一种洋金花抗银屑病提取物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到一种洋金花抗银屑病提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.银屑病是一种慢性、炎症性、易复发、甚至需要终生治疗的皮肤病。在国内患者人群较大。据不完全统计，全球约有1.25亿人受该病困扰，在中国约有650万患者深受其害。由于银屑病病因尚未明确，且社会对此疾病认知度较低，患者往往受到身体和心理的双重负担。银屑病患者皮损处通常会奇痒难忍，以红斑鳞屑为主，相当多的患者更是需要终身不能治愈。且随着年龄增长和天气气候的变化，有的患者病情会逐渐恶化，以致红斑鳞屑遍布全身各处，严重者甚至可诱发心血管疾病，及关节炎等合并症。它不仅对影响了患者的生活质量，而且还会引起严重的心理和社会问题。银屑病病理特征为皮肤角质细胞过度增殖和分化不全、真皮炎性细胞浸润、新生血管形成等。银屑病是严重影响了患者的身心健康和生活质量，是皮肤学研究领域的一个难题，迄今尚无治疗银屑病的特效药物。
3.洋金花是茄科植物白曼陀罗(datura metel l.)的干燥花，广泛分布于中国的江苏、广东、福建等地。洋金花药理作用较强，药用价值高，广泛用于治疗各种人类疾病，包括伤口、溃疡、炎症、风湿病和哮喘等。该中药有着悠久的历史，在中国早期的许多著作中都有提及，据传说早在公元200年，中国医术精湛的医生华托就曾在手术中对病人使用“麻药散”。据2020版《中国药典》记载其性味辛、温，有毒，归肺、肝经。具有平喘止咳，解痉定痛之效，孕妇、高血压及心动过速患者禁用。洋金花中化学成分复杂，包括生物碱类、黄酮类、醉茄内酯类、倍半萜类和酰胺类等化学成分。近年来，由于其药用价值，近年来对其化学成分和药理活性的研究越来越多，大多是关于莨菪烷类生物碱类成分和醉茄內酯类成分，而对其它成分的研究却是凤毛麟角。前期研究可确定洋金花治疗银屑病生物活性的物质基础主要是醉茄内酯组分(withanolides，wds)，没有关于黄酮组分(flavonoids，fds)治疗银屑病的报道。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种洋金花提取物的制备方法。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种洋金花提取物的制备方法，其特征在于：包括，
8.将洋金花用乙醇加热回流提取，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味；
9.将提取物用氨水碱化，静置一天后，过滤，滤液流经hpd950型大孔树脂，依次进行三次洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得有效提取物。
10.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述三次洗脱采用的溶剂分别为水、50％乙醇溶液、95％乙醇溶液，最后收集50％乙醇洗脱液。
11.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述乙醇加热回流提取为采用70％质量分数乙醇溶液加热回流提取三次，每次2小时。
12.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种洋金花提取物。
13.作为本发明所述洋金花提取物的一种优选方案，其中：所述提取物具有抗银屑病的功能。
14.作为本发明所述洋金花提取物的一种优选方案，其中：所述提取物的紫外光图谱特征为在250-280nm、330-360nm有最大吸收峰。
15.作为本发明所述洋金花提取物的一种优选方案，其中：所述提取物含有黄酮类组分。
16.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种洋金花提取物的应用。
17.为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：所述提取物在治疗皮肤病的医药制备领域的应用。
18.作为本发明所述洋金花提取物应用的一种优选方案，其中：所述洋金花提取物在治疗银屑病药物制备上的应用。
19.本发明有益效果：
