变。常见病因包括：先天性关节畸形、关节面不平整、损伤、机械磨损、代谢性疾病、关节不稳定、感染等。
5.目前，koa还没有精确的诊断标准，医生主要基于患者的病史、症状，以及实验室和影像学手段进行评估。koa需与其他类型关节炎(化脓性关节炎、强制性脊柱炎、急性风湿热、类风湿关节炎)进行鉴别。一般根据患者症状、体征及影像学检查进行鉴别诊断。koa治疗手段主要有物理治疗、药物治疗、手术治疗三种方式。物理疗法多适用于koa的慢性期，可选用多种理疗形式，包括热敷、电疗、磁疗、红外线、水疗、矿泉浴、泥疗、蜡疗及离子透入法等方式。药物治疗包括各类镇痛药如非甾体抗炎药、弱阿片类药物、阿片类药物、神经病理痛药物、激素类药物如糖皮质激素、玻璃酸钠、医用臭氧以及中医中药等。
6.目前，koa的治疗以减轻疼痛、维持关节活动度、最大限度地减少残疾的发生为主，但难以恢复正常的软骨结构和功能，至病情难以控制时则需进行膝关节置换术手术治疗。膝关节置换术手术一般应用于koa中晚期，包括关节镜手术、胫骨高位截骨、单髁置换术、全膝关节置换术(total knee replacement， tka)等。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的新用途，主要用于在治疗膝骨关节炎的药物或制剂的制备。该脂肪间充质干细胞能够刺激受损关节组织，增加软骨厚度和软骨细胞数量，改善关节病理变化，发挥软骨基质保护作用，实现局部修复和再生，用于治疗膝骨关节炎，来解决现有技术中采用手术治疗也无法使软骨结构恢复正常功能的技术问题。
8.本发明通过以下技术方案实现：
9.一种脂肪间充质干细胞在制备治疗膝骨关节炎药物或制剂中的用途。
10.作为优选地，所述药物或制剂中主要活性成分为所述的脂肪间充质干细胞。
11.作为优选地，所述药物或制剂中脂肪间充质干细胞采用单独使用或与其他药物混合使用的方式。
12.作为优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
13.作为优选地，所述其他药物为镇痛类药物，所述镇痛类药物包括非甾体抗炎药、弱阿片类药物、阿片类药物、神经病理痛药物和激素类药物中的一种或多种。
14.作为优选地，所述脂肪间充质干细胞的制备方法为：
15.在离体的脂肪组织中加入pbs/生理盐水进行清洗；清洗后的脂肪组织加入消化酶进行消化，离心，即可获得脂肪间充质干细胞。
16.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
17.本发明提供了一种脂肪间充质干细胞在制备药物或制剂中的新用途，主要是用于在制备治疗膝骨关节炎药物或制剂中。
18.该脂肪间充质干细胞主要是能够刺激受损关节组织，促进成软骨化，增加软骨厚度和软骨细胞数量，改善关节病理变化，发挥软骨基质保护作用，实现局部修复和再生，用于治疗膝骨关节炎，并减少炎症和相关疼痛。
附图说明
19.图1为本发明的实验例5的x射线拍摄兔患肢关节的正侧位片的关节间隙变化示意图；
20.图2为本发明的实验例5的x射线拍摄兔患肢关节的正侧位片的胫骨骨赘形成情况示意图；
21.图3为本发明的实验例5的x射线拍摄兔患肢关节的正侧位片的股骨内侧髁骨赘形成情况示意图；
22.图4为本发明的实验例5的x射线拍摄兔患肢关节的正侧位片的腓肠豆骨骨赘形成情况示意图；
23.图5为本发明的实验例5的x射线膝关节评分影响示意柱状图；
24.图6为本发明的实验例5的x射线膝关节评分各分组的影响示意图；
25.图7为本发明的实验例6的体视显微镜观察兔膝关节标本pelletier评分情况示意图；
26.图8为本发明的实验例6的体视显微镜观察兔膝关节标本pelletier评分影响示意柱状图；
27.图9为本发明的实验例7的膝关节病理检查测量示意图；
28.图10为本发明的实验例7的软骨厚度测量示意图；
29.图11为本发明的实验例7的he病理组织学染色结果示意图。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
31.本发明的技术方案为：
32.一种脂肪间充质干细胞在制备治疗膝骨关节炎药物或制剂中的用途。
33.作为优选地，所述药物或制剂中主要活性成分为权利要求1所述的脂肪间充质干细胞。
