一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂及T3的应用的制作方法

一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂及t3的应用
技术领域
1.本发明涉及一种眼用制剂，尤其涉及一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂。


背景技术：

2.角膜位于眼球前端，是构成眼球壁外层的纤维层结构，其不仅具有屈光特性，而且具有典型的软组织生物力学特性。角膜基质层中的胶原纤维和蛋白聚糖决定了组织的弹性性能，基质层含有80％的水份，决定了角膜的黏性，故角膜具有黏弹性力学特性。
3.角膜生物力学特性不仅参与维持角膜形态，影响角膜手术，尤其是屈光手术的效果，还与部分角膜疾病的发生和发展以及青光眼等疾病的诊疗密切相关。圆锥角膜是常见的角膜生物力学性能退行性疾病，其胶原纤维排列紊乱，胶原溶解增加，胶原纤维之间交联减少，这些因素共同使得圆锥角膜的弹性模量低于健康角膜，生物力学稳定性下降。医源性角膜扩张、边缘性角膜变性、球形角膜等角膜病，其特征均为角膜变薄，生物力学性能下降，继发角膜膨隆，引起患者视力下降，甚至眼球破裂等严重并发症。因此，维持正常的角膜生物力学特性十分必要(王雁、宋一、牟博琨，角膜生物力学基础，中华眼科杂志，2021，57(2)：156-60)。
4.拉伸实验是常用的角膜生物力学离体测量方法。在一定的温度和湿度下，以一定加载速度施加拉伸载荷，记录受试物体变形，获得应力-应变曲线，并可计算弹性模量e、抗拉强度、断裂能等生物力学参数。人离体角膜拉伸实验已证实其应力-应变曲线呈非线弹性应力应变关系。材料抵抗弹性变形的能力常以弹性模量e表示，计算方法是应力-应变曲线的斜率，反映角膜的刚度。抗拉强度反映了材料的断裂抗力，是角膜在拉伸破裂点处承受的拉力。
5.核黄素在角膜胶原交联术中作为光敏剂，核黄素在一定时间的紫外线a的照射下将氧分子激发到三线态，其在回到单线态时产生有很强的氧化活性的氧自由基，使得胶原纤维的终端发生缩合反应，增加了胶原纤维之间的侧向连接，从而使角膜的机械强度得到了增强。
6.核黄素需与紫外线a照射结合发挥作用，是一种手术方式——角膜胶原交联术，对病人配合度要求高，且设备价格昂贵，成本较高，治疗方案并不十分便捷，且该方法仅能使角膜前部基质胶原得以交联，故临床有效性受限。
7.有学者将短链无环硝基乙醇、京尼平(tang y,song w,qiao j,rong b,wu y,yan x.a study of corneal structure and biomechanical properties after collagen crosslinking with genipin in rabbit corneas.mol vis.2019；25:574-82.epub 20191006.pubmed pmid:31673223；pubmed central pmcid:pmcpmc6798704)、转谷氨酰胺酶(wu y,song w,tang y,elsheikh a,shao y,yan x.efficacy and safety of transglutaminase-induced corneal stiffening in rabbits.transl vis sci technol.2019；8(6):27.epub 20191212.doi:10.1167/tvst.8.6.27.pubmed pmid:
31853423；pubmed central pmcid:pmcpmc6908136)用于动物角膜的交联以加强角膜生物力学特性。但是，短链无环硝基乙醇、京尼平、转谷氨酰胺酶等药物安全性及有效性存疑，尚在实验探索阶段。
8.因此，亟待开发可以用于加强角膜生物力学性质的新型眼用制剂，以弥补现有技术中的不足。