20.本发明所述的洋金花提取物中的黄酮组分可改善小鼠银屑病样症状，减少小鼠表皮厚度，抑制角质细胞异常增殖，减轻炎症反应，表现出抗银屑病的功效，应用于皮肤病领域具有良好的产业化前景。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
22.图1为本发明实施例1中黄酮组分的提取分离流程图。
23.图2为本发明实施例2中黄酮组分对imq诱导的小鼠背部皮肤形态的影响图。
24.图3为本发明实施例2中(a-d)五组小鼠背部皮损处的红斑、浸润、鳞屑及pasi总评分图。
25.图4为本发明实施例2中黄酮组分对治疗6天后小鼠皮损处组织病理学变化的影响(a)空白对照组图；其中：(b)imq模型组；(c)黄酮组分高剂量组(fds 500mg/kg)；(d)黄酮组分低剂量组(fds 250mg/kg)；(e)阳性药对照组(mtx)。
26.图5为本发明实施例2中小鼠的表皮厚度图，表皮厚度以μm为测量单位，**p﹤0.01 vs imq模型组,***p﹤0.001 vs imq模型组。
27.图6为本发明实施例3中黄酮组分对治疗6天后小鼠皮损处ki67表达情况的影响图；其中：(a)空白对照组；(b)imq模型组；(c)黄酮组分高剂量组(fds500mg/kg)；(d)黄酮组
分低剂量组(fds250mg/kg)；(e)阳性药对照组(mtx)。
28.图7为本发明实施例3中ki67阳性细胞比例图,***p﹤0.001 vs imq模型组，###p﹤0.001vs空白对照组。
29.图8为本发明实施例4中黄酮组分对imq诱导的银屑病样小鼠皮损处相关炎症因子mrna表达情况的影响，*p﹤0.05 vs imq模型组，**p﹤0.01 vs imq模型组。
具体实施方式
30.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
31.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
32.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
33.本发明所用材料来源为：
34.hpd950型树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)；diamonsilc18色谱柱(5um，250x4.6mm)(北京迪马科技有限公司)；柱色谱用化学试剂(化学纯)，色谱级甲醇、色谱级乙腈和色谱级甲酸(美国fisher公司)；屈臣氏纯净水(中国广州屈臣氏食品饮料有限公司)；洋金花药材(海南省临高县)；primescripttmrt试剂盒货号：6215a，sybr premix ex taqtm
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试剂盒货号：6215b(宝生物工程有限公司)；trizol法总rna抽提试剂盒货号：r0016，苏木素伊红(he)染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
35.仪器：
36.2565-2998型分析hplc仪器(waters公司)，al204电子分析天平(梅特勒-托利多称重设备系统有限公司)，n-1300型旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)，倒置显微镜(日本olympus公司)，实时定量pcr系统(美国biotk公司)。
37.实施例1
38.将洋金花用70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味。将提取物用氨水碱化，静置24h后，过滤，滤液流经hpd950型大孔树脂，分别用水，50％乙醇，95％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩得有效部位，通过高效液相色谱分析显示色图谱中各成分的紫外光图谱特征为在250-280nm、330-360nm有最大吸收，此为洋金花中黄酮类化合物的紫外光谱特征吸收。
39.实施例2
40.药效验证
41.在动物水平上黄酮组分治疗银屑病的效果
42.先固定小鼠，将其背部毛发剃除干净，面积约为2cm
×