34.作为优选地，所述药物或制剂中脂肪间充质干细胞采用单独使用或与其他药物混合使用的方式。
35.作为优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
36.作为优选地，所述其他药物为镇痛类药物，所述镇痛类药物包括非甾体抗炎药、弱阿片类药物、阿片类药物、神经病理痛药物和激素类药物中的一种或多种。
37.作为优选地，所述脂肪间充质干细胞的制备方法为：
38.在离体的脂肪组织中加入pbs/生理盐水进行清洗；清洗后的脂肪组织加入消化酶进行消化，离心，即可获得脂肪间充质干细胞。
39.本发明的一种具体实施方式是为了提供一种脂肪间充质干细胞在治疗膝骨关节炎中的用途。脂肪间充质干细胞，是一类来源于脂肪组织的多能成体干细胞，它起源于中胚层。具有脂肪组织来源广泛、取材容易、便于自体和异体移植等优势。脂肪间充质干细胞具有成骨、成脂肪及成软骨分化能力。在体外培养时贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，呈梭型紧密排列的间充质干细胞形态。细胞表面标志物cd44、cd73、cd90、cd105的阳性率均不低于95.0％，cd34、 cd45、cd19、hla-dr的阳性率不高于2.0％。
40.一种具体的实施方式中，提供了一种从脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
41.(1)在离体的脂肪组织中加入pbs/生理盐水进行清洗；
42.(2)清洗后的脂肪组织加入消化酶进行消化，离心，即可获得脂肪间充质干细胞；
43.所述的脂肪间充质干细胞可以来源于人类，也可以是动物为牛、马、羊、猴子、狗、大鼠、小鼠、兔子。可从脂肪组织分离脂肪，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，离心去除残留血液。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的组织分开。使用任何常规技术或方法从人脂肪组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力(离心)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。
44.一种具体的实施方式中，离体脂肪组织，通过离心、消化得到脂肪间充质干细胞。
45.一种具体的实施方式中，可对步骤2中获得脂肪间充质干细胞继续培养，优选的培养条件为：以1
×
10
6-1
×
108个细胞/平板的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培
养箱中培养，待脂肪间充质干细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。
46.本发明对活性细胞群体浓缩富集方法没有限制。细胞清洗/浓缩步骤可以单独或同时实施。可以对细胞清洗/浓缩后进一步纯化/富集，从而减少杂细胞和死细胞。可以采用浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(facs)或其它技术分离悬浮液中的细胞。
47.上述使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括dmem培养基和mem培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括egf(表皮生长因子)、 bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)等，可以加入一种或者两者都加入。对添加的时间和方法没有限制。
48.上述可以采用任意适合的方法将脂肪间充质干细胞给予患者，例如关节腔局部给药或者联合给药等。通常这些细胞是包含在药学上可接受的液体培养基中。细胞给予可以重复或连续进行。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少 6-9天分别使用。