9.三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,t3)是甲状腺合成的物质之一。t3的已上市人工合成药品(碘塞罗宁)常用于治疗严重缺乏甲状腺素而引起的粘液性水肿病，还可作为甲状腺功能诊断药。现有研究表明，t3增加大鼠软骨基质的形成和软骨细胞胶原蛋白的表达，增加了碱性磷酸酶的活性；对股骨的软骨细胞培养显示，t3增加了骨细胞4倍的压缩模量和3.1倍的拉伸模量(jia pt,zhang xl,zuo hn,lu x,gai pz.astudy on role of triiodothyronine(t3)hormone on the improvement of articular cartilage surface architecture.exp toxicol pathol.2017；69(8):625-9.epub 20170608.doi:10.1016/j.etp.2017.05.010.pubmed pmid:28602390)。
10.目前，t3在眼部用药中的应用很少，有一种用于治疗老年性白内障的甲状腺素碘塞罗宁滴眼液(授权公告号：cn100379403c)，其成分是甲状腺提取物，即t3和t4的混合物，但并不清楚具体发挥作用的成分。除此之外，尚未发现t3在眼部用药中的其他应用。并且，关于t3对角膜生物力学的作用，尚未开展相关研究工作。虽然有文献公开了三碘甲状腺原氨酸在促进角膜神经发育中的应用(mansi patel等，unique and overlapping effects of triiodothyronine(t3)and thyroxine(t4)on sensory innervation of the chick cornea，experimental eye research，194(2020),1-12)，但是没有公开t3在增强角膜生物力学性质中的应用。


技术实现要素：

11.针对现有技术中存在的问题，本发明人进行了大量的研究工作，结果惊异地发现三碘甲状腺原氨酸(t3)可以显著加强角膜生物力学性质，基于此，本发明的目的在于提供一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂，其包含三碘甲状腺原氨酸(t3)，具有更为安全稳定、有效、对眼部无伤害或伤害较小、低成本、操作便捷中的至少一个优点，因此可以有效地克服现有技术中的不足。
12.本发明的另一目的在于提供t3在制备用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂中的应用。
13.本发明的还一目的在于提供一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂的制备方法。
14.根据本发明的目的，本发明提供了一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂，其仅包含三碘甲状腺原氨酸(t3)以及药剂学上可接受的辅料。即，本发明的眼用制剂中包含的活性成分仅为t3，而不包含t4等其它活性成分。
15.在本发明中，所述眼用制剂可以为溶液制剂，也可以为凝胶剂、软膏剂、固体制剂+溶剂等不同形式，优选为溶液制剂，通常可以称为滴眼液或眼用滴剂。固体制剂+溶剂为诸如t3粉末的固体制剂与溶剂的组合制剂，固体制剂与溶剂分别独立包装，在使用前加以混合。在溶液制剂中，三碘甲状腺原氨酸的浓度需要在能够达到药效的范围内，可以为0.5～
1.5mg/ml，优选为0.8～1.2mg/ml。
16.本发明的t3眼用制剂可以通过点眼的方式直接作用于角膜，与核黄素治疗方法相比，更为安全稳定、有效、对眼部无伤害或伤害较小、低成本、操作便捷。
17.在本发明中，优选地，所述药剂学上可接受的辅料为选自渗透压调节剂、防腐剂、助溶剂、ph调节剂中的一种或多种。
18.所述渗透压调节剂、防腐剂、助溶剂、ph调节剂可以根据t3的溶解性等理化性质，从眼用制剂的常规辅料中加以选择。例如，所述渗透压调节剂可以选自氯化钠、葡萄糖，所述防腐剂可以选自硫柳汞钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵、三氯叔丁醇；所述助溶剂可以选自吐温-80、吐温-20等；所述ph调节剂可以选自氢氧化钠、盐酸等。