2cm，每日在小鼠裸露背部涂抹5％imq乳膏62.5mg，同时以甲氨蝶呤(mtx)(1mg/kg/d)灌胃作为阳性对照连续给药7天，每天观察局部皮肤变化，制备银屑病样动物模型。将50只20-25g的雌性balb/c小鼠称重并随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组(control)、imq模型组、阳性药对照组(mtx)、黄
酮组分高剂量组(fds 500mg/kg)和黄酮组分低剂量组(fds 250mg/kg)。
43.通过评估黄酮组分对银屑病小鼠皮损处形态的变化和银屑病皮损面积和疾病严重程度(pasi)评分，观察黄酮组分对银屑病样小鼠模型皮损处形态学的影响；通过he染色法观察黄酮组分对皮损处组织病理学和小鼠表皮厚度的影响；借助免疫组织化学法检测ki67考察黄酮组分对表皮角质细胞异常增殖的影响；采用rt-pcr法检测黄酮组分对小鼠皮肤裂解物中il-6、il-10、il-22和tnf-α等相关炎症因子表达的影响，以明确在动物水平上黄酮组分治疗银屑病的效果。
44.结果：
45.黄酮组分可明显减轻imq诱导的小鼠皮肤银屑病样症状
46.结果显示，治疗6天后小鼠背部皮肤形态学变化如图2所示，空白对照组小鼠背部皮肤呈玫瑰色光滑，皮下血管透明，无银屑病样症状。但与其他组相比，imq模型组小鼠背部皮肤有大块、层状的厚鳞片，皮肤浸润严重，还有明显的片状红斑。还有当鳞片脱落时，背部会出现针状的出血点，皮肤表皮明显变厚了。与imq模型组小鼠皮肤相比，阳性药对照组(mtx)、黄酮组分高剂量组(fds 500mg/kg)和黄酮组分低剂量组(fds 250mg/kg)小鼠背部皮肤症状明显改善，出现红斑少、颜色浅、鳞片少和皮肤表皮变薄等现象。而黄酮组分高剂量组(fds 500mg/kg)小鼠背部皮肤的改善效果优于黄酮组分低剂量组(fds 250mg/kg)，但是略差于阳性药对照组(mtx)。
47.通过pasi评分来评估前6天小鼠背部皮损处的红斑、鳞屑和浸润的评分情况。pasi评分的趋势线如图3所示。各组pasi评分随imq诱导逐渐升高。然而，与imq模型组相比，黄酮组分高低剂量组(fds 500mg/kg和250mg/kg)和阳性药对照组(mtx)的各项得分明显降低，黄酮组分高剂量组(fds 500mg/kg,)与阳性药对照组(mtx)之间无统计学差异，pasi评分的降低提示黄酮组分具有治疗银屑病的功能。
48.he染色结果如图4所示，imq模型组小鼠的病理变化主要为表皮角质层明显角化不全、棘皮增生、真皮深层突然向下延伸和炎症细胞向真皮浸润。镜检结果显示imq模型组小鼠背部皮损处的垂直表皮厚度约为空白对照组(control)的7倍，呈现显著性差异(p《0.001)。与imq模型组相比，黄酮组分高低剂量组(fds 500mg/kg和250mg/kg)小鼠则出现更少的银屑病样症状，炎症细胞浸润减少，角化不全减少，表皮厚度显著减少，其中黄酮组分高剂量组(fds 500mg/kg)与阳性药对照组(mtx)无显著性差异。综上所述，黄酮组分可明显缓解银屑病样症状，表明其可用于治疗银屑病。
49.实施例3
50.ki67是kcs增殖的标志，ki67的异常表达是银屑病的一个重要特征。免疫组织化学染色图中ki67阳性细胞呈棕色。如图6所示，与其他组小鼠皮肤相比，imq模型组小鼠皮肤里ki67阳性细胞最多，空白对照组与imq模型组之间存在显著性差异(p《0.001)。与imq模型组相比，而黄酮组分高低剂量组(fds 500mg/kg和250mg/kg)中ki67表达均显著性降低(p﹤0.001)，其中黄酮高剂量组(500mg/kg)与阳性药对照组(mtx)之间并无显著性差异。
51.实施例4
52.为了评估黄酮组分对imq诱导的银屑病样小鼠皮损处相关炎症因子表达的影响，通过rt-pcr试验检测了il-6、tnf-α、il-22和il-10的mrna表达情况。如图8所示，相对于imq模型组，黄酮组分高低剂量组(fds 500mg/kg和250mg/kg)中il-6、tnf-α和il-22mrna的表
达量显著性降低(p《0.01)，而il-10mrna的表达量显著性升高(p《0.01)，以上结果表明，黄酮组分可显著减少imq诱导的小鼠皮损处炎症反应，有抗银屑病的功效。
53.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。