49.脂肪间充质干细胞的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。通常，每次给予的剂量范围为大约10
3-108细胞，典型的是大约10
3-106细胞。
50.一种具体的实施方式中，将人源脂肪间充质干细胞与一种或多种药物一起施用给患者，所述的药物选自各类镇痛药如非甾体抗炎药、弱阿片类药物、阿片类药物、神经病理痛药物、激素类药物如糖皮质激素、玻璃酸钠、医用臭氧以及中医中药等中一种或其组合。
51.实验例1：细胞分离及培养
52.1、脂肪组织采集
53.采用吸脂手术，采集脂肪，脂肪组织的无菌采集瓶应密封。
54.2、分离操作
55.(1)吸取脂肪组织，加入等体积的生理盐水混匀，离心。
56.(2)加入等体积的胶原酶，混匀后于37℃，混匀消化30-60分钟。
57.(3)离心，去除上层的油脂，重悬沉淀，将消化后的脂肪组织液经过滤，收集滤液。
58.(4)滤液补加生理盐水，离心。
59.(5)每个培养瓶加液原则为1ml细胞悬液加24ml完全培养基。
60.(6)放入37℃，在含有5％二氧化碳的二氧化碳培养箱中培养。
61.(7)48小时后更换培养基，吸出悬浮的死细胞或细胞碎片，然后加入生理盐水洗涤细胞一次，换液。
62.3、间充质干细胞传代操作
63.(1)细胞达到80％-90％的融合度时，即可进行传代。根据细胞计数结果调整细胞浓度进行传代。
64.(2)吸出培养基上清，然后用生理盐水洗涤细胞一遍，每个培养瓶中加入2-3ml温和消化酶，室温消化2-5分钟，显微镜下观察细胞形态，拍打培养瓶，细胞间粘连断开，细胞皱缩变圆，加入完全培养基终止消化。
65.(3)用移液管轻轻吹打细胞使其脱落，收集细胞悬液至离心管中，调整细胞悬液体积，室温离心。
66.(4)离心完成后，去上清，用1-2ml生理盐水重悬细胞沉淀一次，轻轻吹打，其余细
胞悬液补加生理盐水至，室温离心。
67.(5)离心完成后，去上清，加入1-2ml完全培养基重悬细胞，按照传代比例稀释细胞悬液，每个培养瓶先加培养基24ml，再加入1ml细胞悬液，轻摇混匀，转入37℃，在含有5％二氧化碳的二氧化碳培养箱中培养。
68.4、间充质干细胞冻存
69.(1)细胞状态良好，达到80％-90％的融合度时，即可进行冻存。
70.(2)吸除上清液，然后用生理盐水洗涤细胞一遍，每个培养瓶中加入2-4ml 温和消化酶，室温消化5-10分钟，拍打培养瓶，显微镜下观察细胞形态，当细胞间粘连断开，细胞皱缩变圆，即可加入等体积培养基终止消化。
71.(3)用移液管轻轻吹打细胞使其脱落，收集细胞悬液至离心管中，调整细胞悬液体积，室温离心。
72.(4)离心完成后，去上清，用1-2ml生理盐水重悬细胞沉淀一次，轻轻吹打，其余细胞悬液补加生理盐水，室温离心。
73.(5)离心完成后，用2ml生理盐水重悬细胞沉淀一次，轻轻吹打，根据细胞计数结果，加入脂肪干细胞冻存液。充分混匀细胞，每支细胞冻存管加入 1ml细胞悬液。
74.(6)细胞放入程序降温仪，执行对应程序。放入液氮罐气相中长期保存。
75.实验例2：兔膝骨关节炎hulth模型的建立
76.经舒泰(4.5mg/kg)肌肉注射对兔进行全身麻醉，无菌条件下行单侧膝内侧髌骨旁切口，仔细解剖内侧副韧带，切断并切除内侧副韧带长约0.5cm；打开关节腔，切除内侧半月板。行抽屉试验确认前交叉韧带已完全断裂，生理盐水冲洗后复位髌骨，缝合关节囊和皮肤。对照组兔每只在上述相同条件下切开皮肤和关节腔，不做韧带和半月板切除，然后缝合关节腔和皮肤。术后各组每只兔肌注40万单位青霉素，连续3天，防止膝关节感染。
77.实验例3：实验分组
78.造模10周后，将模型动物随机分为对照组(一侧正常，另一侧关节假手术对照)、模型组、hadscs单次治疗组(4
×
105，2
×
106，1
×
107个细胞)、hadscs 多次治疗组(1
×
107个细胞)、兔源adscs组(1
×
107个细胞，radscs)、玻璃酸钠组(hyaluronate，ha，10mg/只)。
79.模型建立后(术后10周左右)x线观察oa成模情况，以可见明显关节肿胀、骨赘形成、关节腔狭窄为成模标准。将模型动物随机分成上述各组，每组 7-9只，关节腔单次或多次注射给药，给药容量为0.8ml/只。给药后第6周处死动物。