19.在本发明中，优选地，所述眼用制剂中的三碘甲状腺原氨酸浓度为1mg/ml。
20.在本发明中，优选地，所述眼用制剂为3ml/支，组成为：
[0021][0022][0023]
根据本发明的另一目的，本发明提供了t3在制备用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂中的应用。
[0024]
在本发明中，所述t3眼用制剂可以用于加强角膜生物力学性质，从而可以用于预防或治疗角膜生物力学性能退行性疾病，该疾病包括圆锥角膜、医源性角膜扩张、边缘性角膜变性、球形角膜等角膜病变。
[0025]
根据本发明的还一目的，本发明提供了一种用于加强角膜生物力学性质的眼用制剂的制备方法，其包括以下步骤：将三碘甲状腺原氨酸粉剂与药剂学上可接受的辅料混合，制成眼用制剂。所述三碘甲状腺原氨酸粉剂的纯度优选为99％以上，例如99.35％。
[0026]
在本发明中，优选地，所述制备方法包括以下步骤：
[0027]
1)取注射用水10ml，溶解0.2gph调节剂，再加入0.3g的三碘甲状腺原氨酸粉剂，加水至200ml；
[0028]
2)加入渗透压调节剂、助溶剂、防腐剂，边搅拌，边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0029]
3)灌装成3ml/支，得到规格为3ml：3mg的眼用制剂。
[0030]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031]
(1)本发明首次发现t3可以显著加强角膜生物力学性质，从而研制出t3眼用制剂；
[0032]
(2)本发明的t3眼用制剂与核黄素治疗方法相比，更为安全稳定、有效、对眼部无伤害或伤害较小、低成本、操作便捷；
[0033]
(3)本发明的t3眼用制剂的制备方法简单易行，便于进行工业化批量生产。
附图说明
[0034]
图1为t3处理后的人角膜基质细胞的qpcr基因表达结果；
[0035]
图2为t3处理后小鼠角膜细胞的qpcr基因表达结果；
[0036]
图3为t3处理组(右眼，od)与对照组(左眼，os)的拉伸应力应变曲线；
[0037]
图4为对照组(左)与实验组(右)的胶原纤维横切面；
[0038]
图5为对照组(左)与实验组(右)的胶原纤维纵切面。
具体实施方式
[0039]
本发明的t3眼用制剂的配方组成是本发明人经过大量筛选优化得到的，并且，本发明人通过大量的细胞实验和动物实验，充分验证此眼用制剂在提高角膜生物力学性能方面的有效性。
[0040]
本发明人通过大量实验，发现通过直接使用t3滴剂进行滴眼而非本领域常规的滴加核黄素进行紫外线a照射方式，可有效地使人角膜基质细胞产生更多胶原(col1)，细胞骨架蛋白(vimentin)和基质金属蛋白酶抑制物(timp)表达增加，在细胞水平显著提高角膜的生物力学特性。
[0041]
本发明人通过大量实验，发现通过使用t3滴剂进行滴眼，可有效地使c57小鼠角膜的抗拉强度和弹性模量显著提高，在组织水平验证了t3加强角膜生物力学的作用。
[0042]
在本发明的优选实施方式中，本发明的t3眼用滴剂的规格为3ml：3mg，配方组成和制备工艺如下：
[0043]
1、配方：
[0044] 每100支用量(3ml/支)t3300mg渗透压调节剂(氯化钠/葡萄糖)1.2-3g防腐剂(硫柳汞钠/苯扎氯铵/苯扎溴铵/三氯叔丁醇)50-500mg助溶剂(吐温-80/吐温-20)100-200μlph调节剂(氢氧化钠/盐酸)200mg注射用水加至300ml
[0045]
2、工艺：
[0046]
(1)注射用水10ml，溶解0.2gph调节剂，再加入0.3g的t3，加水至200ml；
[0047]
(2)加入渗透压调节剂、助溶剂、防腐剂，边搅拌边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0048]
(3)灌装，3ml/支。
[0049]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050]
实施例1 t3眼用滴剂的制备
[0051]
t3眼用滴剂的配方组成和工艺如下：
[0052]
(一)配方：
[0053] 每100支用量(3ml/支)t3300mg渗透压调节剂(氯化钠)3g防腐剂(硫柳汞钠)60mg助溶剂(吐温-80)200μl氢氧化钠200mg注射用水加至300ml
[0054]
(二)工艺：
[0055]
1、注射用水10ml，溶解0.2g氢氧化钠，再加入0.3g的t3，加水至200ml；
[0056]
2、加入氯化钠、吐温-80、硫柳汞钠，边搅拌边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0057]
3、灌装，3ml/支。
[0058]
规格为：3ml：3mg三碘甲状腺原氨酸。
[0059]
实施例2 t3眼用滴剂的制备
[0060]
t3眼用滴剂的配方组成和工艺如下：
[0061]
(一)配方：
[0062] 每100支用量(3ml/支)t3300mg渗透压调节剂(葡萄糖)2g防腐剂(苯扎氯铵)100mg助溶剂(吐温-80)300μl氢氧化钠200mg注射用水加至300ml
[0063]
(二)工艺：
[0064]
1、注射用水10ml，溶解0.2g氢氧化钠，再加入0.3g的t3，加水至200ml；
[0065]
2、加入葡萄糖、吐温-80、苯扎氯铵，边搅拌边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0066]
3、灌装，3ml/支。
[0067]
规格为：3ml：3mg三碘甲状腺原氨酸。
[0068]
实施例3 t3眼用滴剂的制备
[0069]
t3眼用滴剂的配方组成和工艺如下：
[0070]
(一)配方：
[0071] 每100支用量(3ml/支)t3300mg渗透压调节剂(氯化钠)2g防腐剂(三氯叔丁醇)80mg助溶剂(吐温-20)300μl
氢氧化钠200mg注射用水加至300ml
[0072]
(二)工艺：
[0073]
1、注射用水10ml，溶解0.2g氢氧化钠，再加入0.3g的t3，加水至200ml；
[0074]
2、加入氯化钠、吐温-20、三氯叔丁醇，边搅拌边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0075]
3、灌装，3ml/支。
[0076]
规格为：3ml：3mg三碘甲状腺原氨酸。
[0077]
实施例4 t3眼用滴剂的制备
[0078]
t3眼用滴剂的配方组成和工艺如下：
[0079]
(一)配方：
[0080] 每100支用量(3ml/支)t3300mg渗透压调节剂(葡萄糖)2g防腐剂(苯扎溴铵)100mg助溶剂(吐温-80)150μl氢氧化钠200mg注射用水加至300ml
[0081]
(二)工艺：
[0082]
1、注射用水10ml，溶解0.2g氢氧化钠，再加入0.3g的t3，加水至200ml；
[0083]
2、加入葡萄糖、吐温-80、苯扎溴铵，边搅拌边加水至300ml，直至全部溶解，滤过除菌；
[0084]
3、灌装，3ml/支。
[0085]
规格为：3ml：3mg三碘甲状腺原氨酸。
[0086]
以下实验例中，实验例1是细胞水平的实验，因此采用的t3滴剂是将实施例1的眼用滴剂的浓度稀释至1/5000；实验例2、3、4是直接滴眼，因此采用的t3滴剂是由实施例1直接得到。
[0087]
实验例1 t3眼用滴剂的细胞药效学实验——基因水平
[0088]
实验方法包括以下两个步骤：
[0089]
步骤1：取人角膜基质透镜(来源于天津市眼科医院)并原代提取角膜细胞，用dmem完全培养基培养至第四代，换为无血清培养基培养，后分组处理：实验组细胞约5
×
106个，加入t3(至t3浓度为3.3
×
10-7