80.实验例4：一般临床观察
81.实验操作：
82.观察动物：全部动物；
83.观察时间与频率：造模期及给药开始后，每周观察动物一般状态；
84.实验结果分析：
85.膝关节hulth模型手术后，模型兔关节显著肿胀，3-5天后伤口愈合良好，并逐渐肿胀消退，手术侧后肢有明显触痛感，运动不便。2-3周后手术侧后肢膝关节肿胀不明显。对照组3-5天后伤口即愈合，无明显肿胀。各组动物生长良好，动物体重未见组间差异。给药后，各组动物均未见明显的局部和全身反应。
86.实验例5：x线检测
87.实验操作：如图1-4所示，x线拍摄兔患肢关节的正侧位片，从关节周围软组织、关节间隙、关节面的变化及有无骨赘形成来观察两侧膝关节的变化，进行影像学评分以确定成模情况。给药结束后，处死动物取手术侧膝关节，行 x线检查，观察动物关节间隙变化(0-2分)、胫骨骨赘形成情况(0-3分)、股骨内侧髁骨赘形成情况(0-3分)、腓肠豆骨骨赘形成情况(0-1分)，每只动物评分最高为9分。
88.实验结果分析：
89.给药结束后取动物给药侧膝关节行x射线检查，并按照前述分级标准进行评分。如图5和6结果显示，与对照组比较，模型兔关节腔大小明显变窄、可见明显的胫骨、股骨内侧髁及腓肠豆骨骨赘的形成。各给药组可一定程度降低膝关节x线评分，但差异无显著性。
90.实验例6：兔膝关节pelletier评分
91.实验操作：
92.给药结束处死动物后取膝关节标本，包括股骨髁和胫骨平台。肉眼观察有无关节积液和滑膜增生。在手术显微镜下观察大体标本股骨内、外髁及胫骨内、外侧平台软骨表面退变情况，按pelletier大体评分标准进行评分：0分，关节面完整，色泽如常；1分，关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分，关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表层或中层；3分，关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分，软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
93.实验结果分析：
94.如图7和8结果显示，处死动物后取兔膝关节标本，包括股骨髁和胫骨平台。体视显微镜观察发现，模型组动物关节面糜烂，关节液增多，软骨颜色灰暗，部分软骨缺损深达软骨深层，未见软骨剥脱。hadscs高剂量组(10.0
×
106个细胞)及多次给药组(hadscs-多次)可显著降低pelletier评分。
95.实验例7：免疫组化检查
96.实验操作：
97.取股骨内髁关节面，用体积分数10％的甲醛溶液固定48h，快速脱钙液脱钙2天，石蜡纵向包埋。将股骨内髁关节面标本纵向平分为4个区域，取中间 2个区域的软骨组织制作5mm厚切片。切片经逐级脱蜡、脱水，he染色。病理学评分标准根据mankin’s评分对关节软骨退变进行评分，评分标准如下：
①
结构：正常0分；表面不规则1分；血管翳形成，并且表面规则2分，深达移行层的裂隙3分，深达放射层的裂隙4分，深达钙化层的裂隙5分，结构完全紊乱6分；
②
细胞：正常0分，细胞弥漫性增生1分，细胞群集2分，细胞减少3分；
③
潮标：完整0分，血管通过1分。
98.如图9和10所示，软骨厚度的测量：将软骨厚度定义为从软骨表面到钙化软骨与软骨下骨交界线的距离，测量切片中软骨退变最为严重的部分(即软骨厚度最薄的部分)。
99.实验结果分析：
100.如图11所示，he病理组织学染色结果及病理评分，对照组兔关节骨组织正常，软骨细胞分布均匀，排列规律整齐，4层结构清晰可见，潮线完整平滑。模型组兔软骨边缘部分缺损，软骨细胞减少、皱缩，炎性细胞增多，软骨细胞排列紊乱，成簇分布，部分可见滑膜浸润至软骨层和不规则裂隙，软骨层变薄，潮线中断或出现多重潮线。与模型组比较，hadscs(2.0
×
106，10.0
×
106)及多次给药可以降低oa兔膝关节病理总评分，减轻关节软骨退变状况，增加软骨层厚度，减少炎性细胞浸润，改善关节病理。阳性药ha组有类似作用。
101.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。