m)至培养基来刺激细胞；对照组细胞约5
×
106个，无特殊处理。24小时后分别将两组细胞消化成细胞悬浮液。
[0090]
步骤2：用trizol法进行两组细胞的rna提取，测试rna样品浓度，按试剂盒逆转录cdna，用胶原蛋白(col1)、细胞骨架蛋白(vimentin)和基质金属蛋白酶抑制物(timp)等基因的引物进行qpcr(实时荧光定量pcr)。
[0091]
实验结果如图1所示，图1为t3处理后的人角膜基质细胞(test)与对照组(con)的qpcr基因表达结果。结果表明，通过使用混合了t3滴剂的培养基培养人角膜基质细胞，与普通培养基培养相比，能够有效地使人角膜基质细胞的胶原蛋白(col1)、细胞骨架蛋白
(vimentin)和基质金属蛋白酶抑制物(timp)表达增加，显著提高生物力学特性相关基因的表达。
[0092]
实验例2 t3眼用滴剂的动物药效学实验——基因水平
[0093]
实验方法包括以下两个步骤：
[0094]
步骤1：20只c57小鼠的右眼作为实验组，点药1月(实施例1的眼用滴剂，1次/日)，左眼作为对照组，无特殊处理。
[0095]
步骤2：1月后处死小鼠，分别取小鼠双眼角膜，trizol法进行两组细胞的rna提取，测试rna样品浓度，按试剂盒逆转录cdna，用胶原蛋白(col1)、细胞骨架蛋白(vimentin)和基质金属蛋白酶抑制物(timp)等基因的引物进行qpcr。
[0096]
实验结果如图2所示，图2为t3滴剂点眼处理1月后的小鼠角膜细胞(test)与对照组(con)的qpcr基因表达结果。结果表明，通过直接使用t3滴剂进行滴眼，与对侧无处理的对照眼相比，可有效地使小鼠角膜细胞的胶原(col1)、细胞骨架蛋白(vimentin)和基质金属蛋白酶抑制物(timp)表达增加，在细胞水平显著提高生物力学特性相关基因的表达。
[0097]
实验例3 t3眼用滴剂的动物药效学实验——组织水平
[0098]
实验方法包括以下两个步骤：
[0099]
步骤1：20只c57小鼠的右眼作为实验组，点药1月(实施例1眼用滴剂，1次/日)，左眼作为对照组，无特殊处理。
[0100]
步骤2：1月后处死小鼠，分别取小鼠左、右眼角膜进行单轴拉伸实验。
[0101]
实验结果如表1及图3所示。表1为不同应力应变条件下同一小鼠的右眼(实验组)和小鼠的左眼(空白对照组)的弹性模量e(mpa)的对比列表，图3为实验组与对照组的拉伸应力应变曲线，由图3可见，t3滴剂进行滴眼后，角膜的抗拉强度(曲线最高点的应力)及弹性模量均较对照显著增强。结果表明，通过使用t3滴剂进行滴眼，可有效地使c57小鼠角膜的抗拉强度和弹性模量显著提高，在组织水平验证了t3加强角膜生物力学的作用。
[0102]
表1不同应力应变条件下小鼠右眼(实验组)和左眼(对照组)的弹性模量e(mpa)
[0103][0104][0105]
实验例4 t3眼用滴剂的动物药效学实验——组织水平
[0106]
实验方法包括以下两个步骤：
[0107]
步骤1：20只c57小鼠的右眼作为实验组，点药1月(实施例1眼用滴剂，1次/日)，左眼作为对照组，无特殊处理。
[0108]
步骤2：1月后处死小鼠，分别取小鼠左、右眼角膜进行透射电镜样本制作：固定、脱水、浸透、包埋、修块、半薄切片定位、制作超薄切片、染色、拍照。
[0109]
实验结果如图4、图5所示。图4为小鼠左眼，即空白对照组(左图)与右眼，即t3处理的实验组(右图)的胶原纤维横切面对比，图5为小鼠左眼，即空白对照组(左图)与右眼，即t3处理的实验组(右图)的胶原纤维纵切面对比，可见t3滴剂进行滴眼后角膜的胶原纤维密度较对照组显著增加。结果表明，通过使用t3滴剂进行滴眼，可有效地使c57小鼠角膜的胶原纤维增粗且密度增加，在组织水平验证了t3加强角膜生物力学的作用。
[0110]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围
之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。